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Introducción
El fósforo es un nutriente esencial para las plantas, y su deficiencia en el suelo limita el rendimiento de los cultivos; para mantener su productividad es necesario el uso de fertilizantes fosfatados con dosis y tiempos adecuados de aplicación (Duarte et al., 2023). Los fertilizantes fosfatados se elaboran a partir de roca fosfórica, recurso no renovable cuyas reservas han disminuido considerablemente, motivo por el cual se deben buscar métodos alternativos de fertilización que incrementen la absorción de este nutrimento (Coppiarolo et al., 2022).
Los nanofertilizantes pueden ser considerados una alternativa en la agricultura sostenible por sus altas tasas de liberación de nutrientes con bajas dosis de aplicación. Las sales de fosfato solubles sintéticas de tamaño nanométrico, mejor conocidas como nanopartículas de hidroxiapatita (Ca10(PO 4)6(OH)2, también conocida como nHAp, tienen como base la roca fosfórica, cuentan con la capacidad de liberar nutrientes de manera lenta y controlada, lo que puede incrementar el rendimiento y calidad de cultivos, además de mejorar la sostenibilidad general de los sistemas agrícolas (Flores-Hernández et al., 2021).
Existen reportes en la literatura que señalan que las nHAp pueden ser utilizadas como nanofertilizante o nanobioestimulante; éstas pueden suministrar el suficiente fosforo a los cultivos, con menor impacto ambiental y evitar la sobrefertilización en los sistemas tradicionales de producción agrícola (Elsayed et al., 2022), además de disminuir la degradación, contaminación y agotamiento de los recursos naturales, lo que provoca un desequilibrio en la biodiversidad (Arora et al., 2022).
En trigo (Triticum aestivum) las nHAp se han utilizado como fertilizante fosfatado con excelentes resultados debido a su tamaño nanométrico, pues tienen mayor movilidad y una estadía prolongada en el suelo, facilitando así su absorción por las raíces de la planta (Maghsoodi et al., 2020), en dosis bajas promueve la generación de mayor biomasa en rábano (Raphanus sativus) (Flores-Hernández et al., 2021), en higuera (Ficus carica) promueve frutos de mayor peso y tamaño y con un mayor contenido de compuestos fenólicos, lo que indica su efectividad como nanofertilizante y nanobioestimulante (Azpeitia, 2022; Com. Pers.)1, en maíz (Zea mays) aumentó el contenido de clorofila, rendimiento y mayor resistencia al estrés abiótico (Yoon et al., 2020).
El pimiento morrón (Capsicum annuum) es una hortaliza que presenta alta cantidad de carotenos, vitamina C, fenoles, xantofilas, flavonoides y capsaicinoides; además, tiene alta actividad antioxidante (Morán et al., 2022). El objetivo del estudio fue determinar el efecto de la aplicación foliar de nHAp sobre la síntesis de compuestos bioactivos, la actividad enzimática y el rendimiento de fruto de pimiento morrón.
Materiales y métodos
Área de estudio y material vegetal
Se estableció un experimento en invernadero en el Instituto Tecnológico de Torreón, Torreón, Coahuila, México, ubicado a 25° 36' 36.54'' latitud norte y 103° 22' 32.28'' longitud oeste, a una altitud de 1123 msnm. Se trasplantaron plántulas de pimiento morrón cv. Hunter (Syngenta®) con 3-4 hojas verdaderas y altura de 15 a 20 cm en recipientes de plástico negro con 15 L de capacidad, empleados como macetas, con sustrato de arena de río y vermiculita (proporción 80:20 v:v), donde se trasplantó una plántula por maceta. La arena de río se lavó y desinfectó en hipoclorito de sodio 5 %. Las macetas se dispusieron a doble hilera con separación de 1.6 m.
Caracterización de las nanopartículas
Las nHAp fueron obtenidas del Centro de Investigación Química Aplicada (CIQA) en Saltillo Coahuila, México. Dichas partículas se sintetizaron por reacción de precipitación química húmeda de una solución acuosa de hidróxido de calcio [Ca(OH)2] y ácido orto fosfórico (H3PO4), con una relación estequiométrica de Ca/P = 1.67, con tamaño de partículas en el intervalo de 15 a 25 nm (Flores-Hernández et al., 2021).
