Caracterización de la resistencia

Inoculación. Se condujeron dos experimentos; el primero en marzo del 2018 y el segundo en mayo del mismo año. Las hojas viejas de todos los genotipos se cortaron tres días antes de la inoculación para inocular sólo las hojas jóvenes, asperjándolas con una suspensión de uredosporas frescas de RCH1 y RFOR2 a una concentración de 1 × 10⁶ mL^-1. Las uredosporas se suspendieron en etanol al 96% (1 g L^-1). Después, las plantas se colocaron en una cámara de incubación bajo las mismas condiciones descritas en el incremento de inóculo y en ambos experimentos, las plantas se mantuvieron en un invernadero con temperatura media de 24 °C. La unidad experimental consistió de una maceta con una planta y se utilizaron cinco repeticiones para cada genotipo y para cada aislamiento del hongo.

Medición de la resistencia. Las variables que se evaluaron fueron el periodo de latencia (PL) (días desde la inoculación hasta la esporulación) y el tipo de infección (TI), que se refiere a la reacción del tejido del hospedante ante la no invasión o invasión del patógeno. Las plantas se revisaron diariamente entre los tres y 21 días después de la inoculación (ddi) y para registrar el TI se usó la siguiente clasificación establecida por ^{Mueller et al. (2003}): R=resistente, ausencia de lesiones o muy pocas restringidas a una reacción de hipersensibilidad sin esporulación; MR=moderadamente resistente, muy pocas lesiones y producción de algunas uredosporas; MS=moderadamente susceptible, número de lesiones ligeramente reducido o esporulación retrasada; S=susceptible, número considerable de lesiones y de cantidad de esporulación.

Identificación morfológica del hongo

Identificación a nivel de género. Se observaron teliosporas bicelulares, pediceladas y horizontalmente septadas, dentro de telias no gelatinosas; las uredias y telias no se observaron con peridio en palisada. De acuerdo a ^{Cummins y Hiratsuka (1996}), estas características corresponden al género Puccinia.

Identificación a nivel de especie. Las uredosporas de ambos aislamientos se observaron de color amarillo, de forma globosa a elipsoide, con la pared hialina y equinulada, y algunas unidas a un pedicelo corto que emergía del fondo de la uredia. No se observaron poros germinales. Las medidas de las uredosporas del aislamiento RCH1 estuvieron dentro del rango: 18.3-22.3 x 15.13-19.3 µm (media = 20.06 µm ± 1.64 por 17.157 µm ± 1.41, n = 100). Las uredosporas del aislamiento RFOR2 midieron: 18-22.7 x 16.4-19.3 µm (media = 20.17 µm ± 1.81 por 17.749 µm ± 1.28, n = 100) (Figura 1-F).

Sólo se encontraron teliosporas del aislamiento RFOR2, de forma elipsoidal y clavadas, con papila en el ápice de forma redondeada o angular y excéntrica. En su mayoría se observaron teliosporas no septadas, que midieron 30.1-40.8 x 13.3-17.5 µm (media = 35.887 µm ± 4.70 por 15.518 µm ± 1.67, n = 100) (Figura 1-G). Las teliosporas septadas midieron 42.1-51.2 x 14.5-21.2 µm (media = 46.526 µm ± 3.86 por 17.544 µm ± 2.7, n = 100) (Figura 1-H). La pared de las teliosporas se observó lisa y café oscuro conforme se acercaba al ápice; a los lados midió de 1 a 1.8 µm (media = 1.365 µm) y en el ápice 3.1-5.3 µm (media = 4.7 µm ± 0.77, n = 20).

Las características morfológicas de uredosporas y teliosporas coincidieron con las descripciones de P. hemerocallidis realizadas por ^{Hiratsuka et al. (1992}), ^{Williams-Woodward et al. (2001}) y ^{Hernández et al. (2002}). Las uredosporas de ambos aislamientos resultaron ligeramente más pequeñas que aquellas descritas por los autores y al igual que en los otros especímenes americanos, se observaron teliosporas no septadas. No se contó con la presencia del hospedante alterno de la roya identificada, pero de acuerdo con Hiratsuka et al. (1992), P. hemerocallidis posee espermagonios tipo 4.

