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Introducción
La familia Orchidaceae es la segunda familia más grande de plantas con flores (Fatahi et al., 2023) y actualmente cuenta con más de 30,000 especies (Nongdam et al., 2023) que se han diversificado con éxito en distintos hábitats de todo el mundo, pero la mayoría se concentran en áreas tropicales y subtropicales (Djordjević y Tsiftsis, 2022). Las orquídeas poseen características particulares muy especializadas que incluyen la estructura de sus flores y raíces, sus mecanismos de polinización y las interacciones ecológicas establecidas con otras plantas, insectos, hongos o bacterias (Castillo-Pérez et al., 2019). Es uno de los grupos de plantas mejor conocidas en el mercado mundial de la floricultura (Hinsley et al., 2018) y representan alrededor del 10 % del comercio internacional de flores (Tejeda-Sartorius et al., 2018).
En México existen más de 1200 especies de orquídeas (Otero-Colina et al., 2021), de las cuales el 40 % son endémicas (Beltrán-Nambo et al., 2018). En el estado de Veracruz se reportan 432 especies de orquídeas, que corresponden al 36 % de la riqueza nacional, así como tres especies endémicas (Baltazar-Bernal et al., 2023).
Rhyncholaelia glauca es una orquídea silvestre, epífita, de extraordinario valor ornamental, que se distribuye en los estados de Veracruz, Chiapas y Oaxaca, México; sin embargo, el saqueo y comercio ilegal, la alteración de su hábitat, así como la baja tasa de germinación en la naturaleza han provocado que hoy en día se encuentre catalogada como una especie amenazada en el Apéndice II (Anexos IA y B) de la CITES (Soto et al., 2008).
Por otro lado, las comunidades locales tienen derecho a cosechar con fines culturales, pero todas las ventas requieren un permiso emitido por el gobierno (SEMARNAT, 2013); sin embargo, muy pocos vendedores tienen permisos; en este sentido, la aplicación de la ley es deficiente y hay crecientes preocupaciones de conservación (Ticktin et al., 2020). Por tal motivo, es de vital importancia llevar a cabo acciones estratégicas que solucionen la dificultad asociada con el estado de vulnerabilidad de Rhyncholaelia glauca. Una alternativa son las técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro.
La germinación in vitro de semillas de orquídeas permite la producción de plántulas rápida y a gran escala (Anghelescu et al., 2023) de especies vegetales de importancia económica, ecológica, amenazadas o en vías de extinción; además, es una opción económicamente viable para la conservación eficiente de la biodiversidad y del acervo genético (Twaij et al., 2020). Hasta la fecha, no existen reportes sobre la morfogénesis in vitro de esta especie. Con el propósito de coadyuvar a la preservación y empleo sostenible de esta orquídea de lento crecimiento, esta investigación tuvo como propósito establecer un protocolo para la organogénesis directa de brotes de R. glauca a partir de plántulas germinadas in vitro.
Materiales y métodos
Material vegetal y desinfección
Cápsulas maduras cerradas proporcionadas por la unidad de manejo para la conservación de la vida silvestre (UMA) “Vivero Gardenias”, ubicada en Fortín de las Flores, Veracruz, México fueron lavadas con agua y jabón comercial (Roma®) durante 5 min y se enjuagaron con agua de la llave; posteriormente, fueron tratadas con etanol 70 % durante 1 min en la campana de flujo laminar y se enjuagaron con agua destilada; después, se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio comercial (NaOCl, Cloralex®) 30 % v/v, plata coloidal estable (Microdyn®) 1 % y Tween® 20 4 % por 15 min, se enjuagaron con agua destilada esterilizada y finalmente se introdujeron en una solución de Captan® (4 g L-1) durante 15 min.
Medio de cultivo y condiciones de incubación
En todos los experimentos se utilizó el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 30 g L-1 de sacarosa y 9 g L-1 de agar (Merck®). El pH se ajustó en un potenciómetro (Thermo Scientific® Modelo Orion 3 Star, Waltham, Massachusetts, EUA) a 5.7 con hidróxido de sodio (NaOH) o ácido clorhídrico (HCl) 1 N. El medio de cultivo se esterilizó durante 20 min a 121 °C en una autoclave vertical (AESA® 300, Stolberg, Alemania). Los frascos conteniendo el explante se mantuvieron a 26 ± 2 °C y 16 h de fotoperiodo con intensidad lumínica de 45 μmol m-2 s-1.
