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INTRODUCCIÓN
El agua es esencial para los procesos biológicos y el mantenimiento de los ecosistemas, por lo que es importante para los organismos vivos (Pichel y col., 2019). Son varios los factores que afectan la calidad del agua, siendo los más notables las actividades antropogénicas en los asentamientos urbanos, el aumento de la industrialización y la generación de desechos (Ji y col., 2021; OMS, 2022), que contribuyen a la presencia de agentes infecciosos, químicos tóxicos y radiaciones en el agua, de acuerdo al Diario Oficial de la Federación (DOF, 2015b). La contaminación del agua es un problema de salud púbica y su consumo puede causar enfermedades gastrointestinales que pueden llevar a la muerte, como gastroenteritis hemorrágica, cólera y diarrea aguda (Gutiérrez-Del-Río y col., 2018). Las bacterias coliformes causan estas enfermedades (Loyola y col., 2020).
Las infecciones diarreicas provocan alta morbilidad tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo, debido a su alta incidencia en la población de niños menores de 5 años y adultos mayores (Saxena y col., 2015; OMS, 2017). Este tipo de enfermedades representa, para ambos grupos de naciones, un alto costo económico a nivel de salud e impacto social (Kamal y Abdel-Latef, 2015; Sacchetti y col., 2015).
Las bacterias comúnmente consideradas agentes etiológicos de la diarrea aguda son los diferentes patotipos de Escherichia coli, Salmonella sp, Campylobacter sp, Yersinia sp, Vibrio cholerae y Enterococcus faecalis (Wu y col., 2011; DOF, 2015b; DOF, 2021).
También se han identificado otros géneros como patógenos oportunistas que causan diarrea en personas inmunocomprometidas, como Pseudomonas sp, Klebsiella sp y Aeromonas sp. Estas bacterias han sido aisladas del agua potable, de acuerdo con el Diario Oficial de la Federación (DOF, 2015b). Así mismo, Aeromonas es capaz de sobrevivir en agua que ha sido clorada, y su presencia se ha asociado con enfermedades gastrointestinales en humanos y animales (Skwor y col., 2014; Miyagi y col., 2017).
La patogenicidad de un microorganismo es la habilidad de causar daño a un hospedero (Madigan y col., 2015), una bacteria patógena emplea diferentes factores de virulencia para dañar y adaptarse contra los diferentes mecanismos de defensa del hospedero (Jurado-Martín y col., 2021). La formación de biopelícula confiere virulencia en bacterias patógenas oportunistas, ya que ayuda a la adhesión y a la colonización bacteriana, reduce la sensibilidad a los antibióticos y evita que el sistema inmunológico reconozca a la bacteria (Chenia y Duma, 2017). La multirresistencia es definida como la resistencia al menos a un antibiótico de tres o más familias diferentes, esto favorece a las bacterias patógenas para continuar con la infección en su hospedero (Madigan y col., 2015), sin ser eliminado aún con el suministro de antibióticos. Estas bacterias aumentan la morbilidad y la mortalidad en la población (Nath y col., 2020). La hemólisis es considerada un factor de virulencia, debido a que la bacteria produce y transporta proteínas y toxinas que destruyen al eritrocito, la hemoglobina y otras células (Madigan y col., 2015).
Aeromonas y Pseudomonas han sido descritas como bacterias multirresistentes a antibióticos y formadoras de biopelícula (Govender y col., 2021); algunas especies de estos géneros bacterianos se han reportado con capacidad hemolítica (Nowrotek y col., 2021). La biopelícula es una estructura constituida por exopolisacáridos y bacterias, que le otorga a la comunidad bacteriana protección ante el estrés ambiental (Sala-Comorera y col., 2016). En el caso de las bacterias patógenas, la biopelícula le confiere atributos para el establecimiento de la infección al hospedero, además, que es un ambiente idóneo que favorece la transferencia horizontal de genes que codifican la resistencia a antibióticos. La presencia de estas bacterias en el agua puede ser una fuente de diseminación de dichos genes de multirresistencia entre los miembros de la comunidad bacteriana (Mulamattathil y col., 2014).
Las Naciones Unidas se han encargado de generar políticas de prevención para reducir las enfermedades gastrointestinales provocadas por la contaminación del agua (Cerna-Cortes y col., 2019). La Organización Mundial de la Salud (OMS, 2022) es responsable de desarrollar estándares internacionales para cumplir con los requisitos que garantizan la calidad del agua y promover la salud de las poblaciones (DOF, 2015c; Pichel y col., 2019). En México, las Normas Oficiales Mexicanas establecidas por el gobierno federal, regulan el saneamiento del agua para consumo personal y doméstico. Estos lineamientos establecen y describen los límites permisibles de los indicadores bacteriológicos, con el fin de asegurar y preservar la calidad del agua que se entrega al consumidor (DOF, 2021): 1) coliformes fecales y totales (DOF, 2015c), 2) Pseudomonas aeruginosa (DOF, 2015b), 3) Enterococcus faecalis (DOF, 2015b), 4) Vibrio cholerae (Loyola y col., 2020), y 5) esporas de Clostridium reductoras de sulfito (Miyagi y col., 2017); asimismo, determinan los análisis a los que debe someterse el agua para evaluar el control sanitario del agua (DOF, 2015a).
En México, existen procesos de potabilización de agua en la red municipal de agua que cumplen con los estándares establecidos; sin embargo, los consumidores han optado por obtener agua de establecimientos dedicados a la purificación y embotellamiento debido a su desconfianza hacia los sistemas de abastecimiento, sus métodos y características organolépticas del agua local (DOF, 2015b; DOF, 2021). Aunque, se tiene evidencia que cuestiona el cumplimiento de las normas sanitarias por parte de establecimientos dedicados a la purificación y venta de agua para consumo humano, particularmente de las plantas más pequeñas. La mala calidad de agua que comercializan estas empresas (Aziz y col., 2017; Mohamed y col., 2020), es consecuencia del incumplimiento de las normas sanitarias (DOF, 2015b), o el mal uso de etiquetas y sellos de garantía de empresas que si cumplen con los estándares solicitados (Pichel y col., 2019).
