Material vegetal

En marzo de 2013, en el área experimental del Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical, de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, de la Universidad Nacional Autónoma de México, localizada en Martínez de la Torre (20° 03´ N y 93° 03´ O; 151 msnm), Veracruz, México, se cosecharon hojas frescas de Leucaena leucocephala, Cratylia argentea, Gliricidia sepium y Guazuma ulmifolia. Estas plantas fueron seleccionadas por su elevada concentración de MS, y porque algunas de ellas expresan actividad AH contra NGI de pequeños rumiantes (^{Alonso-Díaz et al. 2008a}, ^b; ^{Von Son-de Fernex et al. 2012}).

Estos árboles y arbustos forrajeros predominan en la vegetación nativa de Veracruz, se encuentran distribuidos en otras áreas tropicales del mundo (^{Flores-Guido 2001}), y representan una alternativa nutricional importante para las unidades de producción animal.

Método de extracción

Para cada especie de planta, se colectó 1.0 ± 0.15 kg de hojas frescas y se secaron en una estufa de aire a 60 °C por 72 h. Después las hojas fueron molidas para obtener partículas de un milímetro, y se colocaron en vasos de precipitado de dos litros con acetona:agua (70:30) y un agitador magnético. Posteriormente, la mezcla fue sonicada por cuatro horas a baño María (Branson Sonicator 2510MT®, Emerson Industrial Automation, Danbury, USA).

Para la segunda extracción se colocaron 500 ± 36.97 g de material vegetal de cada planta seca y molida en un vaso de precipitado con acetona, que se mantuvo a temperatura ambiente (24 °C) durante 24 horas. Finalmente, se extrajo la parte acuosa, del mismo material vegetal utilizado en la extracción acetónica, que, una vez seco se colocó en agua destilada previamente calentada a 58 °C por dos horas.

En cada uno de los métodos de extracción, el extracto se obtuvo después de filtrar el material (Whatman® qualitative filter paper, Grade 1). A 58 °C, los solventes se evaporaron de los extractos mediante el proceso de destilación a baja presión en un rotoevaporador (Rotovapor® R-3, Büchi®, Suiza). Los extractos fueron lavados cuatro veces con 500 mL de n-hexano para la remoción de clorofilas y lípidos; a través de un embudo de separación se descartó la fracción n-hexánica, y se realizó un análisis cualitativo para confirmar que las clorofilas y los lípidos se hubieran eliminado. Finalmente, los extractos fueron congelados y liofilizados.

Bioensayos

Análisis estadístico

Para evaluar el efecto dosis-dependiente entre los extractos de las diferentes especies de plantas se utilizó un Modelo Lineal General (MLG) (Yij = µ+Tj+Eij), donde la variable dependiente fue la eclosión de huevos (Yij), la cual representa la iava observación obtenida bajo el javo tratamiento. La variable independiente (Tj) corresponde a las concentraciones crecientes de cada extracto de planta, µ representa la media general y Eij, la variación residual del error experimental.

Las medias de los tratamientos se compararon las mediante el análisis de la diferencia mínima significativa (DMS), y un valor probabilístico indicativo de significancia estadística de P < 0.05 (prueba-F). Debido a que los datos se distribuyeron de forma normal y homocedástica, no se requirió de transformación alguna (STATGRAPHICS, Centurión xvi versión 16.1.18, USA).

Cuando no se cumplió con los supuestos del análisis anova, se utilizó una prueba de Kruskal-Wallis para: i) comparar las tasas de eclosión obtenidas según el extracto de planta aplicado, con y sin la adición de PEG; ii) comparar la tasa de eclosión entre los métodos de extracción y la especie de planta; y iii) evaluar el rendimiento entre los métodos de extracción. El valor probabilístico indicativo de significancia estadística fue de P < 0.05 (prueba-H).

El porcentaje de inhibición de la eclosión de huevos (IEH) se calculó con la siguiente fórmula:

Donde P_t es el número de huevos eclosionados en el tratamiento, y P_c es el valor obtenido en los controles negativos de agua o DMSO (^{Bizimenyera et al. 2006}). La concentración letal para inhibir el 50% de la eclosión de huevos (CL₅₀) de cada extracto se calculó utilizando el Programa de Análisis Probit (Minitab® 17.1.0, Minitab Inc., USA).

