Materia prima

Se emplearon granos de maíz variedad CAFIME del ciclo primavera-verano 2022, los cuales fueron proporcionados por el INIFAP-Durango (campo experimental Francisco I. Madero ubicado en el Municipio de Pánuco de Coronado, Durango), mientras que los granos de avena, cebada y sorgo fueron comprados en el mercado local. Todos los granos fueron limpiados y almacenados a temperatura ambiente hasta su posterior uso.

Obtención y conservación de la cepa

El hongo Aspergillus oryzae cepa 2094 fue proporcionado por el cepario del Instituto Tecnológico de Durango-TecNM. Se utilizó como medio de conservación Agar Papa Dextrosa (PDA) a una temperatura de 30 °C. El inóculo fue preparado a partir de un cultivo de 13 días de desarrollo por suspensión de esporas en agua destilada a una concentración de 1 x 10⁶ esporas/mL.

Fermentación en estado sólido (FES)

La FES se realizó con el método descrito por Bhanja Dey & Kuhad (2014^a). Se pesaron 200 g de cada grano (maíz, avena, cebada y sorgo) los cuales se depositaron en frascos de vidrio de 1 L, se agregaron 200 mL de agua destilada y se esterilizaron a 121 °C por 15 min, terminado el proceso se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Posteriormente, los granos esterilizados se inocularon con 20 mL de la suspensión de esporas (preparada previamente). El tiempo de incubación fue de 0, 3, 5 y 7 días respectivamente a una temperatura de 30 °C. Una vez concluido el proceso de fermentación, los granos fermentados fueron esterilizados nuevamente y se dejaron secar a 55 °C por un periodo de 72 h. Posteriormente, fueron molidos en un molino Wiley (Arthur H. Thomas, Philadelphia, PA, USA) a un tamaño de partícula de 1 mm, para después guardarlos en bolsas Ziploc en un lugar obscuro y seco a temperatura ambiente para su posterior análisis.

Análisis químicos

Se determinó el contenido de proteína cruda (PC) en los granos fermentados de acuerdo con la AOAC (1990). Los compuestos fenólicos se llevaron a cabo de acuerdo a la metodología propuesta por ^{Heimler et al. (2005)}. Un gramo de muestra se maceró con 90 mL de etanol al 70 % (ajustado a pH 2.0) y se dejó toda la noche a temperatura ambiente. Después, la mezcla se filtró y luego se desengrasó con éter de petróleo. Posteriormente, el extracto desengrasado se evaporó a temperatura ambiente y se redisolvió en etanol al 70 % (pH 2.0) a un volumen final de 2 mL. Para la determinación de fenoles totales (FT), se tomaron 125 µl de extracto fenólico, se le agregó 0.5 mL de agua desionizada y 125 µl de reactivo Folin-Ciocalteu. La mezcla se dejó reposar por 6 min, y luego se agregaron 1.25 mL de carbonato de sodio (Na₂CO₃) al 7 %. El volumen final se ajustó a 3 mL con agua desionizada. La mezcla se dejó reposar por 90 min y una vez pasado el tiempo, se midió la absorbancia a 760 nm, como blanco se utilizó agua. La cantidad de fenoles totales se expresó como equivalentes de ácido gálico (µg EAG/g harina). Para la determinación de taninos condensados (TC), a 50 µl del extracto se le agregaron 3 mL de solución de vainillina al 4 % en metanol y 1.5 mL de ácido clorhídrico concentrado. La mezcla se dejó reposar por 15 min y la absorción se midió a 500 nm, se empleó metanol como blanco. La cantidad de TC se expresó como equivalentes de catequina (µg EC/g harina).

Análisis estadístico

Los datos obtenidos de proteína cruda, fenoles totales y taninos condensados se analizaron con ANOVA de una sola vía y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p < 0.05), empleando el paquete estadístico SAS versión 9.0 (SASInc., Cary, NC, USA). Todos los tratamientos se efectuaron por triplicado y los valores se expresaron como la media ± desviación estándar.

Proteína cruda (PC)

