Introducción

A nivel internacional, el cultivo de fresa (Fragaria x ananassa) ocupa un lugar importante por su excelente rentabilidad y características nutricionales (^{Thakur et al., 2015}; ^{Yadav et al., 2017}). Sin embargo, su producción presenta limitantes ya que es susceptible a gran número de fitopatógenos. Esto promueve el uso extensivo de pesticidas, provocando daños a salud humana y medio ambiente (^{Moura et al., 2021}).

Por lo anterior, actualmente los sistemas agrícolas requieren estrategias sostenibles de manejo sanitario y productivo (^{Kumar et al., 2016}). Una estrategia agroecológica para disminuir la aplicación de productos químicos en la agricultura y favorecer prácticas agrícolas sostenibles es el uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPB, por sus siglas en inglés) e inductoras de resistencia a patógenos (^{Bhattacharyya et al., 2016}; ^{Trabelsi y Mhamdi, 2013}). La interacción planta - PGPB - ambiente, favorece de manera directa la absorción de nutrientes promueve el vigor de planta y reduce la predisposición a fitopatógenos.

Diversos estudios han demostrado los beneficios de PGPB en diferentes especies frutales como cerezas, cítricos, arándanos manzanas frambuesas y moras (^{Ortiz-Galeana et al., 2018}). ^{Esitken et al. (2010}), estudiaron el efecto de tres cepas de bacterias (PGPB), Pseudomonas BA-8, Bacillus OSU-142 y Bacillus M-3; de manera individual y en consorcios, en cultivo de frambuesa. Se detectó un buen rendimiento y desarrollo de fruto, aumento de macronutrientes, principalmente P y Zn en tejido foliar. Asimismo, De Melo et al. (2012), caracterizaron comunidades bacterianas endófitas en frutos de fresa (Fragaria x ananassa). Se identificó a Curtobacterium citreum, Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Bacillus subtilis, Bacillus sp., Enterobacter ludwigii, Lactobacillus plantarum, y Pantoea punctata, con capacidad de producir sideróforos y equivalentes de IAA (acido 3 indolacético); sin embargo, la capacidad de fijar nitrógeno solo la presentaron especies de los géneros Pseudomonas y Enterobacter. ^{Moura y colaboradores (2021}), identificaron cinco cepas del género Bacillus sp. y una de Pantoea, endófitas en plantas de fresa, productoras de compuestos antifúngicos contra Botrytis cinerea, causante de la enfermedad pudrición gris. Recientemente se estudió la composición taxonómica y funcional del microbioma de tres genotipos comerciales de fresa en condiciones de campo (^{Sangiorgio et al., 2022}). Se comprobó la capacidad promotora del crecimiento vegetal de las bacterias nativas, in silico e in vitro. Las bacterias identificadas correspondieron a las clases Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria y Bacteroidia. La tendencia actual por comprender los mecanismos funcionales de bacterias PGPB en cultivos comerciales tiene como premisa que estas bacterias pueden contribuir a disminuir el uso de fertilizantes e ingredientes activos químicos (p.e. fungicidas). Esta visión se adhiere a objetivos globales de promover prácticas agroecológicas sostenibles (Sangiorgio et al., 2022).

En México, el cultivo de fresa se produce principalmente en Michoacán, Guanajuato y Baja California (SADER, 2023). Recientemente, con el fin de mitigar los fuertes impactos de plagas y fitopatógenos en estas entidades, el estado de Sinaloa ha incrementado significativamente la producción, principalmente en el municipio de Ahome, a pesar de su limitante climatológica para el cultivo (i.e., clima extremoso) (SADER, 2023). No obstante, la experiencia adquirida por productores locales ha logrado que la producción de fresa sea reconocida en el mercado local y nacional por su alta calidad; convirtiéndose además en una alternativa generadora de empleos, principalmente para el sector femenino.

Actualmente no se conocen estudios relacionados con PGPB en el cultivo de fresas orgánicas en la región. En consecuencia, el objetivo de esta investigación fue aislar e identificar bacterias endófitas en plantas de fresa cultivadas (Fragaria x ananassa) en condiciones orgánicas y evaluar in vitro la capacidad de las bacterias de producir metabolitos relacionados con promoción de crecimiento vegetal. Lo anterior aportaría un recurso biotecnológico de bacterias PGPB como potencial alternativa sostenible en Sinaloa, México.