Bioensayo de la eclosión de huevos (IEH)

El porcentaje de eclosión de huevos (± EE) de C. punctata en los controles negativos ocurrió en un rango de 92.48 ± 1.97% a 95.29 ± 0.76%, y en los controles positivos, ocurrió de 31.17 ± 4.69% a 35.49 ± 4.37%. La eclosión de huevos en cada uno de los 12 extractos se comportó de manera dosis-dependiente (P < 0.01) (figuras 1 a 3). L. leucocephala-AQ inhibió más del 50% de la eclosión de huevos de C. punctata (P < 0.05; r² = 69.51%) (figura 1). G. ulmifolia alcanzó la máxima tasa de inhibición con la extracción aw 45.42 ± 2.30% (P < 0.01; r² = 95.71%), mientras C. argéntea, la alcanzó a los 35.07 ± 1.40% (P < 0.01; r² = 97.46%) (figura 2). A la concentración máxima, G. sepium-ac inhibió la eclosión de huevos de C. punctata en su totalidad (P < 0.01; r² = 94.42%) (figura 3). Cooperia spp. es uno de los NGI con mayor prevalencia en el ganado de pastoreo. El incremento de su resistencia a la quimioterapia, según los reportes, denota la importancia de desarrollar estrategias de control nuevas y seguras (^{Bartley et al. 2012}; ^{Demeler et al. 2013}).

Figura 1 Eclosión de huevos de Cooperia punctata posterior a su incubación en los extractos acuosos de las plantas (* P < 0.05; ** P < 0.01). 

Figura 2 Eclosión de huevos de Cooperia punctata posterior a su incubación en los extractos acetona:agua de las plantas (* P < 0.05; ** P < 0.01). 

Figura 3 Eclosión de huevos de Cooperia punctata posterior a su incubación en los extractos acetónicos de las plantas (* P < 0.05; ** P < 0.01). 

Este trabajo de investigación provee evidencia del efecto ovicida de extractos de plantas contra huevos y fases de vida libre de C. punctata. Existen pocos reportes sobre nuevas tecnologías que permitan controlar las fases de vida libre de los NGI en ganado bovino (^{Novobilsky et al. 2011}). Evaluaciones in vitro han demostrado que las leguminosas de clima templado tienen actividad contra las larvas infectantes de C. oncophora (^{Novobilsky et al. 2011}); no obstante, existen pocos reportes relacionados con nuevas tecnologías, que arrojen información sobre el control de otras fases de vida libre como la eclosión de huevos. Los huevos son una fase biológica de los NGI que poseen una tricapa relativamente gruesa (^{Mansfield et al. 1992}), la cual les provee de resistencia al estrés medioambiental (temperatura, humedad, radiación UV y pisoteo del ganado). Tales características dificultan el desarrollo de estrategias de control efectivas.

Las concentraciones letales, calculadas con los 12 extractos, requeridas para inhibir el 50% de la eclosión de huevos, se exponen en el cuadro 1. El mejor valor para una concentración letal CL₅₀ de G. sepium-AC fue 1.03 ± 0.17 mg mL^-1 y, para L. leucocephala-AQ fue 7.9 ± 1.19 mg mL^-1. En los extractos AW, la CL₅₀ abarcó de 8.84 a 15.12 mg mL^-1. El efecto dosis-dependiente observado en la mayoría de los extractos de plantas indica una respuesta toxicológica de los fitoquímicos de las cuatro especies de plantas analizadas (^{Hoste et al. 2012}); sin embargo, se requieren nuevos estudios que permitan la identificación y el aislamiento de las moléculas con actividad-AH presentes en los extractos con mayor bioactividad. La identificación fitoquímica ayudaría a comprender los mecanismos de acción involucrados en su actividad.

Cuadro 1 Concentraciones letales requeridas para inhibir el 50% de la eclosión de huevos de Cooperia punctata (CL₅₀), posterior a su incubación en los extractos bioactivos por 48 h mg mL^-1. 

Participación de los compuestos polifenólicos en la actividad ovicida de los extractos de plantas bioactivas

La adición de PEG evidenció la participación de los compuestos polifenólicos en la mayoría de los extractos de plantas, restaurando los valores de eclosión de huevos a valores similares a los obtenidos con los controles negativos (agua destilada o DMSO 2.5%) (cuadro 2). El polímero hidrofílico PEG se ha utilizado para evaluar la participación de los compuestos polifenólicos en la bioactividad de los extractos (^{Makkar 2003}). Tras la adición de PEG, los valores inhibitorios de la mayoría de los extractos se restauraron a valores similares a los obtenidos en los controles negativos, esto indica la predominancia de la participación de los polifenoles (cuadro 2). Sin embargo, después de añadir PEG a G. sepium-AC, se observaron valores inhibitorios de 79.85 ± 1.2%, lo que sugiere la posible participación de otros fitoquímicos en la actividad ovicida de los extractos acetónicos.