En la Tabla 1 se muestran los resultados del contenido de proteína cruda de los granos de cereales fermentados a diferentes tiempos. El maíz y la avena alcanzaron los niveles más altos de PC desde el día 5 de fermentación (p < 0.05), mientras que, la cebada y el sorgo desde el día 3 de fermentación (p < 0.05). Diversos estudios con diferentes microorganismos han demostrado el incremento de proteína durante la fermentación. Por su parte, (^{Chen et al., 2013} & ^{Chen et al., 2014}) observaron un incremento en la PC en harina de soya de 50.46 a 58.99 y 9.2 %, respectivamente, al fermentarla con Aspergillus oryzae por 0, 25 y 36 h. De igual manera, Xiao et al. (2015^b) observaron que la fermentación de harina de garbanzo con Cordyceps militaris, aumentó el contenido de PC de 22.13 a 26.43 %. Adicionalmente, ^{Xiao et al. (2018)} trabajaron con harina de frijol rojo fermentada con Cordyceps militaris y observaron un incremento significativo del 9.3 % (23.61 a 25.81 %) con el proceso de fermentación. Por su parte, ^{Chen et al. (2021)} fermentaron harina de soya con las bacterias Bacillus velezensis por 24 h y posteriormente con Lactobacillus plantarum por 48 h; los resultados mostraron un aumento de PC de 47.28 a 51.08 % a las 24 h, mientras que a las 48 h se obtuvo un máximo de 52.36 %. Asimismo, ^{Sánchez-García et al. (2022)} trabajaron con semillas de lentejas, quínoa y sus harinas, fermentándolas con el macrohongo Pleurotus ostreatus a diferentes tiempos. Obteniendo un incremento significativo en el contenido de proteína total entre 7 y 26 %. Además, observaron que el tamaño de partícula, así como el sustrato, influyeron sobre el contenido de proteína. Del mismo modo, ^{Cubillos-Orjuela et al. (2024)} fermentaron un producto alimenticio que incluía un porcentaje de tamo de cereales (10 y 20 %) con bacterias lácticas, y encontraron que al incluir 20 % de tamo de cereales y fermentar por 48 h se obtuvo un incremento de 2.2 % de proteína cruda.

Fenoles totales

En la Tabla 2 se presentan los resultados del contenido fenólico total en granos de cereales fermentados con Aspergillus oryzae a diferentes tiempos. En general, se observa que el contenido fenólico de todos los granos se incrementó conforme aumentó el tiempo de fermentación. En el maíz se observaron los valores más altos (p < 0.05) a partir de los 5 días de fermentación, en tanto que en la avena y cebada el contenido fenólico más alto (p < 0.05) se observó a los 7 días de fermentación. En sorgo, el contenido fenólico fue similar desde los 3 hasta los 7 días de fermentación (p > 0.05). El incremento que tuvo la avena, la cebada y el sorgo a los 7 días de fermentación fue de 248 %, 117 % y 57 %, respectivamente. El maíz a los 5 días de fermentación tuvo un incremento de 59 %. Según ^{Saharan et al. (2017)}, el aumento del contenido fenólico durante la fermentación está relacionado con la producción de enzimas por el hongo, tales como α-amilasa, β-glucosidasa y xilanasa que tienen la capacidad de hidrolizar carbohidratos, degradar la pared celular y liberar compuestos fenólicos. La mejora del contenido fenólico en cereales fermentados con hongos filamentosos, fue observado por otros autores ^{Cai et al. (2012)} fermentaron harinas de avena con Aspergillus oryzae var. effuses, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger por 3 días a 25 °C y reportaron que el hongo Aspergillus oryzae var. effuses incrementó en mayor grado el contenido fenólico en las harinas fermentadas. Por su parte, Bhanja Dey & Kuhad, (2014^a) fermentaron granos enteros de trigo, arroz integral, avena y maíz con Aspergillus oryzae NCIM 1212, Rhizopus oligosporus NCIM 1215, Aspergillus awamori MTCC No. 548 y Rhizopus oryzae RCK2012 a 30 °C por 3 días. Los resultados demostraron que el contenido fenólico en todos los granos fermentados con Aspergillus oryzae NCIM 1212 mostraron valores más altos que con los demás hongos. De igual manera, Bhanja Dey & Kuhad (2014^b) fermentaron granos de trigo con Rhizopus oryzae RCK2012 y encontraron que la fermentación incrementó un 377 % el contenido fenólico en los extractos acuosos. Por su parte, ^{Abd Razak et al. (2015)} estudiaron el efecto de la fermentación con Rhizopus oligosporus y Monascus purpureus (de manera individual y mezclados) sobre el contenido fenólico del salvado de arroz. Estos autores encontraron que el contenido fenólico de extractos acuosos y metanólicos de las muestras fermentadas fue mayor que las muestras no fermentadas, a excepción del extracto acuoso de la muestra fermentada con Monascus purpureus. También se observó que la mezcla de los hongos en los extractos acuosos produjo un mayor contenido fenólico que de manera individual, mientras que, en los extractos metanólicos el contenido fenólico fue similar en ambas formas. A su vez, ^{Sandhu et al. (2016)} fermentaron seis variedades de trigo con Aspergillus awamorinakazawa a 30 °C por 6 días. Los resultados mostraron que la fermentación aumentó considerablemente el contenido fenólico al cuarto día en las seis variedades. Adicionalmente, ^{Saharan et al. (2017)} evaluaron granos de trigo, arroz, avena, maíz y sorgo fermentados con Aspergillus oryzae (MTCC 3107) durante 6 días a 30 °C. Encontrando en el trigo y avena los valores más altos de contenido fenólico al cuarto día de fermentación; mientras tanto, el arroz, sorgo y maíz el máximo incremento se observó al quinto día. Por su parte, ^{Sánchez-Magaña et al. (2019)} investigaron el efecto del tiempo de fermentación sobre el contenido fenólico libre, ligado y total en harinas de maíz crudo, cocido y fermentado a diferentes tiempos con Rhizopus oligosporus NRRL 2710. Ellos encontraron que la fermentación aumentó el contenido fenólico libre a partir de las 48 h y el valor máximo (227.75 mg ácido gálico/100 g muestra) se presentó a las 108 h. Con respecto al contenido fenólico ligado y total comenzó a aumentar a partir de las 72 h, con un valor máximo (993.44 mg ácido gálico/100 g muestra) a las 108 h. De acuerdo a lo reportado en estudios previos, es importante considerar varios factores que influyen en el contenido fenólico de cereales, como la especie, variedad, microorganismo, tiempo de fermentación, método de extracción y método de análisis.