Germinación in vitro
Las semillas se extrajeron de las cápsulas desinfectadas y se establecieron en medio MS al 50 % de su concentración con 6-benciladenina (BA, 0.5 y 1.0 mg L-1) combinada con ácido 1-naftalenacético (ANA, 0.1 y 0.2 mg L-1), un testigo sin reguladores de crecimiento y adicionado o no con 0.5 g L-1 de carbón activado. Se vertieron 30 mL de medio de cultivo en frascos de vidrio de 90 mL de capacidad. Al cabo de 10 semanas se cuantificó el porcentaje de germinación, inicio de germinación (dds) y término de germinación (dds). Para la identificación de las variables se consideró la descripción de estadios descritos y adaptados de acuerdo con Vasudevan y Staden (2010). El porcentaje de germinación se calculó marcando cuatro zonas distribuidas al azar en el frasco de cultivo y en cada zona se contabilizaron 50 semillas, luego se dividió el número de semillas germinadas entre el total de semillas contabilizadas. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 10 repeticiones y se consideró como unidad experimental un frasco con 200 semillas sembradas.
Organogénesis directa
Inducción de brotes
Se sembraron plántulas germinadas in vitro de 1-2 cm de altura en medio de cultivo MS adicionado con BA (1.0, 2.0, 2.5 y 3.0 mg L-1) combinado con ANA (0.25 y 0.50 mg L-1). Todos los tratamientos fueron adicionados con carbón activado (1.0 g L-1). Se vertieron 15 mL del medio de cultivo en frascos de vidrio de 45 mL de capacidad. Se llevó a cabo un subcultivo a medio fresco con los mismos tratamientos a las cinco semanas. Al cabo de 10 semanas de cultivo, se registró el número de brotes por explante (BE), longitud de brotes (LB) en cm y porcentaje de brotación (%). Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 17 repeticiones, y como unidad experimental un frasco con dos plántulas.
Multiplicación de brotes
Se cultivaron brotes de 1.5 a 2 cm de longitud en medio MS (50 y 100 %) con BA (2.0, 2.5 y 3.0 mg L-1) en combinación con ANA o AIA (0.5 mg L-1). Todos los tratamientos fueron adicionados con carbón activado (0.5 g L-1). Se vertieron 15 mL de medio de cultivo en frascos de vidrio de 45 mL de capacidad y se procedió a hacer un subcultivo a medio fresco con los mismos tratamientos a las cinco semanas. Al cabo de diez semanas de cultivo, se registró el número de brotes por explante (BE), longitud de brotes (LB) en cm y porcentaje de brotación (%). Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 10 repeticiones, y como unidad experimental un frasco con dos plántulas.
Alargamiento de brotes
Se transfirieron grupos de brotes de 1 cm en medio MS (50 y 100 %) adicionado o no con 0.5 g L-1 de carbón activado. Se vertieron 30 mL de medio de cultivo en frascos de vidrio de 90 mL de capacidad y se realizó un subcultivo a medio fresco con los mismos tratamientos a las cinco semanas. Luego de 10 semanas se registró la longitud de brotes (LB) en cm y el número de brotes por explante (BE). Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 10 repeticiones, y como unidad experimental un frasco con tres grupos de brotes.
Análisis estadístico
Con los datos obtenidos se calculó el valor medio y la desviación estándar (D.E.). Para determinar diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos se realizó análisis de varianza y para la comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey (P ≤ 0.05) con el software SAS versión 9.3 (SAS Institute, 2013). Previo al análisis, los valores de porcentaje se transformaron mediante la raíz cuadrada.
Resultados y discusión
Desinfección y germinación in vitro
La desinfección superficial de cápsulas cerradas de R. glauca resultó exitosa al obtener un cultivo 100 % aséptico. El porcentaje de germinación más alto (90.48 %) se obtuvo en medio MS con 50 % de concentración de sales, sin reguladores de crecimiento, después de 10 semanas de cultivo (Cuadro 1).
