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INTRODUCCIÓN
La nutrición y la reproducción generalmente se encuentran vinculadas, debido a que el éxito reproductivo del animal depende de su estado nutricional. A lo largo de los años se ha estudiado el efecto de esta asociación, a menudo mediante la alteración de las dietas de diversas maneras con el fin de observar los cambios resultantes en los parámetros reproductivos de los animales (Yeste et al., 2011). Uno de los cambios más significativos, es la adición de ácidos grasos poliinsaturados (frecuentemente denominados por su acrónimo en lengua inglesa PUFAs (Polyunsaturated Fatty Acids) a su dieta. Se han estudiado diferentes fuentes de PUFAs en la dieta de mamíferos, como los omega-3 y omega-6, observándose que su consumo influye en algunas funciones reproductivas de la hembra, como un aumento en el diámetro y el número de folículos presentes en el ovario (Nurlatifah et al., 2020); así como un periodo más corto para la primera ovulación (Salehi et al., 2016) y un efecto positivo sobre la fertilidad (Rebollar et al., 2014). En los machos, produce aumento del líbido (Castellano et al., 2010), tamaño testicular (Van Tran et al., 2017; Mínguez‑Alarcón et al., 2017), concentración espermática (Alizadhe et al., 2014; Fair et al., 2014; Rodrigues et al., 2017), motilidad (Alizadeh et al., 2014; Liu et al., 2015; Rodrigues et al., 2017) y viabilidad espermática (Alizadhe et al., 2014; Esmaeili et al., 2012b). Asimismo, en la composición y estructura de las membranas de las mitocondrias espermáticas (Gürler et al., 2015), las cuales se encargan de producir la energía necesaria para producir el movimiento flagelar, aumentando su fluidez y plasticidad y, por ende su función (Sullivan et al., 2018).
En la mayoría de los tejidos de mamíferos, el ácido graso que más predomina es el ácido linoleico (18:2 n-6), donde su concentración refleja la ingesta dietética (Guyenet & Carlson, 2015). El ácido linoleico se obtiene a través de la dieta de aceites vegetales, como el girasol, soya, maíz y aceites de canola; así como nueces y semillas (Sullivan et al., 2018). El aceite de soya, está compuesto por varias sustancias, principalmente de ácidos grasos poliinsaturados, particularmente ácido linoleico (LA, C18: 2), un ácido graso omega-6 (ω6) que constituye ~ 55% del aceite de soya (Deol et al., 2017) y también ácido linolénico (ALA, C18: 3), un ácido graso omega-3 (ω3) que constituye ~ 5-9% (Sullivan et al., 2018).
Por otro lado, el PUFAs más abundante en las membranas de los espermatozoides de la mayoría de los mamíferos es el omega-3, el cual tiene una función importante en la funcionalidad de la célula espermática, al proporcionarle fluidez y permeabilidad; las cuales se relacionan con la capacidad de llevar a cabo la fertilización (Esmaeili et al., 2012b), y con un aumento en la crioresistencia (Towhidi et al., 2012; Fair et al., 2014).
Se ha descrito que los espermatozoides de ovino son más susceptibles al choque frío durante la criopreservación que otros mamíferos (Grötter et al., 2019). Estas diferencias se atribuyen, en parte, a la composición lipídica (Mandal et al., 2014; Chunrong et al., 2019) y al contenido de PUFAs presentes en las membranas de los espermatozoides (Mandal et al., 2014). Asimismo, los mamíferos son incapaces de sintetizar de novo ácidos grasos con dobles ligaduras en las posiciones n-6 (serie linoleica) y en la n-3 (serie linolénica), debido a que carecen de enzimas desaturasas (Byrne et al., 2017), por lo cual los PUFAs deben ser incluidos en la dieta.
El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del aceite de soya rico en PUFAs n-6 y n-3 añadido en la dieta en cantidades del 3 y 6%, sobre la criopreservación del semen ovino Pelibuey.