Los estudios de la calidad del agua realizados a pequeñas plantas potabilizadoras, se han enfocado en grandes ciudades, como la Ciudad de México (Cerna-Cortes y col., 2019); sin considerar la producción de biopelícula y la multirresistencia a antibióticos; además de la identificación del género Aeromonas y especies del género Pseudomonas distintas a P. aeruginosa.
El objetivo de este estudio fue analizar la calidad del agua proveniente de pequeñas plantas purificadoras de la ciudad de Puebla, en función de los indicadores bacteriológicos (coliformes fecales y totales, P. aeruginosa y E. faecalis) establecidos en las normas nacionales e internacionales; así mismo, identificar a las bacterias que presenten un fenotipo patógeno oportunista, mediante la determinación de multirresistencia a antibióticos, la capacidad de hemólisis y la formación de biopelícula.
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de la muestra
La ciudad de Puebla se encuentra en la parte centro occidental del estado de Puebla, México (98°17’38.76” W, 98°01’12.72” W; 18°50’12.48” N, 19°13’51.24” N). Presenta un clima predominante subhúmedo y templado, con lluvias de verano, de acuerdo a la información del Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI, 2010).
Las muestras de agua (n = 70) fueron recolectadas a partir de 25 plantas purificadoras de pequeña escala, localizadas en la zona norponiente (NP) y suroriente (SO) en la ciudad de Puebla. Durante el periodo de marzo a noviembre de 2019, se realizó la compra de al menos 1 garrafón de agua de 20 L por semana, proveniente de 1 de las 25 purificadoras pequeñas, hasta completar dos muestras en cada establecimiento (n = 50). Únicamente en 10 establecimientos se compraron dos muestras adicionales (n = 20), debido a la detección de contaminación microbiana. Se verificó que los garrafones estuvieran bien cerrados y con el sello de garantía del proveedor. El día de la compra, a cada garrafón se le quitó el empaque y se tomó una muestra de 350 mL, que se colocó en un recipiente estéril debidamente rotulado. Las muestras se mantuvieron en frío (4 °C a 8 °C) para su análisis inmediato (DOF, 2015c).
Análisis de indicadores bacteriológicos
Para la identificación de coliformes totales, fecales y de las bacterias de P. aeruginosa se utilizó el método del número más probable (NMP) con tres réplicas para P. aeruginosa y cinco réplicas para coliformes totales y coliformes fecales (Mahapatra y col., 2015; Daley y col., 2018; Zhou y col., 2019). Para la determinación de las bacterias coliformes totales se realizó una prueba presuntiva con caldo Lauril sulfato (Bioxon) a 37 °C, en una incubadora (Labnet, modelo I5110A, New York, EUA), por un periodo de 24 h a 36 h. El análisis confirmatorio se llevó a cabo con caldo bilis verde brillante al 2 % (Bioxon) a 44 °C, en una incubadora (Labnet, modelo I5110A, New York, EUA) durante 24 h (DOF, 2015c; Miyagi y col., 2017). Una muestra se consideró positiva para coliformes totales si presentaba > 1.1 NMP para 100 mL de agua; las muestras negativas fueron aquellas que tenían concentraciones no detectables de bacterias o < 1.1 NMP por 100 mL de agua (Miyagi y col., 2017).
El límite permisible de P. aeruginosa es < 1.1 NMP por 100 mL; coliformes fecales = 0 NMP en 100 mL (Loyola y col., 2020) y para E. faecalis < 1.1 NMP en 100 mL (DOF, 2015b; Pant y col., 2016).
Se trabajó el método de goteo en placa para cuantificar las bacterias. Se establecieron diluciones decimales seriadas para cada muestra, con un volumen final de 1 mL. Posteriormente, se inocularon 20 µL de cada dilución en placas con medios selectivos. Para cuantificar los coliformes totales y fecales, se utilizaron agar MacConkey y agar eosina azul de metileno (Bioxon) (Farkas y col., 2012; Mohamed y col., 2020). Las bacterias P. aeruginosa se detectaron usando un medio selectivo agar leche; y E. faecalis utilizando agar bilis esculina (BD Difco) (DOF, 2015a; Pant y col., 2016). Las placas se mantuvieron a 35 °C, en una incubadora (Labnet, modelo I5110A, New York, EUA) durante 24 h.
Selección de los aislados
A partir de las 70 muestras de agua de garrafón colectadas y analizadas, 29 resultaron contaminadas. De los 29 garrafones con poblaciones bacteriológicas, se obtuvieron 56 cepas (en 27 garrafones se colectaron 2 cepas en cada uno, por lo que sumaron 54; y en 2 garrafones se colectó 1 cepa por garrafón, obteniendo 2 cepas). El criterio de selección fue la morfología colonial, se buscó que esta fuese idéntica al interior de cada muestra.
Identificación bioquímica
Las colonias presuntivas aisladas (56) se examinaron mediante tinción de Gram. Posteriormente, se realizó una identificación bioquímica a través de la prueba estándar (Farkas y col., 2012) y el kit de identificación TM Identification Systems Enteric/Nonfermenter (BBL Crystal) (Nath y col., 2020). Los 21 aislados identificados de acuerdo con la NOM-127-SSA1-202 como P. aeruginosa carecieron de un perfil bioquímico preciso, 14 cepas presentaron un perfil bioquímico similar a P. aeruginosa, en un 70 %, y 7 aislados mostraron un perfil ambiguo (40 % de semejanza). Las 25 colonias de coliformes totales se clasificaron, de acuerdo con su perfil bioquímico, como Enterobacter cloacae (13) y Serratia marcenses (12), pero de estas últimas, 3 colonias presentaron un perfil ambiguo (35 % de semejanza) para coliformes totales. A los 10 aislados (7 de mayor ambigüedad para P. aeruginosa y 3 para coliformes, específcamente Serratia marceses) se les realizó la amplificación parcial del gen 16S rRNA, para la confirmación del género bacteriano. El aislado Escherichia sp M3 se utilizó como control positivo para Escherichia coli, ya que presentó un perfil bioquímico bien definido.