Cuadro 1 Germinación in vitro (%) de semillas de Rhyncholaelia glauca inducida con 6-benciladenina (BA), ácido 1-naftalenacético (ANA) y carbón activado (CA) a las 10 semanas de cultivo.
| Adicionados al medio de cultivo | Germinación (%) | D.E. | ||
| BA (mg L-1) | ANA (mg L-1) | CA (g L-1) | ||
| 0.0 | 0.0 | 0.0 | 90.48 a | 2.25 |
| 0.5 | 0.0 | 0.0 | 8.72 i | 2.48 |
| 0.5 | 0.1 | 0.0 | 11.37 hi | 3.86 |
| 0.5 | 0.2 | 0.0 | 31.41 f | 6.91 |
| 1.0 | 0.0 | 0.0 | 13.57 ghi | 3.64 |
| 1.0 | 0.1 | 0.0 | 24.57 fg | 2.95 |
| 1.0 | 0.2 | 0.0 | 21.12 efgh | 4.99 |
| 0.0 | 0.0 | 0.5 | 89.90 a | 5.58 |
| 0.5 | 0.0 | 0.5 | 64.20 cd | 2.35 |
| 0.5 | 0.1 | 0.5 | 55.45 e | 6.50 |
| 0.5 | 0.2 | 0.5 | 69.50 bc | 6.45 |
| 1.0 | 0.0 | 0.5 | 60.00 cde | 8.21 |
| 1.0 | 0.1 | 0.5 | 52.50 e | 16.92 |
| 1.0 | 0.2 | 0.5 | 78.50 b | 11.89 |
Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). BA: 6-bencil adenina, ANA: ácido naftalenacético, CA: carbón activado, D.E.: desviación estándar.
Cuadro 2 Porcentaje de brotación (B), número de brotes por explante (BE), longitud de brotes (LB) e inducidos en plántulas de Rhyncholaelia glauca con 6-benciladenina (BA) y ácido 1-naftalenacético (ANA) a las 10 semanas de cultivo.
| Adicionados al medio | B (%) | D.E. | BE (Núm.) | D.E. | LB (cm) | D.E. | |
| BA (mg L-1) | ANA (mg L-1) | ||||||
| 0.0 | 0.0 | 38.87 c | 6.85 | 1.01 b | 0.27 | 0.36 a | 0.04 |
| 1.0 | 0.25 | 64.77 ab | 11.0 | 2.24 b | 0.65 | 0.34 a | 0.005 |
| 1.0 | 0.50 | 49.99 bc | 7.20 | 1.59 b | 0.21 | 0.35 a | 0.01 |
| 2.0 | 0.25 | 57.08 ab | 3.40 | 1.70 b | 0.38 | 0.37 a | 0.02 |
| 2.0 | 0.50 | 58.82 ab | 6.35 | 1.77 b | 0.41 | 0.37 a | 0.01 |
| 2.5 | 0.25 | 53.39 bc | 3.98 | 1.56 b | 0.43 | 0.35 a | 0.01 |
| 2.5 | 0.50 | 71.17 a | 7.76 | 2.48 a | 0.77 | 0.34 a | 0.01 |
| 3.0 | 0.25 | 54.90 abc | 7.96 | 2.02 b | 0.90 | 0.37 a | 0.01 |
| 3.0 | 0.50 | 63.86 ab | 9.09 | 1.74 b | 0.22 | 0.37 a | 0.02 |
Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). BA: 6-bencil adenina, ANA: ácido naftalenacético, D.E.: desviación estándar.
Las semillas de orquídeas pueden germinar en un medio basal con una baja concentración de sales sin reguladores de crecimiento, como se demostró para R. glauca. Así también, para las especies Acianthera prolifera, Laelia rubescens (Koene et al., 2019; Mayo-Mosqueda et al., 2020) y el híbrido intergenérico Vanda stangea × P. hygrochila (Devi et al., 2023), donde el medio MS con 50 % de concentración de sales sin reguladores de crecimiento produjo un porcentaje de germinación de 74, 85.2 y 80 %, respectivamente.