MATERIAL Y MÉTODOS
Ubicación
El estudio se realizó durante los meses de septiembre a noviembre de 2018 en el Banco de Germoplasma Ovino Pelibuey y Blackbelly, del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) en el municipio de Mocochá, Yucatán, México, ubicado en la región centro norte del estado, entre los paralelos 21º 05' y 21º 10' de Latitud Norte y los meridianos 89º 27' y 89º 30' de Longitud Oeste, a una altitud de 9 m sobre el nivel del mar. El clima predominante en la región es cálido sub-húmedo (Aw0) con lluvias en verano, con una precipitación pluvial de 997 a 1132 mm, y temperatura media anual de 26.5 °C.
Animales
Se utilizaron 27 ovinos machos de la raza Pelibuey, con una edad promedio de 2.0 ± 0.5 años, peso vivo promedio de 42.5 ± 2.9 kg y condición corporal de 3.5 de acuerdo en la escala de 1 a 5 puntos. Asimismo, se constató que los animales no presentaran ninguna anomalía física que pudiera excluirlo del estudio.
Alimentación
Los ovinos se distribuyeron al azar en tres grupos (n=9 por grupo), suministrando a cada grupo diferentes porcentajes de aceite de soya (AS) en la dieta: Tratamiento control (T1): (0% AS); Tratamiento 2 (T2): 3% AS y Tratamiento 3 (T3): 6% AS, complementados con un 30% de alimento comercial (NUTRIMYN Borrego 14% PC, MYN Distribuidora de S.A de C.V.) y un 70% de pasto CT-115 (Pennisetum purpureum) (tabla 1). Las dietas fueron proporcionadas a libre acceso a razón de 450 g-1/a-1/d-1 por la mañana (11:30h), durante 60 días (espermatogénesis en el ovino: 58 días; Díaz et al. 2017), incluyendo un periodo de adaptación de 14 días, donde se les suministró gradualmente el aceite soya (Bakersv& Chefs®, Hermosillo, México) en la dieta hasta alcanzar lo establecido en cada tratamiento.
Obtención de muestras seminales
Mediante una vagina artificial y con la ayuda de una oveja que sirvió como maniquí, se seleccionaron 162 eyaculados (6 eyaculados/ovino-1; 54/grupo-1) que cumplieron con los siguientes criterios: volumen >0.5, motilidad masal >4 (escala 0-5), motilidad >70% y concentración espermática >3,000 x 106 espermatozoides/mL (Arando et al., 2019, 2020). El semen se colectó con una frecuencia de dos veces por semana (un eyaculado/día/semental) en horas de la mañana (8:00), y durante 3 semanas posteriores al periodo de suplementación.
Dilución espermática
Los eyaculados seleccionados se diluyeron con Triladyl® + agua bidestilada + 20% de yema de huevo a una concentración final de 400 x 106 espermatozoides/mL, para luego ser envasadas en pajillas francesas (Minitüb®, Tiefenbach, Alemania) de 0.25 mL.
Congelación de semen
La congelación de las muestras se realizó colocando las pajillas a 4 cm sobre la superficie del nitrógeno líquido (LN2), durante 10 minutos; inmediatamente después las pajillas se sumergieron en LN2 y se almacenaron hasta su evaluación.
Descongelación de semen
El procedimiento de descongelación se realizó mediante la inmersión de las pajillas en un baño maría a 37°C durante 30 segundos.
Concentración espermática
Se diluyeron 5 µL de la muestra de semen en 995 µL de agua destilada. Posteriormente, se colocaron 9 µL de la muestra diluida sobre cada uno de los dos lados de la cámara Bücker y se capturaron 4 campos de cada lado con el sistema computarizado de análisis espermático AI Station (SPERM.TECH®, Valencia, España).
Motilidad espermática
La motilidad se analizó con el sistema AI Station, colocando 5 µL de semen descongelado y diluido a ~30 x106/mL de espermatozoides, sobre una cámara de recuento Makler® (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel) precalentada a 37ºC; y se procedió a la captura de al menos cinco campos con un mínimo de 300 espermatozoides/muestra. Los parámetros de motilidad analizados fueron: Motilidad total (MT, %), Motilidad progresiva (MP, %), Velocidad curvilínea (VCL, μm/s), Velocidad rectilínea (VSL, μm/s), Velocidad promedio (VAP, μm/s), Índice de linealidad (LIN= VSL/VCL x 100), Índice de rectitud (STR= VSL/VAP x 100), Índice de oscilación (WOB= VAP/VCL x 100), Amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH, μm) y Frecuencia de batido de la cola (BCF, Hz).
