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INTRODUCCIÓN
La clamidiosis es una enfermedad infecciosa que se da en ovejas, cabras y vacas en todo el mundo y que provoca trastornos reproductivos, como abortos, partos muertos y crías débiles o prematuras que mueren poco después de nacer. El agente etiológico, Chlamydia abortus, es la principal causa de pérdidas reproductivas en cabras y ovejas en los países del norte de Europa, y causa aproximadamente el 44% de todos los abortos infecciosos diagnosticados en el Reino Unido (Stuen y Longbottom, 2011). Como zoonosis, C. abortus presenta el mayor riesgo para las mujeres embarazadas, ya que es capaz de colonizar la placenta humana provocando el aborto. También se ha descrito una neumonía respiratoria atípica en trabajadores que estuvieron en contacto con rumiantes (Longbottom y Coulter, 2003; Ortega et al., 2015; Pichon et al., 2020). Chlamydia es una bacteria Gram negativa y un parásito intracelular obligado. Presenta un ciclo de desarrollo multimórfico asíncrono con dos estadíos, los cuerpos elementales y reticulares, ambos con lipopolisacáridos. A diferencia de la pared celular típica de las bacterias, las paredes celulares de Chlamydia no presentan ácido murámico (Rodolakis y Laroucau, 2015).
En México, la clamidiosis en cabras y ovejas, así como el papel de Chlamydia en los abortos de las ovejas se reportaron por primera vez en la década de 1990 (Escalante et al., 1996). El primer aislamiento de C. abortus (entonces C. psittaci serotipo 1) en cabras se publicó en 1997 (Escalante et al., 1997). En 2001, se demostró la presencia de Chlamydia en un proceso zoonótico originado en un rebaño de cabras infectado (Escalante et al., 2001). En 2004 se demostró la presencia de C. abortus (entonces Chlamydophila abortus) en cabras mediante serología y aislamiento, y de nuevo en 2005, 2006 y 2008 (Lazcano, 2006; Soriano et al., 2011). En 2011, un estudio encontró C. abortus en el 26,9% de las cabras muestreadas en el estado de Guanajuato, México, alcanzando un 9,60% de seropositividad (Mora et al., 2015). Palomares et al. (2020) evaluaron la frecuencia serológica individual y del rebaño, así como los factores de riesgo para C. abortus en siete estados productores de ovinos en México, e identificaron el aborto enzoótico en ovejas. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo de este estudio fue determinar si C. abortus está presente en los casos de aborto caprino en diferentes regiones de México.
MATERIAL Y MÉTODOS
Muestras
Este estudio se realizó entre agosto de 2016 y febrero de 2018. Se obtuvo un total de 186 exudados vaginales de 49 rebaños con abortos reportados en cinco estados de México. El estado de Coahuila proporcionó 82 muestras (44,10%) de 24 rebaños, seguido de Veracruz con 67 muestras (36,02%) de 18 rebaños, Jalisco con 25 muestras (13,44%) de tres rebaños, Querétaro con siete muestras (3,76%) de un rebaño y Puebla con cinco muestras (2,68%) de tres rebaños.
Todas las hembras muestreadas eran de raza mixta y las condiciones de cría variaban según el estado. Las muestras de Jalisco y Querétaro procedían de rebaños estabulados y mantenidos como reproductores bajo un manejo intensivo. Estos animales se alimentaban con dietas equilibradas con suplementos minerales y no coexistían con otras especies animales. En cambio, los caprinos de Puebla, Coahuila y Veracruz se mantenían en condiciones de manejo extensivo para la producción de carne, ya sea comercial o de consumo no comercial. Estos rebaños pasaban las mañanas pastando en la vegetación no manejada y a lo largo de los bordes de los caminos y eran encerrados durante la noche sin suplemento alimenticio adicional. Estas cabras convivían con otras especies animales en los corrales, principalmente con ovejas y pollos, así como con caballos, perros y gatos.