Cuadro 2 Inhibición de la eclosión de huevos (IEH) obtenida con la concentración máxima (9.6 mg mL^-1) con y sin la adición de polietilenglicol (PEG), entre especies de plantas y métodos de extracción. 

Las letras minúsculas diferentes en la misma fila y diferentes letras capitales entre métodos de extracción de la misma planta, representan diferencias estadísticamente significativas (P < 0.05).

El análisis de cromatografía en capa fina es una de las técnicas más empleadas para la identificación y diferenciación de fitoquímicos en las plantas medicinales (^{Rafi et al. 2011}). Las cromatografías obtenidas con cada extracto de planta, así como la aplicación de PEG sugieren que, flavonoides de mediana polaridad tienen efecto ovicida contra C. punctata.

Nuestros resultados son consistentes con autores que reportan flavonoles como la quercetina, la rutina y el kenferol con propiedades antihelmínticas (^{Barrau et al. 2005}). Por otro lado, el análisis fitoquímico de G. sepium-AC reveló poseer, como componente principal, un fitoquímico de baja polaridad, visible bajo luz UV de onda corta (254 nm), pero no-reactivo a AS y NEU. Además, PEG no logró restaurar la inhibición de la eclosión de huevos a los valores control (79.85 ± 1.2%), situación que sustenta la hipótesis de la presencia de un fitoquímico no flavonoide con actividad-AH y difiere de lo reportado por ^{Wabo Poné et al. (2011)}, quienes relacionaron la participación de los tc de los extractos acetónicos de G. sepium con la inhibición de la eclosión de huevos de H. contortus. En esta investigación no fue posible la elucidación estructural del fitoquímico involucrado en el efecto AH; a pesar de ello, esta información ayudará a comprender los posibles mecanismos de acción sobre C. punctata.

Rendimiento de los extractos de plantas

La extracción fotoquímica arrojó diferencias de rendimiento entre los métodos de extracción (P < 0.05). El rendimiento de la extracción AW fue de 10.04 ± 0.91% (Media ± EE). Los rendimientos individuales se presentan en el cuadro 3. En este análisis, también se compararon los métodos de extracción con base en su actividad ovicida, donde observamos los mejores valores inhibitorios cuando utilizamos las extracciones uni-solventes (G. sepium-AC y L. leucocephala-AQ), lo que nos lleva a la percepción de que compuestos con polaridades similares pudiesen incrementar la bioactividad. Sin embargo, el desempeño general de cada método de extracción mediante el análisis de CL₅₀, fue (Media ± EE): 16.64 ± 4.27, 12.41 ± 1.19 y 13.49 ± 4.59 mg mL^-1 para aq, AW y AC respectivamente (cuadro 3). Más aun, entre los métodos de extracción, el método AW tuvo el mayor porcentaje de rendimiento (P < 0.05).

Cuadro 3 Rendimiento de fitoquímicos de las cuatro plantas utilizando tres métodos de extracción (acuoso, acetona:agua, acetónico). 

Las letras diferentes en las medias de cada método de extracción representan diferencias estadísticamente significativas (P < 0.05).

Los análisis de esta investigación permitieron determinar que: i) los flavonoides poseen propiedades ovicidas, y ii) los flavonoides son los fitoquímicos predominantes en las extracciones AW. Esto es consistente con estudios previos que señalan la extracción acetona:agua como el sistema más eficiente para la recuperación de fenoles (^{Chavan et al. 2001}; ^{Chavan 2013}).

También estudios fitoquímicos previos han manifestado efectos agonistas/antagonistas entre componentes del mismo extracto (^{Biavatti 2009}), fenómeno que explicaría por qué el extracto G. sepium-AC mostró un efecto ovicida excepcional, pero la bioactividad fue prácticamente nula en la extracción acetona:agua. No obstante, estas tendencias sólo se observaron con una de las cuatro plantas analizadas (G. sepium) y, en general, la actividad AH en la extracción AW fue igual o mayor; sin embargo, se requiere de un fraccionamiento bio-dirigido de los fitoquímicos que permita la identificación de las moléculas activas presentes en cada extracto, así como sus interacciones.