Identificación molecular del gen 16S rRNA
La identificación molecular de las muestras que fueron ambiguas en el género bacteriano (n = 10) se realizó mediante el análisis de secuencias parciales del gen 16S rRNA. El ADN se extrajo usando un kit de purificación de ADN genómico (Promega Co., EE. UU.). Los oligonucleótidos conservados empleados para la reacción de PCR fueron fD1 (5´-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3´) y rD1 (5AAGGAGGTGATCCAGCC-3´). Para ello, se utilizó el reactivo Master MIX (Invitrogen), que amplifica un fragmento de 1500 pb, que corresponde al 90 % de la longitud del gen 16S rDNA, en un termociclador (Bio-Rad, T100, Berkeley, Estados Unidos de América) (Chenia y Duma, 2017). La amplificación por PCR se llevó a cabo de la siguiente forma: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, alineamientoa 59 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min. Se realizó una etapa de extensión de 10 min a 72 °C después del último ciclo, para asegurar la síntesis completa del fragmento. La amplificación del gen se verificó con una electroforesis en gel de agarosa al 1 %, y la tinción se realizó con bromuro de etidio al 0.5 %. El marcador de peso molecular empleado para verificar el tamaño del amplificado fue de 1 Kb (Thermo Scientific). El gel fue visualizado bajo luz ultravioleta con un fotodocumentador (Witeg, WGD-30, Korea). Los genes purificados se enviaron a secuenciar a la Unidad de Síntesis y Secuenciación de DNA- UNAM.
Las secuencias parciales se analizaron con el programa informático denominado herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST, por sus siglas en inglés: Basic Local Alignment Search Tool) del Centro Nacional para la Información Biotecnológica, que es parte de la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos (NCBI, por sus siglas en inglés: National Center for Biotechnology Information). El programa BLAST permitió identificar el género bacteriano de los aislados, mediante la búsqueda de secuencias similares en la base de datos internacional del GenBanck del NCBI. Los parámetros que indicaron que los aislados pertenecían a un determinado género fueron el porcentaje de identidad superior al 97 % y un valor de E igual a 0 (Aziz y col., 2017; Nath y col., 2020). Las secuencias parciales de los 7 aislados de Pseudomonas se alinearon con las secuencias de otros organismos de este mismo género. Los 3 aislados incialmente identificados como coliformes (Serratia marcenses) se alinearon con especies de Aeromonas. Lo anterior de acuerdo con las secuencias disponibles en la base de datos del GenBank. Las secuencias utilizadas correspondieron a los siguientes números: MF716716.1, MK652096.1 y KROO6248.1 para Aeromonas; MH211267.1, KJ756337.1, MH304251.1, MG833399.1 y AF390747.1 para las diferentes especies de Pseudomonas; y para Escherichia sp MH465145.1.
Las secuencias parciales de los 10 aislados y las especies relacionadas filogenéticamente fueron analizadas por alineamientos múltiples de secuencia, para esta determinación se utilizó el programa CLUSTAL-X, y la historia evolutiva se especificó con la construcción de un árbol filogenético y se aplicó el algoritmo de máxima verosimilitud del programa MEGA (versión 7).
Ensayo de cristal violeta para biopelícula en microplacas
La formación de biopelícula en microplacas se cuantificó mediante la tinción cristal violeta reportada por Elhariry y col. (2012) y Huerta y col. (2016). Los cultivos se dejaron crecer durante una noche (18 h) y se diluyeron en una proporción de 1:1000 en caldo glicerol fosfato (GP), las diluciones se transfirieron a microplacas de 96 pozos, a un volumen de 200 µL por pozo. Posteriormente, la placa se mantuvo durante 48 h a 37 °C sin agitación, en una incubadora (Labnet, modelo I5110A, New York, EUA). Los pozos fueron aspirados y lavados con agua destilada y se secaron al aire. Las biopelículas se tiñeron durante 15 min con 250 µL de solución de cristal violeta al 1 %. Los pozos se lavaron minuciosamente con agua corriente y se dejaron secar al aire. La cuantificación del cristal violeta se realizó solubilizando al cristal violeta con etanol durante 30 min y se midió la absorbancia a la densidad óptica de 620 nm, en un espectrofotómetro de ELISA (ThermoLab, LabX Mutiskan, Ontario, Canada). La formación de la biopelícula fue normalizada con la concentración de proteína en función de la densidad óptica (DO/mg de proteína), que fue medida con el espectrofotómetro (DLAB, SP_UV-1100, Beijing, China). Cada determinación se realizó con 9 repeticiones. La cepa control utilizada fue Pseudomonas putida KT2440, cepa formadora de biopelícula, característica previamente documentada (Liu y col., 2017).
Se establecieron tres niveles de producción de biopelícula utilizando los criterios de clasificación de Basson y col. (2008): nivel bajo ≥ 0.2 y ≤ 0.3, nivel moderado > 0.3 y < 0.8, nivel alto > 0.8 de DO/mg de proteína.
Prueba de resistencia a antibióticos
Se empleó el método de difusión en disco para 12 agentes antimicrobianos (Multibac I.D): Nitrofurantoína (NF 300 µg), Sulfametoxazol (SXT 25 µg), Cloranfenicol (CL 30 µg), Norfloxacina (NOF 10 µg), Ciprofloxacina (CPF 5 µg), Netilmicina (NET 30 µg), Cefotaxima (CFX 30 µg), Cefalotina (CF 30 µg), Gentamicina (GE 10 µg), Carbenicilina (CB 100 µg), Amikacina (AK 30 µg) y Ampicilina (AM 10 µg). Las placas se mantuvieron durante 48 h a 37 °C en incubadora Labnet (modelo I5110A, New York, EUA), siguiendo las técnicas descritas por Mohamed y col. (2020); Nowrotek y col. (2021). La sensibilidad fue interpretada de acuerdo con los estándares del Instituto de Normas de Laboratorio Clínico (Nowrotek y col., 2021). La cepa control utilizada fue Pseudomonas putida KT2440 por su multirresistencia a antibióticos (Baltrus y col., 2021).
Detección de hemólisis
Se analizó la presencia del factor de virulencia de reacción hemolítica de eritrocitos. Se utilizó la base del agar sangre (Bioxon) más el 5 % de eritrocitos de conejo. Los aislados bacterianos fueron sembrados y se mantuvieron a 37 °C en incubadora Labnet (modelo I5110A, New York, EUA), durante 24 h a 48 h (Skwor y col., 2014: Nath y col., 2020). La cepa control utilizada fue Pseudomonas putida KT2440, carente de capacidad hemolítica, característica que se evidenció en este estudio. El tipo de hemólisis presente en las cepas se caracterizó como α (parcial), β (completa), o γ (ausente).