Se tomaron muestras de cabras que habían abortado recientemente o de cabras que habían parido recientemente con un historial de abortos (no más de 30 días en ambos casos). Las muestras vaginales se tomaron con hisopos estériles y se transportaron en tubos con 2 ml de medio de sacarosa-fosfato/glutamato (SPG) (217 mm de sacarosa, 4 mm de KH2PO4, 7 mm de K2HPO4 y 1% de L-glutamina), complementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; GIBCO, EE.UU.) y antibióticos (100 μg/ml de estreptomicina, 50 μg/ml de gentamicina; Invitrogen, EE.UU.) (Sachse et al., 2009). En el laboratorio, las muestras se mantuvieron a -20°C hasta su procesamiento. Los experimentos con muestras y Chlamydia viva se realizaron en un laboratorio de bioseguridad de tipo III. Para la técnica de inmunofluorescencia y las reacciones de PCR, utilizamos una cepa de C. abortus A.22 amablemente donada por Petter C. Griffiths del Central Veterinary Laboratory, Reino Unido, en 1993. Esta muestra fue importada con el certificado zoosanitario nº 27491.
Aislamiento bacteriano
El aislamiento bacteriano se realizó en fibroblastos de ratón de la línea celular L929. Las células se cultivaron en un medio mínimo esencial de Eagle (EEMM; Invitrogen, EE.UU.), complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS), un 1% de aminoácidos no esenciales, un 1% de L-glutamina a 37°C y un 5% de CO2 (Escalante et al., 1996). Para la identificación de los cuerpos clamidiales, se utilizaron 0,9×105 células por pocillo, en placas de cultivo de poliestireno de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio estériles de 12 mm de diámetro (Mora et al., 2015). La identificación de las inclusiones intracitoplasmáticas producidas por C. abortus se llevó a cabo mediante la técnica de inmunofluorescencia directa, utilizando las pruebas comerciales IMGEN Chlamydia (OXOID, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Las inclusiones intracitoplasmáticas se visualizaron en un microscopio UV (Leica DM1000) con objetivos de 40X y 100X. Se consideró que una muestra era negativa después de dos pases ciegos sin detección de inclusiones intracitoplasmáticas.
Extracción de ADN
Las muestras de exudado vaginal se homogeneizaron y luego se transfirieron 500 μl de cada una a un microtubo estéril que se inactivó a 80°C durante 20 min. A continuación, se añadieron 100 μl de tampón NET (50 mM NaCl, 125 mM EDTA, 50 mM Tris HCl, pH 7,6) y 50 μl de SDS al 24% (3,4% de concentración final) y se incubaron a 80°C durante 10 min. Después, añadimos ARNasa a 75 μg/ml de concentración final, y se incubó durante 2 h a 50°C, seguido de proteinasa K (USB, Ohio, USA) a una concentración final de 325 μg/ml y se incubó a 50°C durante 90 min más. A continuación, añadimos un volumen 25:24:1 de fenol, cloroformo y alcohol isoamilico (Sigma-Aldrich, USA), mezclamos durante 15 min y centrifugamos a 16.060 g durante 5 min a temperatura ambiente.
Por último, se añadieron 0,6 volúmenes de isopropanol al sobrenadante y se centrifugó a 16.060 g durante 15 min. El ADN resultante se lavó con etanol frío al 70% y se centrifugó a 16.060 g durante 5 min. El ADN se resuspendió con 25 μl de agua libre de ADNasa.
Identificación molecular
La identificación molecular se realizó mediante PCR utilizando cebadores que amplifican un espaciador intergénico de ARN ribosómico 16S-23S de 342 pb. Los cebadores se diseñaron con el programa IDT SciTools Primer QuestSM, utilizando la secuencia del operón ribosómico de C. abortus A.22 depositada en GenBank con el número de acceso U68444.1 (Everett et al., 1997). Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 50 μl, incluyendo un tampón de PCR 1X, 3 mM de MgCl2, 400 μM de dNTP's, 25 pmol de cada cebador, 1 U de DreamTaq Polymerase (Thermo, USA), y 50 ng de ADN. La cepa C. abortus A.22 se utilizó como control positivo.