La germinación comenzó a los 10 días después de la siembra y finalizó a los 30 días con la formación del embrión. A la décima semana se observó alargamiento del protocormo, con presencia de primordio foliar y rizoides (Figura 1A).
Figura 1 Germinación in vitro y organogénesis directa de Rhyncholaelia glauca. A) etapas de la germinación durante 10 semanas, B) plántulas in vitro empleadas como explantes para la organogénesis, C) inducción de brotes con 2.5 mg L -1 de BA y 0.5 mg L -1 de ANA a las 10 semanas, D) inducción de brotes en medio MS sin reguladores de crecimiento (testigo) a las 10 semanas, E) multiplicación de brotes con 3.0 mg L -1 de BA y 0.5 mg L -1 de AIA a las 10 semanas, F) multiplicación de brotes con medio MS al 50 % sin reguladores de crecimiento a las 10 semanas, G) crecimiento de brotes en medio MS al 50 % con 0.5 g L -1 de carbón activado después de 10 semanas, H) crecimiento de brotes en medio MS completo sin carbón activado después de 10 semanas.
El tiempo requerido para la germinación de semillas de orquídeas es variable entre las especies. En este estudio se obtuvieron plántulas de R. glauca de 2 cm de longitud con tres a cuatro hojas y raíces a las 25 semanas después de la siembra (Figura 1B). Por otra parte, se ha reportado que para Dendrobium strebloceras se logró el desarrollo de plántulas a las 24 semanas de siembra (Diantina et al., 2020) y para Sedirea japonica se logró el desarrollo de plántulas a las 28 semanas después de la siembra (An et al., 2021).
Inducción de brotes
Se observó brotación en la totalidad de los tratamientos. El máximo número de brotes por explante (2.48) se registró en medio MS con 2.5 mg L-1 de BA y 0.5 mg L-1 de ANA a las 10 semanas de cultivo (Figura 1C), comparado con el medio MS sin reguladores de crecimiento (testigo) que produjo 1.01 brotes (Figura 1D). En cuanto a la longitud de brotes no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos.
Los brotes con una coloración verde claro comenzaron a formarse en la base de los explantes. Después de cinco semanas de cultivo se observaron brotes con primordio foliar. A la décima semana de cultivo los brotes presentaron de dos a tres hojas formadas de color verde intenso y longitud máxima de 0.37 cm.
Se ha reportado que el equilibrio de citocinina y auxina desempeña un papel importante en la inducción de brotes in vitro en orquídeas. En Cyrtopodium paludicolum se obtuvieron 5.24 brotes por explante con BA y ANA, ambos a la concentración de 0.51 mg L-1(Ferreira et al., 2022). En Cattleya maxima se consiguieron 1.8 brotes por explante con 0.1 mg L-1 de BA y 0.5 mg L-1 de ANA (Vilcherrez-Atoche et al., 2020) y en Catasetum macrocarpum se alcanzaron 4.1 brotes por explante con 1 mg L-1 de BA (Ferreira et al., 2018); sin embargo, los resultados de esta investigación y la amplia evidencia en la literatura demuestran que los efectos promotores del crecimiento de los reguladores de crecimiento vegetal son específicos para cada especie e híbrido.
Multiplicación de brotes
Los tratamientos evaluados favorecieron distintas tasas de brotación (Cuadro 3). El mayor número de brotes por explante fue de 3.1 con 3 mg L-1 de BA y 0.5 mg L-1 de AIA en medio MS completo a las 10 semanas Figura 1E), en contraste con el medio MS al 50 % sin reguladores de crecimiento que produjo 0.70 brotes (Figura 1F). La mayor longitud de brote fue de 0.46 cm con 2.5 mg L-1 de BA y 0.5 mg L-1 de AIA en medio MS completo. Se observó la formación de brotes en la base del explante a la tercera semana de cultivo.