Criterios de patogenicidad
Los criterios establecidos en este experimento para designar a la bacteria como patógeno oportunista fueron: presentar dos factores de virulencia, 1) producir biopelícula en alta concentración y 2) mostrar actividad hemolítica; aunado a la ventaja de la multirrestencia, resistente al menos a un antibiótico de tres o más familias diferentes. En contraste, una bacteria se considera no patógena cuando presenta un solo factor de virulencia y no posee multirresitencia a antibióticos.
Datos y análisis estadístico
La calidad bacteriológica del agua se examinó siguiendo los métodos de las Normas Oficiales Mexicanas y de la OMS (2017). Se calcularon la media aritmética y el error estándar. Las mediciones de incidencia de contaminación se describieron mediante frecuenciasrelativas. La incidencia de los indicadores bacteriológicos fue analizada por región mediante una comparación de Chi-cuadrado, teniendo como variables categóricas a las filas (x): las zonas NP y SO y, columnas (y): el tipo de indicador microbiológico, agrupados en 3 categorías: 1) coliformes totales, 2) coliformes fecales más Enterococus faecalis y 3) Pseudomonas sp). La biopelícula producida por las 10 cepas bacterianas y el grupo control, fue comparado mediante un análisis de varianza (ANOVA) paramétrico de una vía. Los datos fueron transformados con la ecuación: log (x)*2.403 6, para cumplir con los supuestos de normalidad y homocedasticidad. Se hicieron las comparaciones a posteriori a través de la prueba de diferencias honestamente significativas (HSD, por sus siglas en inglés: Honestly Significant Difference) de Tukey-Kramer (Software JMP 10.0.0, Copyright© 2012 SAS Institute Inc.).
RESULTADOS
Indicadores bacteriológicos
El análisis bacteriológico de las 70 muestras de agua indicó que 29 de ellas (41.4 %) estuvieron contaminadas y no cumplieron con la NOM-127-SSA1-2021 (DOF, 2021), así como las normas internacionales (Tabla 1), en tanto que 41 (58.6 %) de ellas si cumplieron con la calidad microbiológica adecuada. De las 70 muestras (Tablas 1 y 2), únicamente 25 (35.7 %) presentaron contaminación por coliformes totales y 4 (5.7 %) reportaron bacterias coliformes fecales, mientras que 21 (30 %) registraron Pseudomonas aeruginosa y 6 (8.6 %) E. faecalis. Los garrafones de agua contaminados con bacterias coliformes totales y Pseudomonas se reportaron en 40 % (n = 10) de las 25 plantas purificadoras evaluadas; 4 de estas 10 plantas presentaron bacterias coliformes fecales y 5 E. faecalis (Tabla 1). El análisis de Chi-cuadrado indicó que no hubo diferencia significativa (P < 0.05) entre el tipo de indicador microbiológico detectado para cada zona de la ciudad (NP y SO) (Tabla 2).
Tabla 1 Muestras de agua de garrafón provenientes de pequeñas plantas purificadoras con indicadores bacteriológicos por encima de las recomendaciones de la NOM-127-SSA1-2021 (DOF, 2021).
| Microorganismos indicadores | *Muestras con contaminación bacteriana | **Plantas purificadoras que presentaron agua con contaminación bacteriana | ||
|---|---|---|---|---|
| (n) | (%) | (n) | (%) | |
| Bacterias coliformes totales | 25 | 35.7 | 10 | 40 |
| Bacterias coliformes fecales | 4 | 5.7 | 4 | 16 |
| Enterococcus faecalis | 6 | 8.6 | 5 | 20 |
| Pseudomonas aeruginosa*** | 21 | 30.0 | 10 | 40 |
*Total de muestras (n = 70), total de muestra contaminadas (n = 29); **Plantas purificadoras (n = 25), plantas purificadoras contaminadas (n = 10). Se empleó el análisis de frecuencia relativas. ***De acuerdo con el método oficial de la NOM-127-SSA1-2021.
Tabla 2 Frecuencia de indicadores microbiológicos en muestras de agua contaminadas, procedentes de dos regiones de la ciudad de Puebla.
| Indicadores microbiológicos* | |||
|---|---|---|---|
| Regiones | Coliformes totales | Coliformes fecales y Enterococus faecalis |
Pseudomonas aeruginosa*** |
| Norponiente (NP) | 13 | 7 (3 y 4) ** | 12 |
| Suroriente (SO) | 12 | 3 (1 y 2) ** | 9 |
*La prueba de Chi-cuadrado no indicó diferencias estadísticamente significativas (P < 0.05). Valores obtenidos de 56 aislados provenientes de 29 muestras contaminadas. **Se indica el número de coliformes fecales y Enterococus faecalis, respectivamente. ***De acuerdo con el método oficial de la NOM-127-SSA1-2021 (DOF, 2021).
Las muestras de agua presentaron una población bacteriana de coliformes totales entre 102 NMP/100 mL a 106 NMP/100 mL, mientras que para coliformes fecales la población bacteriana fluctuó entre 104 NMP/100 mL a 105 NMP/100 mL. Las muestras con presencia de E. faecalis registraron poblaciones entre 103 NMP/100 mL a 106 NMP/100 mL; mientras que las poblaciones de P. aeruginosa se encontraron en el orden de 104 NMP/100 mL a 106 NMP/100 mL (Tabla 3).
Tabla 3 Identificación cuantitativa de los indicadores bacteriológicos en las muestras de agua de garrafón provenientes de pequeñas plantas purificadoras que no cumplen con la NOM-127SSA1-2021 (DOF, 2021).
| Microorganismos indicadores | Límite permisible* | Conteo de población bacteriana en las muestras UFC/100 mL | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1.1 (n) | 102 a 103 (n) | 103 a 104 (n) | 104 a 105 (n) | 105 a 106 (n) | ||
| Bacterias coliformes totales | < 1.1 NMP | 0 | 2 | 2 | 19 | 2 |
| Bacterias coliformes fecales | 0 NMP | 0 | 0 | 0 | 4 | 0 |
| Enterococcus faecalis | < 1.1 NMP | 0 | 0 | 3 | 2 | 1 |
| Pseudomonas aeruginosa** | < 1.1 NMP | 0 | 0 | 0 | 17 | 4 |
*Límites bacteriológicos permisibles de acuerdo con la OMS (2017) y la NOM-127-SSA1-2021 (DOF, 2021); plantas purificadoras (n = 25), muestras de agua (n = 70); UFC: unidades formadoras de colonias. Se presenta la media de tres experimentos independientes. La n representa las muestras positivas con la correspondiente población de cada indicador bacteriológico. **De acuerdo con el método oficial de la NOM-127-SSA1-2021.