El material experimental consistió en plantas de fresa variedad Chanler, establecidas como cultivo orgánico, al final del ciclo de producción otoño-invierno 2023-2024 en terrenos del ejido Nueve de Diciembre, localizado en el municipio de Ahome, Sinaloa; México (25°49′50″N 109°46′00″O; HR promedio mensual 70 %; meses más cálidos 36.1

°C y 41.1 °C). El muestreo se realizó en zig zag al azar, utilizando material estéril (guantes, tijeras pinzas). Se colectaron 25 plantas asintomáticas, las cuales se trasladaron al laboratorio de Biotecnología de la Universidad Autónoma de Occidente, unidad regional Guasave, Sinaloa; para su procesamiento. Se integraron muestras compuestas de tejido foliar, raíz, tallo y fruto. Se realizó lavado y desinfestación con etanol al 70 % y solución de hipoclorito de sodio al 1 % durante 10 min y Tween-80 al 10 % (v/v), finalizando con lavados de agua destilada estéril. El aislamiento de bacterias se realizó por la técnica de contacto directo, realizando cortes transversales y longitudinales al tejido en condiciones asépticas, estableciendo el corte de cara al medio de cultivo Agar nutritivo/caja Petri. Se Las siembras se incubaron a 27 °C durante ocho días (^{Yang et al., 2011}). El bioensayo se realizó por triplicado para cada tipo de tejido. Para confirmar la eficiencia del proceso de esterilización del tejido analizado se tomaron alícuotas de agua destilada estéril utilizadas en el enjuague final del tejido, las cuales se sembraron en cajas Petri con Agar nutritivo e incubadas bajo las mismas condiciones previamente descritas. Se confirmó la ausencia de crecimiento microbiano. La morfología bacteriana colonial se analizó en estereoscopio digital marca Leica. A partir de colonias madre se realizó purificación a las 48 h, hasta obtener colonias con características morfológicas similares. Posterior a cuatro rondas de purificación, se obtuvieron 25 aislados en total, de los cuales 10 aislados fueron incultivables. La densidad poblacional se calculó por conteo directo en placa (UFC g-1), seleccionando aquellas cepas que se distinguían por prevalencia, tamaño, forma y color.

Para la caracterización molecular se aisló el ADN genómico de las cepas bacterianas, amplificando el gen 16S ADNr con los oligonucleótidos específicos F2C (5’- AGAGTTTGATCATGGCTC-3’) y C (5’-ACGGGCGGTGTGTAC-3’) (^{Shi et al., 1997}).

Los productos de PCR se purificaron y secuenciaron en el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO) en CINVESTAV-IPN; las secuencias obtenidas fueron sometidas a búsquedas GenBank del Centro Nacional de Biotecnología de los Estados Unidos (NCBI) con el programa BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Las inferencias filogenéticas se obtuvieron con el método Neighbor Joining basado en el modelo kimura-2-parámetros con prueba bootstrap

1.000 réplicas con el programa MEGA X.

Se realizaron evaluaciones in vitro por triplicado para la identificación de potenciales bacterias PGPB, utilizando como control positivo la cepa Bacillus cereus (B25) (Figueroa- López et al., 2016). La producción de sideróforos se evaluó en medio Agar de Cromo Azurol S (CAS) (^{Schwyn y Neilands, 1987}); considerando positiva aquellas colonias con la formación de un halo amarillo/naranja alrededor de la colonia; la evaluación de quitinasas se realizó de acuerdo con ^{Shanmugaiah et al. (2008}); se consideró positiva la formación de una zona clara alrededor de la colonia bacteriana; pasado cinco días de crecimiento; en placas de agar-^{Pikosvkaya, se evaluó la capacidad de solubilización de fosfato (Pikosvkaya, 1948}); considerándose colonias positivas aquellas con zona clara alrededor de la colonia.

Resultados de esta investigación se basaron en 15 cepas endófitas aisladas de tejido foliar, raíz, tallo y fruto de plantas de fresa. Estas cepas, presentaron diferente morfología en cuanto a borde, forma, color y superficie (Figura 1). La densidad poblacional de bacterias mostró variaciones significativas entre los tejidos, con valores elevados en raíz (3.0 x 1010 g-1 raíz), seguido de tallo (1.0 x 1010 g-1 tallo), fruto (1.0 x 1010 g-1 fruto) y foliar (1.3 x 109 g-1 hoja).

Figura 1 Morfología colonial in vitro de bacterias endófitas aisladas de raíz, tallo, hojas y fruto de plantas de fresa (Fragaria x ananassa) cv Chanler, visualizadas en estereoscopio digital a 48 h de crecimiento en Agar nutritivo. Notar diferente morfología: bordes lisos, traslúcidos, forma circular, superficie brillosa, coloración. 

Estos resultados confirman la presencia de endófitos en diferentes tejidos de la planta, coincidiendo con lo reportado por ^{Porras-Alfaro y Bayman, (2011}) y ^{Sahoo et al. (2017}), los cuales atribuyen la mayor densidad de bacterias en raíz debido a que está en contacto directo con el suelo, lo que favorece la colonización. Los aislados fueron identificados por tejido origen (R: raíz, T: tallo; H: hoja y F: fruto), con numeración consecutiva. El análisis de las secuencias permitió identificar géneros bacterianos con un 98 % de similitud con secuencias de referencia en la base de datos. La mayoría se asociaron al phylum Firmicutes predominando aislados del género Bacillus (Figura 2). Aislados obtenidos de raíz, tallo, hoja y fruto fueron identificados como B. cereus R5 (PV583387), T6 (PV583388), T7 (PV583389), H8 (PV583390), T9 (PV583391) y F10 (PV583392); tres aislados de raíz se