Los tratamientos consistieron en la aplicación foliar de cuatro dosis crecientes de nHAp: 500, 1000, 1500 y 2000 mg L-1, para la preparación de las mismas se utilizó una concentración inicial de 2000 mg L-1 con apoyo de un sonicador (Tianjin Autoscience AS2060, Instrumental Factory®, Tianjin, China), agua desionizada estéril en suspensión durante 30 min. El trabajo se estableció bjo un diseño experimental completamente al azar, con siete repeticiones, con lo que se obtuvo un total de 35 unidades experimentales. Al tratamiento testigo se le aplicó solo agua desionizada. Cada 15 días, entre las 8:00 y 10:00 horas, se realizaron las aplicaciones con aspersores manuales, después del trasplante y hasta la cosecha.
Variables evaluadas
Para determinar el rendimiento de fruto (kg por planta) se utilizó una balanza digital (VE-CB2000, Velab, Montreal, Quebec, Canada) para determinar el peso total de frutos por planta, cosechados a madurez comercial. Los diámetros polar y ecuatorial (cm) se cuantificaron con un vernier digital (ASK-500-196-30, Mitutoyo, Aurora, Illinois, EUA) en cinco frutos de cada unidad experimental.
Para determinar las variables de calidad nutraceútica y actividad enzimática se tomaron 10 frutos al azar de cada unidad experimental. Se determinaron fenoles totales, flavonoides y capacidad antioxidante, según la metodología reportada por Molina-Quijada et al. (2010). En un tubo de plástico con tapón se mezcló pulpa fresca a razón de 2 g en 10 mL de etanol, que se colocó en un agitador rotatorio (HZ-300, Lohxa, Worcester, Massachusetts, EUA) durante 6 h a 5 °C y 20 rpm. Posteriormente, los tubos se centrifugaron durante 5 min a 3000 rpm. El sobrenadante se extrajo para las pruebas de los análisis, cada reacción se realizó por triplicado.
Compuestos bioactivos
Flavonoides totales
Para cuantificar compuestos bioactivos se determinó el contenido total de flavonoides con el método del colorímetro (Zhishen et al., 1999). Mediante un espectrofotómetro UVvis (VE-5100UV, Velab, Montreal, Quebec, Canada) a 765 nm, fue medida la absorbancia inmediatamente a 510 nm, resultados que fueron expresados en mg QE g-1 PF.
Por el método de Folin-Ciocalteau se determinó la cantidad de fenoles totales (Singleton et al., 1999). Mediante un espectrofotómetro UV-vis (VE-5100UV-Velab, Montreal, Quebec, Canada) se obtuvieron lecturas a 765 nm y los resultados se expresaron en mg equivalentes AG 100 g−1 peso fresco (PF).
La concentración de vitamina C se obtuvo mediante el método de Klein y Perry (1982). Para la extracción se agregaron 10 mg de muestra y 1 mL de H3PO4 0.36 M y se centrifugó (Ohaus Frontier FC5515 R, Parsippany, New Jersey, EUA) a 5000 rpm durante 10 min a 4 °C. Posteriormente, del sobrenadante se sometieron a homogeneización 200 mL y 1.8 mL de 2,6-diclorofenolindofenol (2,6-D) 0.09 M para su posterior lectura en un espectrofotómetro (VE-5100UV, Velab) a 515 nm de longitud de onda, los cuales fueron cuantificados en 100 mg g-1 PF.
Capacidad antioxidante
La capacidad antioxidante se cuantificó por el método in vitro DPPH+(Brand-Williams et al., 1995). Mediante un espectrofotómetro UV-vis (VE-5100UV-Velab) a 517 nm, se tomaron las lecturas de la absorbancia de la mezcla de 50 µL y 1950 µL de solución DPPH+ después de 30 min de la reacción. Los resultados se reportaron como µM de equiv Trolox 100 g-1 PF.