Identificación bioquímica
En el caso P. aeruginosa, se reportaron 21 organismos presentes en las muestras contaminadas mediante la técnica indicada por la NOM-201SSA1-2015 (DOF, 2015b) (Tabla 4). La norma establece como prueba positiva para esta especie la producción de sideróforos en el medio selectivo agar leche, visualizados como pigmentos fluorescentes amarillo-verdoso. Sin embargo, al realizar la identificación bioquímica estándar para dicha bacteria, se detectaron discrepancias en las pruebas enzimáticas para la degradación de la fuente de carbono y de aminoácidos, así como, la producción de otros sideróforos, que dificultaron su confirmación. Se encontraron 7 cepas que mostraron elevada inconsistencia en las pruebas bioquímicas confirmatorias para Pseudomonas aeruginosa.
Tabla 4 Identificación bioquímica estándar de los organismos presentes en las muestras positivas de agua de garrafón provenientes de pequeñas plantas purificadoras.
| Género bacteriano | Muestras positivas | |
|---|---|---|
| (n) | (%) | |
| Enterobacter cloacae (coliforme total) | 13 | 44.8 |
| Serratia marcescens (coliforme total) | 12** | 41.4 |
| Enterococcus faecalis | 6 | 20.7 |
| Pseudomonas sp | 21* | 72.4 |
| Escherichia coli (coliforme fecal) | 4 | 13.8 |
Se analizaron 56 aislados provenientes de las 29 muestras positivas a contaminación. *7 aislados de Pseudomonas y **3 aislados de Serratia presentaron incongruencias en la identificación del género bacteriano por bioquímica estándar.
Los 56 aislados obtenidos de las 29 muestras de agua fueron identificados mediante pruebas microbiológicas y reportados en la Tabla 4. Los organismos E. cloacae, E. faecalis y E. coli fueron corroboradas bioquímicamente. En el caso de S. marcescens (coliformes totales), 3 cepas no pudieron ser confirmadas, ya que mostraron variaciones en la degradación de la fuente de carbono y aminoácidos.
Análisis molecular
El análisis molecular identificó que los aislados inicialmente identificados como P. aeruginosa, mediante la NOM-201-SSA1-2015, si pertenecen al género Pseudomonas, pero se sugiere que están relacionados filogenéticamente con las especies P. alcaligenes, P. salomonii, P. fluorescens y P. poae (Figura 1). Por otra parte, los aislados identificados inicialmente como S. marcescens (aislados EMI, MIA y MIB) en realidad forman parte del género Aeromonas y presentan relación filogenética con las especies Aeromonas veronii, Aeromonas caviae y Aeromonas hydrophila.
Según un análisis de alineamiento realizado con BLAST. El aislado Escherichia sp M3 se utilizó como control positivo. La historia evolutiva de las secuencias se construyó con el algoritmo de estimación de máxima verosimilitud (EMV). La longitud de las secuencias alineadas es de 800 pb. Los números de acceso se indican junto a los nombres de los aislados. La barra de escala representa los valores de distancia. El análisis se realizó con MEGA versión 7.
Figura 1 Árbol fi logenético basado en el análisis de la secuencia parcial del gen del 16S rRNA, de 7 aislados de Pseudomonas y 3 aislados de Aeromonas (en negritas) que muestra la relación fi logenética con los taxones cercanos.
Cuantificación de biopelícula
La presencia y la cuantificación de la biopelícula se le determinó a los 10 aislados confirmados por estudios moleculares y a la cepa control Pseudomonas putida KT2440; todos los aislados presentaron producción de biopelícula. En la comparación de la producción de biopelícula entre los aislados se detectó diferencia entre los aislados (F 0.05, 10,87 = 109.5, P < 0.000 1). La comparación a posteriori de Tukey-Kramer indicó que el aislado Pseudomonas sp P6 presentó significativamente los niveles más elevados de producción de biopelícula con un promedio de 5.87 (DO)/mg de proteína, y el aislado de Aeromonas sp MIA presentó los niveles significativamente más bajos (P < 0.001) con 0.90 (DO)/mg de proteína (Figura 2).
Se muestra la media y el error estándar de las nueve réplicas. El análisis de varianza de una vía (ANOVA) señala diferencias estadísticas significativas en al menos uno de los grupos (F = 109.5, P < 0.000 1). Las letras diferentes representan una diferencia estadísticamente significativa. La cepa Pseudomonas putida KT2440 es el control positivo.
Figura 2 Cuantificación de biopelícula de Pseudomonas y Aeromonas por la técnica de microplaca mediante la tinción con cristal violeta (Huerta y col., 2016).
Resistencia a antibióticos y hemólisis
Las cepas con resistencia a un mayor número de antibióticos fueron el control P. putida KT2440 y el aislado Pseudomonas sp P14, que son resistentes a 9 y 8 antibióticos, respectivamente (Tablas 5 y 6). Los aislados del género Pseudomonas son resistentes a norfloxacina, excepto la cepa control KT2440 y el aislado de Aeromonas sp MIA.