Cuadro 3 Porcentaje de brotación (B), número de brotes por explante (BE) y longitud de brotes (LB) inducidos en plántulas de Rhyncholaelia glauca con concentraciones del medio MS, 6-benciladenina (BA), ácido 1-naftalenacético (ANA) y ácido indolacético (AIA) a las 10 semanas de cultivo.
| nados al medio de cultivo | B (%) | D.E. | BE (Núm.) | D.E. | LB (cm) | D.E. | |||
| MS (%) | BA (mg L-1) | ANA (mg L-1) | AIA (mg L-1) | ||||||
| 50 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 23.3 d | 7.67 | 0.70 e | 0.48 | 0.39 b | 0.03 |
| 50 | 2.0 | 0.5 | 0.0 | 29.9 cd | 7.53 | 1.20 cde | 0.63 | 0.41 ab | 0.06 |
| 50 | 2.0 | 0.0 | 0.5 | 36.6 cd | 10.53 | 1.50 cde | 0.52 | 0.39 ab | 0.07 |
| 50 | 2.5 | 0.5 | 0.0 | 33.3 cd | 7.48 | 1.40 cde | 0.51 | 0.38 ab | 0.04 |
| 50 | 2.5 | 0.0 | 0.5 | 39.9 bcd | 16.66 | 1.60 cde | 0.84 | 0.33 ab | 0.05 |
| 50 | 3.0 | 0.5 | 0.0 | 29.9 cd | 7.53 | 1.30 cde | 0.67 | 0.40 ab | 0.06 |
| 50 | 3.0 | 0.0 | 0.5 | 40.3 bcd | 17.56 | 1.90 bcd | 0.87 | 0.41 ab | 0.07 |
| 100 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 26.6 d | 7.59 | 0.90 de | 0.56 | 0.45 ab | 0.05 |
| 100 | 2.0 | 0.5 | 0.0 | 36.6 cd | 10.53 | 1.60 bcde | 0.69 | 0.45 a | 0.05 |
| 100 | 2.0 | 0.0 | 0.5 | 49.9 bcd | 17.50 | 2.10 abc | 0.73 | 0.43 ab | 0.04 |
| 100 | 2.5 | 0.5 | 0.0 | 36.6 bcd | 14.05 | 1.70 bcde | 0.67 | 0.41 ab | 0.07 |
| 100 | 2.5 | 0.0 | 0.5 | 59.9 ab | 14.02 | 2.60 ab | 0.51 | 0.46 a | 0.05 |
| 100 | 3.0 | 0.5 | 0.0 | 36.6 cd | 10.53 | 1.90 bcd | 0.73 | 0.40 ab | 0.06 |
| 100 | 3.0 | 0.0 | 0.5 | 73.3 a | 14.00 | 3.10 a | 0.57 | 0.43 ab | 0.07 |
Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). MS: medio Murashigue y Skoog, BA: 6-bencil adenina, ANA: ácido naftalenacético, AIA: ácido indolacético, D.E.: desviación estándar.
Aunque no existen reportes anteriores sobre la multiplicación in vitro en Rhyncholaelia glauca, diversos estudios han demostrado el efecto significativo de las proporciones de citocinina y auxina para promover la formación de brotes múltiples en orquídeas. Subrahmanyeswari et al. (2022) lograron 12 brotes por explante en la multiplicación de brotes en Dendrobium Yuki White con 0.5 mg L-1 de BA y 0.1 mg L-1 de ANA. En Oeceoclades maculata, Viana et al. (2022) obtuvieron un máximo de 0.87 brotes por explante con 2 mg L-1 de BA y 0.5 mg L-1 de ANA, y en Dendrobium moniliforme la dosis de 1 mg L-1 de BA y ANA produjo el mayor coeficiente de proliferación de brotes (6.1) (Liu et al., 2023).
La concentración adecuada de citocinina y auxina para estimular la brotación difiere en cada especie, ya que las respuestas dependen de muchos factores, como la especie, el tejido u órgano usado y el estado fisiológico del explante (Purwanto et al., 2023).
El medio MS completo produjo el mayor número de brotes en Rhyncholaelia glauca, lo que concuerda con lo reportado por Mora-Cruz et al. (2023) donde el medio MS completo favoreció el número de brotes por explante (2.03), a diferencia del medio MS al 50 % en Prosthechea vitellina. Esto podría explicarse porque el medio MS al 100 % posee una composición que ya contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo de las plantas en comparación con la reducción de nutrientes del medio MS al 50 % (Turang et al., 2023).