Para cuantificar la actividad enzimática se emplearon tubos eppendorf de 2 mL, se obtuvo el extracto enzimático mediante la metodología de Ramos et al. (2010); para ello, se agregaron 200 mg de tejido vegetal liofilizado (Liofilizador Labconco 2.5 Freezone, Kansas City, Missouri, EUA), 1.5 mL de buffer de fosfatos con pH 7-7.2 (0.1 M) y 20 mg de polivinilpirrolidona, y se centrifugaron (Microcentrífuga Labnet Int. Inc., PrismTM C2500-R, Edison, New Jersey, EUA) a 12,000 rpm por 10 min a 4 °C. Posteriormente, el sobrenadante se filtró en una membrana de PVDF con tamaño de poro de 0.45 micras.
Para la actividad de catalasa se siguió el protocolo mencionado por Braber (1980), para lo cual se mezcló 1 mL del extracto enzimático (previamente diluido 1:20) con 3 mL de amortiguador fosfato de sodio 300 µM, pH 6.8 y 1 mL de H2O2 100 µM. El tiempo de reacción fue de 1 min a 240 nm. Los resultados se reportaron en U mg-1.
La concentración de proteína total se cuantificó por medio de la escala colorimétrica de Bradford (1976), dichas determinaciones se expresaron en mg g-1 PF.
El contenido de fósforo se cuantificó con el método vanadato-molibdato a través de mineralización de los tejidos por medio de digestión triácida y se cuantificó por colorimetría con una lectura a 470 nm, expresado en mg kg-1.
Análisis estadístico
Se realizaron análisis de varianza con los datos de las variables respuesta y pruebas de comparación múltiple de medias (Tukey, P ≤ 0.05) con el paquete estadístico Statistical Analysis System, Versión 9.3. (SAS Institute, 2011).
Resultados y discusión
Rendimiento y sus componentes
El mayor rendimiento y número de frutos por planta se obtuvo con el tratamiento de 500 mg L-1, pero las diferencias fueron numéricas y no estadísticas (Cuadro 1). Similares resultados fueron reportados por Yoon et al. (2020), quienes indicaron que la aplicación de nHAp no incrementó significativamente el rendimiento de los cultivos, pero si mejoró la calidad nutracéutica de los mismos. Con relación al tamaño de los frutos (diámetro polar y ecuatorial), destacaron las dosis de 1000 y 1500 mg L-1, respectivamente.
Cuadro 1 Efectos de nHAp sobre el rendimiento y sus componentes en pimiento morrón.
| nHAp (mg L-1) | Rendimiento (kg planta-1) | Núm. de frutos | Diámetro (cm) | |
| Polar | Ecuatorial | |||
| Testigo | 0.93 ± 0.16 | 8.25 ± 1.70 | 5.43 ± 0.36 b | 5.04 ± 1.01 |
| 500 | 1.05 ± 0.10 | 8.50 ± 1.29 | 5.08 ± 0.30 b | 4.98 ± 0.57 |
| 1000 | 0.89 ± 0.12 | 6.50 ± 1.73 | 6.19 ± 0.28 a | 5.29 ± 0.64 |
| 1500 | 0.83 ± 0.13 | 6.50 ± 1.29 | 5.27 ± 0.40 b | 5.64 ± 0.46 |
| 2000 | 0.81 ± 0.23 | 6.25 ± 1.89 | 5.16 ± 0.24 b | 5.21 ± 0.42 |
| DSH 5% | 0.34 | 3.49 | 0.71 | 1.44 |
Media ± desviación estándar. Medias con letras diferentes indican diferencia estadísticamente significativa (Tukey, P ≤ 0.05). DSH: diferencia significativa honesta.
Compuestos bioactivos
El pimiento morrón es un fruto de alto consumo en la dieta; por lo tanto, el incremento de compuestos bioactivos es de gran relevancia en la salud humana. Los resultados obtenidos muestran que la aplicación foliar de nHAp incrementó la biosíntesis de tales compuestos. Estos resultados coinciden con los de Schiavon et al. (2020). El mayor contenido de compuestos fenólicos correspondió a las dosis de 1000 a 2000 mg L-1, esta última superó en 30.03 % al testigo (Cuadro 2). Los flavonoides fueron afectados positivamente por los distintos tratamientos evaluados, la dosis más alta de nHAp presentó mayor concentración de estos compuestos, teniendo un incremento de 33.4 % con respecto al testigo. Magdaleno-García et al. (2023) señalaron que dosis altas de NPs inducen estrés oxidativo y estimulan la síntesis de compuestos no enzimáticos, como en este caso, donde el incremento de compuestos fenólicos y flavonoides se produce como una respuesta de la planta, probablemente para disminuir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) sin afectar sus procesos fisiológicos, tal como citan Hatamian et al. (2020).