identificaron como B. subtilis R1 (PV583383), R2 (PV583384), R3 (PV583385); y uno como B. xiamenensis R4 (PV583386); Bacillus thuringiensis T11 (PV583393), R14 (PV583396); B. zanthoxyli R12 (PV583394); Shimwellia blattae H13 (PV583395), y Burkholderia tropica F15 (PV583397). Los bioensayos de actividad promotora de crecimiento vegetal in vitro mostraron que B. cereus, B. subtilis, y B. thuringiensis, presentaron capacidad de producir sideróforos, solubilizar fosforo y actividad de quitinasa (Cuadro 1).

Figura 2 Dendograma obtenido con al algoritmo Neighbor-Joining a partir de secuencias del gen que codifica la subunidad 16S del ADNr obtenidas de bacterias endófitas aisladas de plantas de fresa (Fragaria x ananassa), variedad Chanler, de cultivos comerciales orgánicos. Municipio de Ahome, Sinaloa, México. Los aislados obtenidos en esta investigación se identifican con siglas y numeral: R-n: raíz, T-n: tallo; H-n: hoja y F-n: fruto. 

Los resultados obtenidos contrastan con estudios realizados en arándano donde se reporta a Pantoea, Pseudomonas, Burkholderia y Bacillus como los géneros más abundantes. Análogo a este trabajo, se demostró que algunas cepas de Bacillus tuvieron mayor producción de fitohormonas y sideróforos que su control positivo, la rizobacteria Pseudomonas fluorescens UM270 (^{Ortiz-Galeana et al., 2018}).

El género Bacillus presenta una gran adaptación a diferentes condiciones ambientales por su amplia diversidad genética, por lo que se utiliza como referente en la comprensión de procesos metabólicos. Los resultados muestran que las cepas (R1, R2, R3) de B. subtilis tuvieron alta capacidad de solubilización de fosfatos, producción de sideróforos y quitinasa (Cuadro 1), coincidiendo con otros estudios donde se considera endófito de gran interés, ya que la colonización de raíces favorece el desarrollo de mecanismos de biocontrol importantes en enfermedades bióticas y abióticas (^{Corrales-Ramírez et al., 2017}; ^{Gond et al., 2015}). Sin embargo, en este trabajo, B. cereus fue aislada de los diversos órganos analizados (raíz, tallo, hoja y fruto), lo cual sugiere mayor adaptabilidad, mostrando características metabólicas análogas a B. subtilis (Cuadro1). Esto coincide con reportes en arroz donde fue aislada como endófito, mostrando alta capacidad de promover crecimiento vegetal, así como la movilización de fosfato lo que permite captarlo de manera insoluble y liberarlo, estimulando la fertilidad de los suelos (^{Chamorro-Anaya et al., 2020}). No obstante, algunas cepas de B. subtilis y B. cereus se han asociado con riesgos a la salud humana, y el primero se ha relacionado con la pudrición blanda en ajo (Allium sp.) por lo que es un factor que debe considerarse en futuros desarrollos biotecnológicos (https://microbenotes.com/bacillus-subtilis/).

La cepa B. zanthoxyli aislada de raíz, presentó capacidad de solubilización de fosfato y producción de sideróforos, coincidiendo con trabajos realizados en cultivos de tomate y pimiento, donde confiere resistencia a la infección causada por Ralstonia solanacearum y Phytophthora capsici, además de favorecer el desarrollo en plantas de pepino, tomate y repollo, al incrementar brotes y crecimiento de raíces (^{Usmonov et al., 2021}). Burkholderia tropica en este trabajo se aisló únicamente de fruto con capacidad de producción baja de sideróforos y quitinasas. ^{Bolívar-Anillo et al. (2016}), que mencionan que B. tropica producir compuestos volátiles y sideróforos permitiendo efectos supresivos de fitopatógenos, además de promover el desarrollo en plantas de tomate, caña de azúcar y maíz por su capacidad de fijar nitrógeno y solubilizar fosfatos.

Se concluye que la fresa (F. x ananassa) variedad Chanler, cultivada en condiciones comerciales orgánicas, poseen una comunidad de bacterias endofíticas constituida de tres géneros. Las especies más prevalente fue B. subtilis. Sin embargo, B. cereus, seguido de B. thuringiensis, tuvieron una mayor distribución en los órganos de la planta, lo cual sugiera una mayor adaptación evolutiva endófita. Estas especies también sobresalieron por sus propiedades promotoras de crecimiento en las tres propiedades metabólicas analizadas. Se aporta a la comprensión sobre la interacción bacteria endófita-planta en el entorno específico del cultivo de fresa en Sinaloa, lo que puede coadyuvar para mejorar estrategias de manejo fitosanitario y productivo sostenibles.