Alargamiento de brotes
La máxima longitud de brotes fue de 1.20 cm en medio MS al 50 % de sales con 0.5 mg L-1 de carbón activado a las 10 semanas (Figura 1G, Cuadro 4) comparado con el MS completo sin carbón activado (Figura 1H). La mayor cantidad de brotes por explante (1.6) se obtuvo en medio MS completo con 0.5 mg L-1 de carbón activado.
Cuadro 4 Longitud de brotes (LB) y número de brotes por explante (BE) en Rhyncholaelia glauca a las 10 semanas de cultivo en dos concentraciones de MS y CA.
| MS (%) | CA (g L-1) | LB (cm) | D.E. | BE (Núm.) | D.E. |
| 100 | 0.0 | 0.85 b | 0.02 | 1.40 ab | 0.51 |
| 100 | 0.5 | 0.88 b | 0.08 | 1.60 a | 0.52 |
| 50 | 0.0 | 0.90 b | 0.09 | 0.80 b | 0.42 |
| 50 | 0.5 | 1.20 a | 0.22 | 1.10 ab | 0.56 |
Medias con letras iguales en las columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). MS: medio Murashigue y Skoog, CA: carbón activdo, DE: desviación estándar.
El carbón activado es empleado en las técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro para mejorar el desarrollo celular, ya que desempeña un papel crucial en la adsorción de toxinas o compuestos inhibidores en los medios de cultivo, promoviendo una mayor elongación y enraizamiento; sin embargo, la concentración debe adaptarse a diferentes especies de plantas (Navarro et al., 2023).
Se han publicado diversos estudios en otras especies de orquídeas, donde se ha evaluado el efecto de la concentración del medio MS y la adición de carbón activado. En el caso de Encyclia cordigera, Baltazar-Bernal et al. (2022) reportaron que con el medio MS al 25 % adicionado con carbón activado (1.5 g L-1) se obtuvo la mayor longitud de plántula (1.53 cm); y para Cattleya warneri, el medio MS al 50 % adicionado con carbón activado (3 g L-1) produjo mejores respuestas en la fase de elongación y enraizamiento (Navarro et al., 2023).
Los resultados de esta investigación demostraron que el medio MS al 50 % no limita el crecimiento de brotes de R. glauca, lo cual concuerda con los resultados obtenidos por Flores-Hernández et al. (2017), donde el medio MS al 50 % promovió la mayor longitud de brote en comparación con el medio MS al 100 %, y por Frausto et al. (2019), donde el medio MS al 50 % mejoró la viabilidad y supervivencia de explantes de vara floral en Phalaenopsis en comparación con el medio MS al 100 %. Es importante destacar que, aunque el medio MS al 100 % es un medio muy completo, contiene una alta cantidad de sales que pueden provocar efectos negativos en ciertas especies que requieren concentraciones de iones más bajas. Las orquídeas tienen un bajo requerimiento mineral, ya que han evolucionado en algunos aspectos que les ayudan a sobrevivir en medios con poca disponibilidad de agua y nutrientes (Frausto et al., 2019); por lo tanto, usar la composición adecuada del medio MS (Murashige y Skoog, 1962) puede aumentar el crecimiento de las plantas (Turang et al., 2023).
Conclusiones
La mayor respuesta de germinación in vitro de semillas de R. glauca se obtuvo sin la adición de reguladores de crecimiento vegetal. Se lograron plántulas de 2 cm de longitud para ser utilizadas como explantes entre las 24 y 30 semanas después de la siembra. Se desarrolló un protocolo eficiente para la inducción de organogénesis directa a partir de plántulas germinadas in vitro, en el que el número más alto de brotes se consiguió con 3 mg L-1 de BA y 0.5 mg L-1 de AIA. El mayor alargamiento de plántulas se logró con la mitad de la concentración de sales MS y 0.5 g L-1 de carbón activado. Esta investigación sienta las bases para la propagación, preservación y uso sostenible de esta especie de lento crecimiento con el fin de mitigar su estatus de vulnerabilidad.