Viabilidad espermática
Se evaluó mediante la tinción de SYBR-14 y yoduro de propidio (PI) (Live/Dead® kit L- 7011, InvitrogenTM). Las muestras se tiñeron con 1 µL de SYBR-14 (10 µM) y 1 µL de PI (12 µM) y se dejaron incubar durante 10 minutos a 37ºC en la oscuridad. Posteriormente se colocaron 5 µL de la muestra sobre un portaobjeto precalentado a 37ºC, y se procedió a su evaluación por medio de un microscopio de epifluorescencia (LWScientific i40-ADN). El porcentaje de células viables se determinó contabilizando 200 espermatozoides por muestra. Las células teñidas con SYBR 14 (fluorescencia verde) fueron consideradas como viables; mientras que las células teñidas con PI (Fluorescencia roja) fueron consideradas como muertas.
Integridad del acrosoma
Se evaluó mediante la tinción de FITC-PSA (100µg/mL, L-0770, Sigma-AldrichTM). Las muestras se tiñeron con 5 µL de FITC-PSA y se dejaron incubar durante 30 minutos a 37ºC en la oscuridad; inmediatamente después se colocaron 5 µL de la muestra sobre un portaobjeto y se procedió a su evaluación. El porcentaje de células con acrosoma íntegro se determinó contabilizando 200 espermatozoides por muestra. Los espermatozoides teñidos con FITC-PSA (fluorescencia verde) fueron considerados con acrosoma dañado; mientras que los que no presentaron fluorescencia se consideraron como intactos.
Actividad mitocondrial
Se analizó con la tinción JC-1 (153 µM, Molecular Probes® T-3168, InvitrogenTM). Las muestras se tiñeron 1 µL de JC-1 y se dejaron incubar durante 10 minutos a 37ºC en la oscuridad; después se colocaron 5 µL de la muestra sobre un portaobjeto y se analizó. El porcentaje de espermatozoides con actividad mitocondrial se determinó contabilizando 200 células por muestra. Se consideraron espermatozoides con actividad mitocondrial a aquellos que presentaron fluorescencia naranja en la parte intermedia del flagelo; mientras que los que no presentaron fluorescencia se consideraron sin actividad mitocondrial.
Integridad de la membrana plasmática de la cola (HOST)
Se evaluó con una dilución de 5 µL de muestra espermática en 50 µL de solución de endósmosis (0.735 g de citrato de sodio dihidratado y 1.351 g de fructosa en 100 mL de agua destilada) a 100 mOsm/L y se dejó incubar durante 1 hora a 37 °C. Posteriormente, se colocaron 5 µL de la muestra sobre un portaobjeto y se analizó con un microscopio de contraste de fases. El porcentaje de espermatozoides con HOST se determinó contabilizando 200 células por muestra. Los espermatozoides que presentaban colas enrolladas fueron considerados con la membrana de la cola intacta (endósmosis positiva); mientras que los que no presentaron colas enrolladas fueron considerados con la membrana de la cola dañada (endósmosis negativa).