El protocolo de amplificación consistió en un ciclo inicial de desnaturalización de 5 min a 95°C, 40 ciclos a 95°C durante 1 min, 63°C durante 30 s, 72°C durante 1 min y una extensión final a 72°C durante 10 min. Los productos de amplificación se observaron en un gel de agarosa al 1% (Thermo, USA) teñido con bromuro de etidio (0,5 μg/ml).
Las muestras que resultaron positivas para C. abortus mediante la PCR se purificaron utilizando el sistema comercial de extracción en gel QIAquick, siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación del producto se realizó en ambas direcciones mediante el método de secuenciación por fluorescencia Taq FS Dye Terminator. La secuencia consenso y la alineación de la secuencia se lograron con el programa Vector NTI.
Las secuencias del espaciador intergénico del ARN ribosómico 16S-23S obtenidas en este estudio se sometieron a búsquedas BLAST en la base de datos GenBank. Se establecieron alineamientos múltiples utilizando las secuencias del género Chlamydia disponibles en el GenBank con los algoritmos Clustal W y Muscle incluidos en el software MEGA versión 7.0.26 (Kumar et al., 2016). La reconstrucción filogenética se realizó mediante un enfoque bayesiano con MrBayes versión 3.2 (Ronquist et al., 2012). El análisis se realizó durante 3.000.000 de generaciones con árboles de muestreo cada 100 generaciones. Los árboles con puntuaciones inferiores a las de la fase estacionaria ("burn-in") fueron descartados, y los árboles que alcanzaron la fase estacionaria fueron recogidos y utilizados para construir árboles de consenso mayoritario.
RESULTADOS
Se infectaron células L929 con muestras clínicas y se utilizó la inmunofluorescencia para visualizar las inclusiones clamidiales. En total, se encontraron inclusiones en 43 de 186 muestras evaluadas (23,11%), es decir, 18 de 82 muestras de Coahuila, 13 de 67 de Veracruz, 7 de 25 de Jalisco y 5 de 7 de Querétaro (cuadro 1).
Tabla 1 Resumen de los resultados obtenidos de las técnicas bacteriológicas y de PCR empleadas en las muestras de exudados vaginales
| Origen - Estados | Muestras | Positivo al aislamiento bacteriano | Positivo al PCR |
|---|---|---|---|
| Veracruz | 67 | 13 | 2 |
| Jalisco | 25 | 7 | 5 |
| Coahuila | 82 | 18 | 5 |
| Queretaro | 7 | 5 | 6 |
| Puebla | 5 | 0 | 0 |
| Total | 186 | 43 | 18 |
| Porcentaje total | 100 % | 23.19 % | 9.68 % |
El análisis por PCR reveló que 18 de las 186 muestras de ADN de exudado vaginal eran positivas para C. abortus. En todas las regiones muestreadas, Querétaro tuvo seis muestras positivas, Coahuila y Jalisco tuvieron cinco muestras positivas cada uno, Veracruz tuvo dos y las muestras de Puebla no tuvieron resultados positivos.
Identificamos que la zona de amplificación incluía 70 pb de la subunidad ribosomal 16S, una región intergénica de 105 pb, la subunidad ribosomal 5S de 115 pb, otra región intergénica de 3 pb y la subunidad ribosomal 23S de 49 pb. Las secuencias fueron editadas con el programa Vector NTI y se realizó una búsqueda de homología en la base de datos GenBank (BLASTn), encontrando una identidad del 100% con Chlamydia abortus EF486854, U76710, U68444, entre otras. La Chlamydia abortus FMVZ455365 fue la única cepa que presentó una homología diferente a las otras cepas, esto debido a un simple cambio en una base C/T en la posición 236, sin embargo esta cepa mostró 100 identidades con C. abortus CP031646, LS450958 y KX870501, entre otras. Las secuencias completas obtenidas para C. abortus se depositaron en el GenBank con los números de acceso FMVZ0Y55 (MZ093042), FMVZ455376 (MZ099638), FMVZ0Y54 (MZ099636), FMVZ455365 (MZ093041), FMVZ45535 (MZ093043), FMVZ9505 (MZ099635) y FMVZ9595 (MZ099634) (Figura 1).