Tabla 5 Perfil de resistencia a antibióticos de las cepas bacterianas aisladas en las muestras de agua de garrafón provenientes de pequeñas plantas purificadoras.
| Aislado | Antibióticos | Clasificación |
|---|---|---|
| Pseudomonas putida KT2440* | Nitrofurantoína | Nitrofuranos |
| Sulfametoxazol | Sulfonamidas | |
| Ciprofloxacina | Quinolona 2ª generación | |
| Cefotaxima +, Cefalotina ∞ | Betalactámicos/ Cefalosporinas +3ª generación, ∞ 1ª generación | |
| Gentamicina | Aminoglucósidos | |
| Carbenicilina, Ampicilina | Betalactámicos /Penicilinas | |
| Cloranfenicol | Fenicoles | |
| Pseudomonas sp P4 | Norfloxacina, Ciprofloxacina | Quinolonas 2ª generación |
| Gentamicina | Aminoglucósidos | |
| Pseudomonas sp P6 | Norfloxacina, Ciprofloxacina | Quinolonas 2ª generación |
| Netilmicina, Gentamicina, Amikacina | Aminoglucósidos | |
| Pseudomonas sp P7 | Norfloxacina | Quinolonas 2ª generación |
| Netilmicina, Gentamicina, Amikacina | Aminoglucósidos | |
| Pseudomonas sp P10 | Norfloxacina | Quinolonas 2ª generación |
| Netilmicina, Gentamicina, Amikacina | Aminoglucósidos | |
| Pseudomonas sp P13 | Norfloxacina, Ciprofloxacina | Quinolonas 2ª generación |
| Netilmicina, Gentamicina, Amikacina | Aminoglucósidos | |
| Pseudomonas sp P14 | Sulfametoxazol | Sulfonamidas |
| Norfloxacina, Ciprofloxacina | Quinolonas 2ª generación | |
| Netilmicina, Gentamicina, Amikacina | Aminoglucósidos | |
| Cefotaxima | Betalactámicos / Cefalosporinas 3ª generación | |
| Carbenicilina | Betalactámicos /Penicilinas | |
| Pseudomonas sp BIM4 | Norfloxacina | Quinolonas 2ª generación |
| Netilmicina, Amikacina | Aminoglucósidos | |
| Aeromonas sp MIB | Cefotaxima | Betalactámicos / Cefalosporinas 3ª generación |
| Aeromonas sp EMI | Nitrofurantoína | Nitrofuranos |
| Norfloxacina, Ciprofloxacina | Quinolonas 2ª generación | |
| Cefotaxima | Betalactámicos/ Cefalosporinas 3ª generación | |
| Gentamicina, Amikacina | Aminoglucósidos | |
| Ampicilina | Betalactámicos /Penicilinas | |
| Aeromonas sp MIA | Cefalotina | Betalactámicos/ Cefalosporinas 1ª generación |
| Carbenicilina, Ampicilina | Betalactámicos /Penicilinas |
Para la determinación del perfil de resistencia se utilizó el método de difusión en disco para 12 agentes antimicrobianos. La hemólisis se evidenció por la capacidad de las bacterias de lisar eritrocitos utilizando el agar sangre. *Cepa control Pseudomonas putida KT2440.
Tabla 6 Producción de biopelícula, resistencia a antibióticos y grado de hemólisis de los 10 aislados de agua contaminada procedentes de pequeñas purificadoras.
| Aislado | Producción de biopelícula | Resistencia a antibióticos | Hemólisis | *Fenotipo de patogenicidad |
|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida KT2440* | Intermedia | Multirresistente | γ (sin hemólisis) |
No patógeno |
| Pseudomonas sp P4 | Intermedia | Resistente a dos familias | α (hemólisis parcial) |
No patógeno |
| Pseudomonas sp P6 | Alta | Resistente a dos familias | α (hemólisis parcial) |
No patógeno |
| Pseudomonas sp P7 | Alta | Resistente a dos familias | α (hemólisis parcial) |
No patógeno |
| Pseudomonas sp P10 | Intermedia | Resistente a dos familias | γ (sin hemólisis) |
No patógeno |
| Pseudomonas sp P13 | Alta | Resistente a dos familias | β (hemólisis completa) |
No patógeno |
| Pseudomonas sp P14 | Intermedia | Multirresistente | γ (sin hemólisis) |
No patógeno |
| Pseudomonas sp BIM4 | Intermedia | Resistente a dos familias | γ (sin hemólisis) |
No patógeno |
| Aeromonas sp MIB | Intermedia | Resistente a una familia | γ (sin hemólisis) |
No patógeno |
| Aeromonas sp EMI | Alta | Multirresistente | γ (sin hemólisis) |
No patógeno |
| Aeromonas sp MIA | Baja | Resistente a una familia | γ (sin hemólisis) |
No patógeno |
*En este estudio se establece el fenotipo de patógeno oportunista y no patógeno de los aislados caracterizados molecularmente. 1) Patógeno oportunista, presenta dos factores de virulencia: producción de biopelícula alta y hemólisis; además, posee la ventaja de ser multirresistente. 2) No patógeno, presenta un único factor de virulencia: producción de biopelícula o hemólisis.
Los aislados de Pseudomonas sp P14 y Aeromonas sp EMI son bacterias multirresistentes, así como la cepa control P. putida KT2440 (Tabla 6), en contraste, los aislados Pseudomonas sp BIM4 y Pseudomonas sp P4 presentaron la mayor susceptibilidad a antibióticos (Tabla 5). La tendencia de la mayoría de los aislados de Pseudomonas sp mostraron resistencia a dos familias de antibióticos, y los tres aislados de Aeromonas MIB y MIA fueron resistentes a betalactámicos.
Los aislados del género Pseudomonas sp P4, P6 y P7 presentaron hemólisis parcial. La cepa KT2440 (control), P10, P14 y BIM4 no presentaron hemólisis y solo el aislado de Pseudomonas sp P13 presentó hemólisis completa. En el caso del género Aeromonas, ninguno aislado presentó hemólisis (Tabla 6).
En este estudio, los 10 aislados caracterizados molecularmente fueron clasificados como no patógenos, dado que se requieren al menos 2 factores de virulencia y la multirresistencia a antibióticos para considerarlos como patógenos oportunistas (Tabla 6).
DISCUSIÓN
El 40 % de las pequeñas plantas purificadoras de la ciudad de Puebla, México, comercializaron agua contaminada con coliformes fecales, coliformes totales, E. faecalis y Pseudomonas sp (cepas presuntivas P. aeruginosa) (Tablas 1 y 2), de acuerdo con la NOM-127-SSA1-2021 (DOF, 2021). Existen pocos estudios que analizan la presencia de indicadores bacteriológicos en el agua de garrafón proveniente de pequeñas plantas purificadoras. Abada y col. (2019) y CernaCortes y col. (2019) determinaron la calidad bacteriológica del agua obtenida de pequeños establecimientos dedicados a su purificación, de Arabia Saudita y de la Ciudad de México, respectivamente, y encontraron bacterias coliformes totales en más del 60 % de sus muestras, y entre el 3 % y el 23 % de las muestras presentaron coliformes fecales, los cuales concuerdan con lo aquí reportado.