Análisis estadístico
Las variables expresadas como porcentajes: motilidad total, motilidad progresiva, viabilidad, actividad mitocondrial, acrosomas intactos y Host, fueron transformadas al arcoseno√(variable)/100 antes de su análisis. Posteriormente se analizó con un ANOVA; y para encontrar las diferencias estadísticas entre tratamientos se utilizó la prueba de Tukey a P ≤0.05, a través del paquete estadístico del Statistical Analysis System (SAS Inst. Inc., 2011).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Numerosos estudios han demostrado que la inclusión de PUFAs en la dieta puede mejorar la funcionalidad de la célula espermática (Sullivan et al., 2018), así como su crioresistencia (Towhidi et al., 2012; Fair et al., 2014), al influir en la composición y estructura de sus membranas. Por otra parte, otros estudios mencionan que las dietas conformadas con PUFAs producen un aumento en la incorporación de DHA en los lípidos de la membrana plasmática de los espermatozoides (Gholami et al., 2010), provocando una disminución en el contenido de colesterol y por consiguiente una mayor susceptibilidad de los espermatozoides al choque por frío (Díaz et al., 2017). En este sentido, los valores obtenidos de los tratamientos T1 y T3 fueron similares y superiores (P<0.05) al T2, tanto en la motilidad total (57.8±2.3;59.6±2.6% vs 46.8±3.3%) como en la motilidad progresiva (27.0±0.3;30.2±1.2% vs 14.0±2.1%), respectivamente. Estos resultados son similares a los registrados por Losano et al. (2017) en semen descongelado de toro que fueron alimentados previamente con un 6% de aceite de palma durante 60 días; al igual que los reportados por Díaz et al. (2017) en muestras espermáticas descongeladas de ovino de la raza Araucano suplementados previamente con 3% de aceite de pescado, donde la motilidad total disminuyó y los demás parámetros de motilidad no presentaron diferencias respecto al tratamiento testigo.
Por su parte, Khoshvaght et al. (2016), observaron una mayor motilidad progresiva en semen descongelado de toro Holstein previamente suplementados con 3.5% de aceite de pescado durante 11 semanas, siendo similar a lo reportado en muestras de semen descongeladas de toros de la raza Holstein suplementados con 50 g de ácido linoleico conjugados (Lutrell®) durante 10 semanas (Karimi et al., 2016). En la velocidad media (VAP), el T1 (71.4±4.7µm/s) resultó mayor (P<0.05) respecto al T2 y T3 (53.8±3.0 y 50.3±6.8µm/s, respectivamente); mientras que para el resto de los demás parámetros de la motilidad analizados (LIN, STR, WOB, ALH y BCF) no se encontraron diferencias (P>0.05) entre los tratamientos (tabla 2); siendo esto similar a lo encontrado por Byrne et al. (2017) en muestras espermáticas descongeladas de toros púberes de la raza Holstein, alimentados con aceite de cártamo; donde los parámetros de motilidad no se vieron afectados, pero sí la amplitud del desplazamiento de las cabezas (ALH), que fue mayor respecto al testigo.
Tabla 2 Efecto de la suplementación del aceite de soya en la dieta sobre la motilidad del semen descongelado de ovino
| Tratamiento (aceite de soya %) | |||
| Parámetros de motilidad | T1 (0 %) | T2 (3 %) | T3 (6 %) |
| TM (%) | 57.8 ± 2.3a | 46.8 ± 3.3b | 59.6 ± 2.6a |
| PM (%) | 27.0 ± 0.3a | 14.0 ± 2.1b | 30.2 ± 1.2a |
| VAP (µm/s) | 71.4 ± 4.7a | 53.8 ± 3.09b | 50.3 ± 6.8b |
| VCL (µm/s) | 113.3 ± 6.0a | 91.7 ± 3.50a | 82.1 ± 4.7a |
| VSL (µm/s) | 53.9 ± 1.9a | 36.8 ± 2.76a | 36.5 ± 3.2a |
| LIN (%) | 44.4 ± 0.5a | 36.1 ± 1.94a | 41.3 ± 1.7a |
| STR (%) | 69.0 ± 0.8a | 59.0 ± 2.80a | 65.0 ± 2.9a |
| WOB (%) | 61.9 ± 2.5a | 57.0 ± 1.55a | 59.6 ± 1.4a |
| ALH (µm) | 3.6 ± 0.2a | 3.2 ± 0.10a | 2.9 ± 0.1a |
| BCF (Hz) | 11.1 ± 1.6a | 8.8 ± 3.51a | 8.7 ± 6.7a |
(ab) Diferentes superíndices en la misma línea indican diferencias significativas (p <0.05). TM, motilidad total; PM, motilidad progresiva; VAP, velocidad promedio; VCL, velocidad curvilínea; VSL, velocidad rectilínea; LIN, índice de linealidad (LIN= VSL/VCL x 100); STR, índice de rectitud (STR= VSL/VAP x 100); WOB, índice de oscilación (WOB= VAP/VCL x 100); ALH, amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza; BCF, frecuencia de batido de la cola.