Figura 2. Tipos de infección por P. hemerocallidis sobre cinco genotipos de Hemerocallis spp., a los 21 días después de la inoculación. A) Uredias y uredosporas sobre el genotipo susceptible H. lilioasphodelus, (10 ddi). B) Lesiones necróticas (reacción de hipersensibilidad) e incipiente esporulación sobre el cultivar moderadamente resistente ‘Radiant Greetings’, (10 ddi). C) Reacción de hipersensibilidad e incipiente esporulación sobre el cultivar moderadamente resistente ‘Stella d’Oro’, (11 ddi). D) Lesiones cloróticas diminutas sin esporulación sobre el genotipo resistente H. fulva, (6 ddi) E) Ausencia de lesiones sobre el cultivar resistente ‘Cherry Wine’. 

Identificación molecular. Con las amplificaciones usando los primers ITS5 e ITS4, se obtuvieron fragmentos de 618 y 623 bp aproximadamente, los cuales se depositaron en el genbank (números de acceso FJ897533 y FJ897535). Los resultados del BLASTN confirmaron que los aislamientos RCH1 y RFOR2 correspondieron a P. hemerocallidis, ya que la región ITS reveló similitud de nu cleótidos de 99% con P. hemerocallidis (número de acceso AF479742).

Caracterización de la resistencia. De acuerdo con el periodo de latencia y tipo de infección, los genotipos evaluados se agruparon en tres categorías de resistencia a P. hemerocallidis (Cuadro 1). No se observaron diferencias de los tipos de infección entre aislamientos y experimentos. El tipo de infección registrado por genotipo fue uniforme entre aislamientos.

La especie H. lilioasphodelus se comportó susceptible al presentar inicialmente pequeñas lesiones abundantes, cloróticas húmedas y brillantes a los tres días después de la esporulación (ddi), las cuales esporularon a los seis ddi en forma de uredias pequeñas y redondas de color amarillo brillante, que crecieron de forma extendida y con abundante esporulación en el haz y envés (10 ddi) (Figura 2-A). Los cultivares ‘Radiant Greetings’ y ‘Stella d’Oro’ presentaron pequeñas lesiones necróticas de color rojizo a los cinco ddi, indicando reacción de hipersensibilidad; sin embargo, a los 10 y 11 ddi, respectivamente, se observó una incipiente esporulación de color amarillo en algunas lesiones, por lo que se clasificaron como moderadamente resistentes (Figura 2-B y C). La especie H. fulva presentó un número reducido de pequeñas lesiones cloróticas, húmedas y brillantes sin esporulación a los seis ddi, por lo que se clasificó como resistente (Figura 2-D), al igual que el cultivar ‘Cherry Wine’, el cual no presentó lesiones ni esporulación (Figura 2-E).

La reacción de hipersensibilidad (RH) es un mecanismo de resistencia activa y opera después de la penetración del parásito. En sentido amplio, este mecanismo se atribuye a la presencia de genes mayores para resistencia que condicionan la reacción a un genotipo específico del parásito, pero en realidad, condicionan un rango de interacciones desde inmunidad hasta cierto grado de susceptibilidad (^{Jones y Clifford, 1983}).

Los genes que confieren RH causan un colapso de la célula del hospedante después de que el haustorio se ha formado. La célula se colapsa a pocas horas de la penetración para interferir con el suministro del nutrimento del hongo, lo cual lleva a una muerte rápida de la hifa de infección. Este fenómeno se puede observar a simple vista como manchas amarillentas y puntos necróticos. En otros casos el colapso es más lento y puede permitir la formación de uredosporas (^{Parlevliet y van Ommeren, 1975}; ^{Niks et al., 2011}). Esto explica el tipo de infección observado en los cultivares ‘Radiant Greetings’ y ‘Stella d’Oro’; en ambos se formaron primero lesiones de hipersensibilidad, pero después se apreciaron uredias en algunas lesiones. Los estudios de ^{Mueller et al. (2003}), ^{Li et al. (2007}) y ^{Buck (2013}) señalan que el cultivar ‘Stella d’Oro’ se comportó moderadamente resistente, resistente o altamente resistente, respectivamente, en donde el tipo de infección se limitó a lesiones necróticas. Las reacciones observadas en los experimentos del presente estudio en dicho cultivar son similares a las reportadas por estos autores, por lo que al parecer no existe variación en la virulencia del patógeno.