En el presente estudio, se registraron seis muestras de agua con contaminación por E. faecalis. Algunas investigaciones demostraron que esta bacteria se caracteriza por su capacidad de transferir genes que codifican para la resistencia a antimicrobianos (Chacón y col., 2018; Cho y col., 2020), a pesar de que no cuenta con un potencial alto de virulencia (Enayati y col., 2015).
Existen reportes que establecen la presencia de Enterococcus sp en muestras de agua del grifo de Dharan, Nepal (Pant y col., 2016); por lo anterior, el monitoreo de esta bacteria es importante, ya que corrobora la presencia de contaminación fecal.
El análisis de Chi-cuadrado indicó la falta de asociación entre las zonas NP y SO con el indicador bacteriológico, mostrando similitud en la presencia de las bacterias contaminantes en ambas zonas. En el estudio de Tyagi y col. (2015) se realizó la comparación de coliformes fecales y totales en dos regiones del estado de Uttarakhand en la India, Garhwal y Kumaun; encontrando un mayor grado de contaminación en la región Kumaun. No obstante que la investigación de Tyagi se llevó a cabo en agua proveniente de cuerpos de agua naturales. Otros trabajos comparan los marcadores microbiológicos en diferentes fuentes, como tinacos municipales y botellas de agua, sin considerar el origen por zonas (Pant y col., 2016). Las investigaciones que contrastan el agua proveniente de agua embotellada por regiones son escasas en la literatura y este estudio contribuye a establecer la existencia de indicadores microbiológicos por zonas.
Las muestras contaminadas presentaron varias especies de Pseudomonas distintas a P. aeruginosa, además de Aeromonas (Figura 1). Asimismo, solo 2 organismos aislados, más el control, mostraron resistencia a más de dos familias de antibióticos, por lo que, se consideran bacterias multirresistentes; además produjeron biopelícula.
Los resultados indicaron que las muestras de agua contaminadas presentaron hasta 100 000 veces más bacterias coliformes totales (Tabla 3) que lo estipulado en las normas nacionales e internacionales. Los coliformes totales (Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Serratia y Proteus) son indicadores bacteriológicos que están estrechamente relacionados con la contaminación ambiental de suelos, ríos, superficies foliares de plantas y aguas residuales (Wu y col., 2011). Además, un porcentaje pequeño de las muestras de agua contaminada con bacterias coliformes totales (5.7 %), reportó altas poblaciones de E. coli (Tabla 3). Dicha bacteria es representativa de las coliformes fecales (DOF, 2015b), lo que sugiere la existencia de contaminación fecal en el agua (Daley y col., 2018). La presencia de E. coli está estrechamente relacionada con el aumento de infecciones gastrointestinales en la población (Saxena y col., 2015) por lo que, no debería estar en el agua para consumo humano (Chacón y col., 2018).
Dentro de los indicadores bacteriológicos considerados estratégicos al determinar la calidad de agua para consumo humano, está el análisis de P. aeruginosa. El género Pseudomonas es ubicuo en la naturaleza y se encuentra comúnmente en la microflora autóctona de las aguas, incluso en aquellas con bajos niveles de nutrientes (Camiade y col., 2020; Nordstedt y col., 2020).
Los resultados de este estudio señalaron que 21 de las muestras de agua embotellada contaminadas con coliformes totales presentaron poblaciones de Pseudomonas sp, que superaron en 100 000 veces los límites permisibles establecidos por las normas oficiales. Además, los resultados sugieren que el agua embotellada puede ser un vector de transmisión del género Pseudomonas que podrían causar enfermedades en grupos vulnerables y la descomposición de alimentos (Wu y col., 2011).
La versatilidad metabólica que presentan el género Pseudomonas y el grupo de las Enterobacterias, en algunas ocasiones, hace variar la producción de metabolitos secundarios; por lo tanto, el perfil bioquímico de estas especies, no siempre coincide con lo establecido en la literatura (Sudan y col., 2018); por ello, se realizaron análisis moleculares para corroborar la identidad del género de los microorganismos aislados.
El análisis filogenético de los 7 aislados de Pseudomonas mostró cercanía con las especies P. alcaligenes, P. salomonii, P. fluorescens y P. poae. Al respecto, Woodring y Farrell (2019) reportaron que P. fluorescens y P. poae tienen el potencial genético de ser patógenos oportunistas. Por otra parte, Sala-Comomera y col. (2016), aislaron a otras especies del género Pseudomonas, sin aislar a P. aeruginosa, y concluyeron que la comunidad bacteriana identificada en el agua purificada por ósmosis reversa no representa un riesgo para la salud (Sacchetti y col., 2015). Es importante, por lo tanto, determinar si las especies de Pseudomonas, aisladas en el presente estudio, presentaban patogenicidad. Otro microorganismo de interés para la salud pública es Aeromonas sp, que se aísla de forma ubicua de muestras de carne, leche, productos lácteos y agua (Vávrová y col., 2015; Stratev y Odeyemi, 2016). En el presente trabajo, se detectó la existencia de cepas de 3 Aeromonas, por lo que se consideró el determinar si mostraban patogenicidad.
En este estudio se identificaron aislados muy cercanamente relacionados con las especies: A. hydrophila, A. caviae y A. veronii, que estaban presentes en las muestras contaminadas con coliformes totales. Las características bioquímicas de las especies del género Aeromonas sp son similares, lo que dificulta la caracterización y diferenciación fenotípica (Vávrová y col., 2015). Aeromonas hydrophila y A. caviae son patógenos acuáticos oportunistas que causan infecciones gastrointestinales (Horn y col., 2016) y septicemia en humanos y animales (Stratev y Odeyemi, 2016; Zhou y col., 2019). Los estudios que analizan el género Aeromonas en agua embotellada para consumo humano son prácticamente inexistentes. Sin embargo, este género se ha identificado en el agua potable y tiene la capacidad de producir enterotoxinas (Farkas y col., 2012; Miyagi y col., 2017) y su presencia se ha asociado con diarrea infantil (Aziz y col., 2017).