Se conoce que los aceites de origen animal como el aceite de pescado, contienen altas concentraciones de PUFAs n-3 (Omega-3) que los de origen vegetal (Omega-6); incluso se ha demostrado que la suplementación de PUFAs n-3 en la dieta, modifica la composición de los ácidos grasos de la membrana espermática, mejorando la calidad del semen. Estos efectos han sido reportados en espermatozoides de ovino (Samadian et al., 2010; Díaz et al., 2017), caballo (Brinsko et al., 2005), cerdo (Rooke et al., 2001), toros (Khoshvaght et al., 2016; Byrne et al., 2017), perros (Alonge et al., 2019) y en humanos (Martínez-Soto et al., 2012).
En cuanto a la integridad de los acrosomas, el T1 (66.6±7.6%) resultó mayor (P<0.05), respecto al T2 y T3 (41.3±3.8 y 29.2±5.2%, respectivamente). Esto es similar a lo reportado por Losano et al. (2017) en muestras espermáticas descongeladas de toros que fueron alimentados previamente con ácidos grasos al 6% durante 60 días; sin embargo, difiere a lo reportado por Byrne et al. (2017) en semen descongelado de toros púberes de la raza Holstein-Fresian, alimentados con aceite de cártamo y de pescado durante 10 días. Contrario a lo descrito por Díaz et al. (2017) en muestras espermáticas descongeladas de ovino de la raza Araucano, que fueron alimentadas con aceite de pescado durante 60 días. Este resultado probablemente se debió al aumento del estrés oxidativo causado por los procesos de congelación y descongelación de las muestras, que fue exacerbado por el efecto de los PUFAs en el aumento susceptibilidad de la membrana del esperma a la peroxidación lipídica.
La viabilidad del T1 (43.3±6.5%) fue similar al T2 (36.6±3.1%) y T3 (53.0±4.6%); aunque el T2 y T3 fueron diferentes (P<0.01) (tabla 3). Estos resultados fueron similares a los obtenidos por Moallem et al. (2015), Losano et al. (2017) y Byrne et al. (2017) en muestras espermáticas descongeladas de toros alimentados con ácidos grasos y omega-3 durante 13 semanas; al igual que en toros alimentados con ácidos grasos (Megalac®) durante 60 días y en muestras de semen descongelado de toros púberes de la raza Holstein-Fresian, que fueron alimentados con aceite de cártamo y de pescado durante 12 días respecto al tratamiento testigo, respectivamente. Sin embargo, estos resultados difieren a lo reportado por Díaz et al. (2017), donde la viabilidad de las muestras espermáticas descongeladas de ovino fue mayor en el tratamiento testigo, respecto al tratamiento de suplementación en la dieta con aceite de pescado durante 60 días. Por otra parte, Khoshvaght et al. (2016) reportaron una mayor viabilidad espermática en muestras de semen descongelado de toros Holstein, que fueron previamente suplementados con aceite de pescado durante 11 semanas.
Tabla 3 Efecto de la suplementación del aceite de soya en la dieta sobre la motilidad, actividad mitocondrial, acrosomas intactos y Host del semen descongelado de ovino
| Tratamiento | Aceite de soya (%) | Viabilidad (%) | Actividad mitocondrial (%) | Acrosomas intactos (%) | Host (%) |
| T1 | 0 | 43.3 ± 9.5ab** | 37.3 ± 7.3b* | 66.6 ± 7.6a* | 29.3 ± 1.6a |
| T2 | 3 | 36.6 ± 3.1b | 33.6 ± 3.5b | 41.3 ± 3.8b | 21.5 ± 2.1a |
| T3 | 6 | 53.0 ± 4.6a | 65.3 ± 6.5a | 29.2 ± 5.2b | 25.0 ± 2.5a |
(ab) Diferentes superíndices en la misma columna indican diferencias significativas (p<0.05*) (p<0.01**)
Diferentes estudios indican que el aumento de la concentración de PUFA n-3 de cadena larga de los espermatozoides bovinos no produce mejoras apreciables en la fluidez de la membrana plasmática, en comparación con una dieta basal (Moallem et al. 2015); Byrne et al. (2017), lo cual podría haber sucedido con las PUFAs n-6 del aceite de soya en los espermatozoides de ovino de pelo de este estudio.