Taninos condensados (TC)

La Tabla 3 muestra el contenido de taninos condensados en los granos de cereales fermentados. Se encontraron diferencias significativas (p < 0.05) conforme avanzaba el tiempo de fermentación. En el maíz se observó más este comportamiento, ya que el contenido de TC incrementó conforme aumentó el tiempo de fermentación con respecto al tiempo 0. Por su parte, el sorgo registró el mayor contenido de TC (202.11 µg EC/g harina) a los 5 días de fermentación, mientras que el maíz alcanzó su máximo (97.19 µg EC/g harina) a los 7 días (p < 0.05). ^{Espitia-Hernández et al. (2022)} reportaron resultados opuestos a los del presente estudio con sorgo; trabajaron con dos variedades de sorgo (rojo y negro) fermentadas en estado sólido con Aspergillus oryzae y Aspergillus niger por 96 h. El sorgo rojo fermentado con Aspergillus oryzae no mostró diferencias significativas (p > 0.05), mientras que con Aspergillus niger se mostró un incremento a partir de las 12 h, con el valor más alto a las 72 h (76.07 mg EC/100 g muestra). Respecto al sorgo negro fermentado con Aspergillus oryzae, los taninos condensados disminuyeron a partir de las 24 h (p < 0.05); por el contrario, con Aspergillus niger aumentó el contenido de TC a partir de las 36h y el valor más alto se obtuvo a las 84 h (73.20 mg EC/100g muestra). Un estudio previo con bacterias lácticas y levaduras fue realizado por ^{Terefe et al. (2021)}, los cuales evaluaron el efecto de la fermentación en estado sólido con Lactobacillus plantarum y Saccharomyces cerevisiae y su cocultivo sobre el contenido de taninos condensados en harina de maíz a 0, 12, 24, 36 y 48 h. El contenido de TC disminuyó con todas las cepas conforme aumentaba el tiempo de fermentación; los valores más bajos se presentaron con el cocultivo a las 48 h (12.3 % EC). La información publicada acerca del efecto de la fermentación en estado sólido sobre el contenido de taninos condensados en cereales es muy limitada. Sin embargo, hay estudios que se han realizado con otras especies, tal como lo reportan ^{Dhull et al. (2020)} ellos evaluaron el efecto de la fermentación en estado sólido de tres variedades de lentejas (HM-1, LL-931 y Sapna) con Aspergillus awamori sobre el contenido de taninos condensados. Los resultados en las tres variedades indicaron un incremento de TC conforme aumentaba el tiempo de fermentación, maximizándose el contenido de taninos a los 6 días en las tres variedades (3.16, 4.52 y 4.30 mg EC/g base seca, respectivamente).

Por su parte, ^{Altop et al. (2018)} trabajaron con hojas de olivo para fermentarlas en estado sólido con cuatro cepas de Aspergillus niger (F1, F2, F3 y F4) y analizar su efecto sobre el contenido de taninos condensados. La fermentación aumentó el contenido taninos condensados en las hojas de olivo con todas cepas y el valor más alto de TC se encontró con la cepa F2 (11.44 %). Así mismo, ^{Duhan et al. (2021)} fermentaron en estado sólido la torta de cacahuate (residuo obtenido después de extracción del aceite de cacahuate) con Aspergillus oryzae durante 6 días para determinar su efecto sobre el contenido de taninos condensados. Los resultados claramente demostraron que la fermentación incrementó el contenido de TC; presentando su valor máximo (245 µg/g) a los 6 días de fermentación. Lo mencionado anteriormente indica que el tipo de cereal, variedad, especie, microorganismo y cepas juegan un rol muy importante durante la FES para poder liberar los taninos condensados de la pared celular.