La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, ha colocado al género Aeromonas en la lista de especies candidatas a contaminantes, por lo que la OMS ha propuesto el uso de esta bacteria como marcador de riesgo en los sistemas de distribución de agua (OMS, 2017). Cabe mencionar que, ni el género Aeromonas, ni otras especies distintas a P. aeruginosa, están reportadas en las normas oficiales como indicadores bacteriológicos del agua para consumo humano; no obstante, han sido catalogadas como bacterias oportunistas que pueden ocasionar daños en pacientes inmunocomprometidos (Wu y col., 2011; Govender y col., 2021).
En este estudio, se analizó la producción de biopelícula en los 4 géneros de Pseudomonas y 3 de Aeromonas; ambas especies en general mostraron niveles altos e intermedios (Figura 2 y Tabla 6). La biopelícula favorece la colonización de ambos géneros a su hábitat, independientemente de si se trata de cepas patógenas o no patógenas (Maes y col., 2020) y, constituye un ambiente idóneo para la transferencia horizontal de genes de resistencia a antibióticos (Mulamattathil y col., 2014). La cantidad de biopelícula depende de varios factores, y los más reportados son la temperatura, aireación, disponibilidad de nutrientes y la especie; por ejemplo, Chenia y Duma (2017) observaron que en los aislados de Aeromonas procedentes de pescados y agua de mar, la cantidad de biopelícula producida a 30 °C depende de la especie. De forma similar, Elhariry y col. (2012) aislaron a Pseudomonas a partir de agua potable, la cual produjo biopelícula de forma moderada a 30 °C. Esta tendencia también se observó en el presente estudio, con los aislados de Aeromonas y Pseudomonas, lo que corrobora que la cantidad de biopelícula depende de la especie.
Pseudomonas se caracteriza por ser multirresistente a los antibióticos (Horn y col., 2016; Camiade y col., 2020); sin embargo, los resultados de este estudio muestran que la mayoría de los aislados de Pseudomonas son resistentes únicamente a dos grupos de antibióticos: Quinolonas (norfloxacina y ciprofloxacina) y Aminoglucósidos (gentamicina, amikacina y netilmicina), por lo que no se podrían considerar como bacterias multirresistentes. Solo dos excepciones mostraron multirresistencia a antibióticos: un aislado de Pseudomonas (P14) y un aislado de Aeromonas (EMI) (Tabla 6). El trabajo de Sala-Comorera y col. (2016) señaló que, el 95 % de los aislados en agua purificada fueron resistentes a cloranfenicol, aztreonam y cefotaxima.
Camiade y col. (2020) reportaron que los aislados provenientes de restos fecales de humanos y ganado manifestaron resistencia a betalactámicos (penicilinas, cefalosporinas y monobactámicos), fenicoles (cloranfenicol) y sulfonamidas (trimetroprima y sulfametoxazol), pero fueron sensibles a quinolonas y aminoglucósidos, contrario a lo que se reporta en esta investigación. La tendencia observada en la Tabla 5 es semejante al patrón de resistencia a cefalosporinas, cefixima, trimetroprima y sulfametoxazol, en aislados de aguas superficiales y residuales reportado por Govender y col. (2021).
El aislado de Aeromonas (EMI) presentó multirresistencia a los antibióticos (gentamicina, ciprofloxacina y betalactámicos), semejante al perfil de resistencia de los aislados reportados en heces fecales y alimentos por Kamal y Abdel-Latef (2015) y en el 51.6 % de los aislados provenientes de agua de ambientes acuícolas obtenidos por Dhanapala y col. (2021). La resistencia a penicilina y ampicilina se ha reportado en el 100 % de los aislados de Aeromonas a partir de granjas piscícolas (Dhanapala y col., 2021), al igual que en la presente investigación.
La actividad hemolítica fue detectada en más de la mitad de los 7 aislados de Pseudomonas, en este estudio. La hemólisis en Pseudomonas tiende a presentarse con frecuencia en cepas que se comportan como patógenos oportunistas; por ejemplo, en P. aeruginosa aislada a partir de basura proveniente de hospital (Nath y col., 2020), en aislados clínicos de P. aeruginosa y P. fluorescens corroborados en cultivo celular (Rossignol y col., 2008). Un ejemplo particular, es P. fluorescens, carece de hemólisis cuando se comporta como saprófita, contrario a las cepas oportunistas provenientes de aislados clínicos que sí presentan hemólisis (Sperandio y col., 2012). Los aislados de Aeromonas en este trabajo no generaron hemólisis, a diferencia de lo reportado en los aislados de A. caviae a partir de aguas residuales, que producen beta-hemólisis, biopelícula y multirresistencia (Nowrotek y col., 2021). La actividad hemolítica de Aeromonas ha sido comprobada en diversos estudios como en pescados y agua de mar (Kamal y Abdel-Latef, 2015), en alimentos y muestras de heces fecales de humanos (Chenia y Duma, 2017).
De acuerdo con la evidencia en la literatura, para asignar a una bacteria como patógena oportunista se requiere evidenciar al menos tres factores de virulencia (Rossignol y col., 2008; Nowrotek y col., 2021). En este estudio se consideraron como patógenos oportunistas a las bacterias aisladas que presentaron los factores de virulencia, biopelícula y hemólisis, y la multirresistencia a antibióticos (Tabla 6). Con estas características ningún aislado fue clasificado como patógeno oportunista. Sin embargo, destaca la presencia de la Pseudomonas sp P 13, con alta producción de biopelícula y hemólisis completa, la cual al ser resistente a dos familias de antibiótico podría afectar a pacientes inmunocomprometidos, si el tratamiento adecuado no se da de manera oportuna.
CONCLUSIONES
El 40 % de las pequeñas plantas purificadoras de agua no cumplieron con la normativa de la calidad de agua para consumo humano. La presencia de Aeromonas y Pseudomonas fue identificada en las muestras contaminadas. Los aislados de estos géneros bacterianos no se consideraron patógenos oportunistas al no presentar las tres características evaluadas, sin embargo, destaca el amplio número de antibióticos a los cuales se están volviendo resistentes. Es recomendable ampliar la caracterización a nivel molecular y probar la patogenicidad de los aislados de Aeromonas y Pseudomonas en un modelo animal.