La actividad mitocondrial en el T3 (65.3±6.5%) fue mayor, respecto al T1 y T2 (37.3±7.3 y 33.6±3.5), respectivamente (P<0.05). Estos resultados difieren a lo reportado por Losano et al. (2017) donde la actividad mitocondrial no presentó diferencias entre los tratamientos de muestras espermáticas descongeladas de toros que fueron alimentados previamente con ácidos grasos al 6% durante 60 días. Se ha demostrado que la inclusión de PUFAs n-6 en la dieta puede producir una integración de los fosfolípidos a la membrana plasmática, sustituyendo a los ácidos grasos saturados que son más lineales y rígidos, generando un aumento en la fluidez y plasticidad de las membranas, facilitando la interacción con las proteínas enzimáticas de la membrana y, por tanto su función (Sullivan et al., 2018). Asimismo, la reducción en la cantidad de estos fosfolípidos que compone el 10% de los fosfolípidos mitocondriales, altera el potencial de membrana (Jiang et al., 2000). En la mayoría de los tejidos de mamíferos, el ácido graso que más predomina es el ácido linoleico (18:2 n-6) (Guyenet & Carlson, 2015), el cual se obtiene a través de dieta de aceites vegetales, como girasol, soya, maíz y aceites de canola; así como nueces y semillas. Este ácido es necesario para el correcto funcionamiento de varios complejos de la cadena respiratoria mitocondrial, por lo que está relacionada con procesos tan esenciales como la generación de ATP (Mileykovskaya et al., 2005), la conducción de protones a través del citocromo bc1 (Lange et al., 2001); así como en la prevención de la inestabilidad osmótica y el desacoplamiento de la cadena, cuando la tasa de respiración es elevada (Koshkin & Greenberg, 2002).
En la integridad de la membrana plasmática de la cola (test host), no se encontraron diferencias significativas (P>0.05); lo cual concuerda a lo reportado en semen descongelado de toro de la raza Holstein alimentados con 50 g de ácido linoleico (Karimi et al., 2016). Sin embargo, Gholami et al. (2010) mencionan que los PUFA n-3 aumentan la incorporación de DHA en la cabeza y en la pieza principal de la cola de los espermatozoides, lo cual influye en la composición bioquímica de la membrana de los espermatozoides, otorgándole una mejor plasticidad y estabilidad.
Por último, estos resultados contradictorios obtenidos en este estudio con la de otros autores, pueden estar asociados a muchos factores, tales como: la especie y raza del animal, tiempo de la suplementación, estatus reproductivo del animal, cantidad de PUFAs presentes en la membrana de los espermatozoides, concentración y tipo de los PUFAs añadidos a la dieta, entre otros (Esmaeili et al., 2012a; Liu et al., 2015; Martínez- Soto et al., 2012).
En los ovinos, los PUFAs n-3 en la dieta provocan modificaciones en los perfiles de los ácidos grasos de los espermatozoides, desempeñando una función importante sobre la calidad del semen y su tolerancia al choque por frío, esto es debido a la incorporación de DHA a los fosfolípidos de la membrana celular (Esmaeili et al., 2012b), ya que se ha demostrado que existe una relación de las cantidades de DHA en la membrana de los espermatozoides con su crioresistencia (Martínez-Soto et al., 2012). Por otro lado, se ha documentado que los PUFAS n-3 en la dieta promueven la susceptibilidad de la membrana de los espermatozoides a la peroxidación lipídica, afectando la capacidad fecundante de los espermatozoides. A pesar de esto, se ha reportado que una dieta enriquecida con vitamina E, zinc, selenio, ácido fólico y n-3 PUFA durante al menos dos meses, en cantidades adecuadas, mejora la cantidad de esperma y calidad, especialmente el recuento y la movilidad de los espermatozoides, modificando las propiedades físicas y funcionales de la membrana celular de los espermatozoides (Alonge et al., 2019). En este sentido, sería conveniente un estudio futuro con suplementación a base de ácidos grasos PUFAs n-6 y su asociación con antioxidantes, para prevenir los posibles daños provocados por el efecto de la peroxidación lipídica.