Cuadro 2 Efecto de nHAp sobre el contenido de fenoles, flavonoides, Vitamina C y DPPH (capacidad antioxidante) en pimiento morrón.
| nHAp (mg L-1) | Fenoles (mg AGE 100 g-1 PF) | Flavonoides (mg QE 100 g-1 PF) | Vitamina C (mg 100 g-1 PF) | DPPH (uM equiv Trolox 100 g-1 PF) |
| Testigo | 134.85 ± 3.42 b | 117.94 ± 25.38 b | 156 ± 0 d | 88.594 ± 4.93 b |
| 500 | 140.23 ± 12.79 b | 126.34 ± 16.96 ab | 180 ± 0 b | 105.789 ± 3.36 a |
| 1 000 | 154.17 ± 10.51 ab | 120.44 ± 17.47 ab | 165 ± 16.5 c | 104.915 ± 1.45 a |
| 1 500 | 158 ± 26.00 ab | 128.92 ± 26.50 ab | 203.5 ± 11 a | 108.557 ± 1.93 a |
| 2 000 | 181.58 ± 26.53 a | 157.4 ± 41.92 a | 198 ± 0 a | 105.692 ± 0.65 a |
| DSH 5 % | 39.85 | 33.15 | 17.88 | 6.32 |
Media ± desviación estándar (DE, n= 20). Medias con letras diferentes indican una diferencia significativa (Tukey, P ≤ 0.05). DSH: diferencia significativa honesta.
Vitamina C
Las dosis de 1500 y 2000 mg L-1 presentaron el mayor contenido de vitamina C (ácido ascórbico) en los frutos (Cuadro 2), y superaron al testigo en 30.44 y 26.92 %, respectivamente. El pimiento es uno de los cultivos hortícolas con mayor contenido de vitamina C, tan solo el consumo de 100 g proporciona de 100 a 200 % el ácido ascórbico recomendado en la dieta nutrimental de la población (Moran et al., 2022). Investigaciones realizadas por Uresti-Porras et al. (2021) indicaron que las aplicaciones de dosis altas de NPs incrementan significativamente la concentración de ácido ascórbico en los frutos de pimiento, lo que representa mayor calidad nutrimental. El aumento en la vitamina C es debido a una estimulación por parte de las NPs en el aparato fotosintético, y de esta manera se protege de la alta radiación en los complejos captadores de luz, desarrollándose el ciclo de las xantofilas (Zhang et al., 2021). Este ciclo impide la formación de 1O2, lo que evita el daño oxidativo, participa en la defensa frente al estrés oxidativo biótico y abiótico debido a su función en la degradación del peróxido de hidrogeno a través del ciclo glutatión-ascorbato (Valverde et al., 2020). La capacidad antioxidante se conforma por compuestos hidrofílicos y lipofílicos, vitamina C, fenoles y flavonoides, y los segundos conformados por carotenoides y vitamina E. La actividad antioxidante de estos compuestos está relacionada con potenciales benéficos para la salud, al ayudar contra enfermedades crónicas.
Capacidad antioxidante
La aplicación foliar de las nHAp mejoró la capacidad antioxidante en los frutos de pimiento, el tratamiento de 1500 mg L-1 superó en 22.5 % al testigo (Cuadro 2). Los resultados encontrados en esta investigación son superiores a los encontrados por Sánchez-Mundo (2016), quienes establecieron que la capacidad antioxidante de pimiento morrón se ubicó entre 7.6 y 100 uM equiv Trolox 100 g-1 PF. Las ROS crean el estrés oxidativo que daña elementos celulares como lípidos y proteínas (Sabatino et al., 2021). La capacidad antioxidante está directamente relacionada con el contenido de fenoles totales (Báez et al., 2021); en esta investigación, los resultados de la aplicación de nHAp indicaron que ésta incrementó ambos compuestos, lo que a su vez aumenta la capacidad antioxidante de los frutos y potencialmente mejoraría la salud de la población (Benítez-Estrada et al., 2020).