El genotipo H. fulva presentó esporulación lenta en algunas de las lesiones cloróticas, fuera del intervalo de evaluación de la resistencia, aproximadamente 28 días después de haber sido inoculado. ^{Parlevliet y van Ommeren (1975}) describieron que genotipos con resistencia parcial presentan un tipo de infección susceptible (completa compatibilidad entre el patógeno y su hospedante, lo que indica ausencia de hipersensibilidad) y el periodo de latencia es mucho más prolongado y la frecuencia de infección es menor comparado con un hospedante susceptible. De los experimentos establecidos se pueden apreciar las grandes diferencias en periodo de latencia y en frecuencia de infección (no cuantificada), pero un estudio histológico como los realizados en royas de cereales (^{Niks, 1983}; ^{Moldenhauer et al., 2006}) no se hizo para precisar la presencia a nivel microscópico del nivel de reacción y así definir la existencia de una posible resistencia parcial. Basado sólo en los cambios de coloración del tejido del hospedante, los tipos de infección de los cultivares ‘Radiant Greetings’ y ‘Stella d’Oro’ tienen una resistencia de hipersensibilidad; sin embargo, H. fulva al mostrar un PL de aproximadamente 28 días y nula reacción de hipersensibilidad macroscópicamente, podría presentar resistencia parcial sensu Parlevliet y van Ommeren (1975), lo cual requiere ser estudiado más profundamente.

Los aislamientos RCH1 y RFOR2 inoculados en los diferentes genotipos, indujeron las mismas reacciones de resistencia, lo que indica que no hay variaciones de patogenicidad. Sin embargo, los trabajos de ^{Hernández et al. (2002}) y ^{Chatasiri et al. (2006}) indican una evidencia de la variación del patógeno, ya que al comparar la región ITS de varios aislamientos provenientes de diferentes áreas geográficas de América y Asia, observaron diferencias genéticas en los especímenes de cada continente; no obstante, señalan que es necesario un muestreo más amplio para determinar que existe variabilidad genética del hongo.

La inoculación de diferentes aislamientos de P. hemerocallidis en el estudio de ^{Buck (2013}) confirma la presencia de patotipos que difieren en virulencia en cultivares de lirio de día en el sureste de EE. UU. Además, ^{Carvalho et al. (2018}) reportan que la secuencia del aislamiento encontrado en Portugal se alinea completamente con las secuencias de EE. UU. y Costa Rica, mientras que es diferente de las secuencias reportadas de Rusia, Japón, Australia y México (secuencias reportadas en el presente estudio).

Las royas son parásitos obligados y altamente específicos al hospedante; en algunas especies de royas, las formas especiales y razas fisiológicas son definidas de acuerdo con la especificidad del hospedante y cultivares (^{Li et al., 2007}). En el caso de P. hemerocallidis, no se ha reportado especificidad al hospedante a nivel de razas fisiológicas por lo que, no sería sorprendente la existencia de tal especialización patogénica en este patosistema ya que es similar a aquellos que involucran royas en diferentes cultivos de importancia económica (^{Leonard y Szabo, 2005}; ^{Soto-Estrada et al., 2005}; ^{Yáñez et al., 2009}), pero es necesario realizar más estudios para demostrar este aspecto.

Se sabe que en las royas macrocíclicas, p.e. roya del tallo (P. graminis f. sp. tritici) y roya de la hoja del trigo (P. triticina) la recombinación genética ocurre en el hospedante alterno y este es un mecanismo para generar nuevas combinaciones de virulencia. Se desconoce la existencia de Patrinia villosa en México, hospedante alterno de P. hemerocallidis (^{Ono, 2003}) y por lo tanto, se ignora su posible influencia en la generación de variación genética del hongo.

En América del Norte, el primer reporte de esta roya lo realizaron ^{Williams-Woodward et al., en el año 2001}, al observar material infectado en EE. UU. Después se dispersó rápidamente en América y seguramente se encuentra en todos los países donde existan cultivares susceptibles de Hemerocallis spp.