Actividad enzimática
Catalasa
La enzima catalasa participa en la eliminación de las especies reactivas de oxígeno. En el presente estudio, la aplicación de las nHAp presentó una tendencia a modificar la actividad enzimática (Figura 1A). Numéricamente la mayor actividad de la enzima catalasa fue con la dosis de 500 mg L-1; sin embargo, en comparación con el testigo, resultó estadísticamente igual. La actividad enzimática es esencial en frutas y hortalizas, pues mantiene los niveles de ROS bajos, lo que previene el daño a las células debido a la peroxidación lipídica y la fuga a través de la membrana, esto mantiene la calidad de las frutas y hortalizas y el contenido de compuestos antioxidantes no enzimáticos (González-García et al., 2021).
Figura 1 Efecto de nHAp sobre A) la actividad enzimática de catalasa, y B) proteína total en fruto de pimiento morrón. Medias con la misma letra son iguales estadísticamente entre ellas (Tukey, P ≤ 0.05).
El efecto bioestimulante de las nHAp se atribuye a sus características físicas como tamaño, forma y estructura, el primer contacto entre las NPs y la planta es al momento de la aspersión foliar a nivel superficial donde entra en contacto directo con la pared y membrana celular, permite reacciones en cascada que provocan cambios en el cultivo como la expresión genética y modificaciones en la actividad enzimática, a través de la activación del sistema de defensa (Rivero-Montejo et al., 2021). En el caso de las nHAP el efecto bioestimulante puede deberse a que su suministro incrementa la concentración de calcio en el citosol, lo que activa la síntesis de proteínas ligadoras de calcio de la célula, que se relacionan con genes que estimulan la activación del sistema inmunológico, incrementando a su vez la tolerancia al estrés (Yang et al., 2021).
Proteínas
La aspersión foliar de nAHp afectó positivamente el contenido de proteína total en frutos de pimiento morrón (Figura 1B). La dosis de 1000 mg L-1 presentó mayor concentración superando en 63.63 % a los frutos de pimiento no tratados. Las proteínas totales se producen como parte de la adaptación de las plantas al ambiente; en este caso, se observó que las plantas estuvieron expuestas a un estrés ambiental con la aplicación de 1000 mg L-1, lo cual aumentó la concentración de proteínas o la activación del sistema antioxidante para la eliminación de las ROS presentes en las células (Yang et al., 2021); en cambio, en los tratamientos de 1500 y 2000 mg L-1 disminuyó el contenido total de proteínas, debido probablemente a una degradación por parte de las enzimas proteolíticas (López-Mendoza et al., 2023); en este caso, se puede atribuir a las calpaínas, las cuales se activan por la presencia de Ca+ (León, 2023; Com. Pers.)2, que es uno de los principales componentes en las nHAp. Estos resultados coinciden con los encontrados por Madanayake et al. (2021), quienes al aplicar dosis altas de nHAp en el cultivo de rábano, reportaron un menor el contenido de proteínas (3.9 %). ellas (Tukey, P ≤ 0.05).
Contenido de fósforo en el fruto
La aspersión foliar con nHAp, aumentó el contenido de fósforo en los frutos de pimiento morrón (Figura 2). Las dosis de 2000 y 1500 mg L-1 presentaron la mayor concentración. Estos resultados son similares a los reportados por De la Vega-García et al. (2020), al aplicar nHAp en el cultivo de frijol reportaron mayor contenido de fósforo a medida que incrementaron las dosis de nHAp. Los resultados obtenidos para esta variable se pueden explicar con la absorción y transporte de fósforo proveniente de nHAp, pues las partículas nanométricas entran fácilmente a los tejidos de la planta y se distribuyen hacia el fruto (De la Vega-García et al., 2020).
Conclusiones
La aspersión foliar de nanopartículas de hidroxiapatita no afectó el rendimiento en el cultivo de pimiento morrón, pero mejoró la calidad nutraceútica y acumulación de fósforo en los frutos. Las dosis altas incrementaron los compuestos biactivos y fósforo en los frutos de pimiento morrón, pero disminuyeron la actividad enzimática. La aspersión foliar con nanopartículas de hidroxiapatita estimula la biosíntesis de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos en los frutos de pimiento morrón.