DISCUSIÓN
Los resultados revelaron la presencia de C. abortus en cabras de cuatro de los cinco estados mexicanos muestreados. En un estudio anterior, se aisló C. abortus en cabras del estado de Guanajuato que habían abortado (Mora et al., 2015).
Existen diferentes causas de aborto infeccioso o no infeccioso en rumiantes, y la desnutrición durante la gestación parece ser la más común en los sistemas de producción caprina extensiva. La falta de alimento, las largas distancias entre las zonas de pastoreo y de refugio, la exposición a altas temperaturas y la escasez de agua potable son condiciones de pastoreo frecuentes durante la estación seca que pueden causar estrés que conduce al aborto. Sin embargo, dado que C. abortus es siempre un patógeno y no forma parte de la flora bacteriana, el aislamiento de este microorganismo en rebaños en los que varios animales presentan fallos reproductivos puede tomarse como un diagnóstico definitivo y preciso (Mellado et al., 2004; Urrutia et al., 2015; OIE, 2018).
El aislamiento es la prueba de referencia para demostrar la presencia de C. abortus, pero las inconsistencias en el cultivo celular, incluyendo la muerte durante el transporte, la conservación inadecuada de la muestra o la contaminación pueden conducir a una baja sensibilidad (Thejls et al., 1994; Sachse et al., 2009). Al complementar el aislamiento con la PCR, encontramos 18/186 (9,23%) muestras positivas. Nuestros resultados son inferiores a los descritos por Mora et al. (2015), quienes informaron de 30/125 (24%) muestras de exudado vaginal positivas a la PCR y pudieron confirmar el 88,23% de las muestras positivas obtenidas por aislamiento. En el presente estudio, la PCR solo confirmó el 42,8% de los resultados positivos observados mediante aislamiento. Es posible que hayamos observado falsos negativos debido a la baja carga bacteriana de la muestra, la contaminación cruzada de la muestra o porque otros elementos presentes en las muestras de exudado vaginal pueden haber inhibido la PCR (OIE, 2018). Se sabe que algunos elementos normalmente presentes en las muestras clínicas a veces afectan a la sensibilidad del ensayo, o incluso impiden la amplificación del ADN (Schrader et al., 2012). Entre estos elementos se encuentran los polisacáridos, el calcio, el colágeno, la hemoglobina, la sacarosa y las proteinasas que se originan en el propio animal o en su flora bacteriana.
Por el contrario, aunque inferior a la de Mora et al. (2015), nuestra tasa de confirmación de positividad por PCR fue superior a la reportada por Campos-Hernández et al. (2014). En ese estudio, que evaluó 246 muestras mediante PCR, la presencia de C. abortus solo pudo confirmarse en el bazo de un feto abortado. Asimismo, nuestros resultados de positividad por PCR son superiores a los de algunos estudios europeos. Un informe de Italia (Chisu et al., 2013) utilizó la PCR para detectar 3/40 (7,5%) muestras positivas en rebaños de ovejas con alta incidencia de abortos. En contraste con nuestro estudio, su evaluación tenía menos muestras, pero estas provenían de placentas. Por otro lado, un estudio en Alemania (Lenzko et al., 2011) muestreó 32 rebaños de cabras con tasas de aborto inferiores al 1%. Analizaron 352 exudados vaginales mediante PCR, y sus resultados revelaron que 28 animales (7,95%) eran positivos a C. abortus. Estos datos indican que las infecciones por Chlamydia ocurren con frecuencia en esta región incluso en ausencia de altas tasas de aborto, esto podría deberse a la endemicidad de la enfermedad en la región (Lenzko et al., 2011).
Aunque las placentas y los fetos abortados son los tejidos con mayor carga bacteriana y, por tanto, la mejor fuente para el aislamiento bacteriano (Sachse et al., 2009; Rodolakis y Laroucau, 2015), las condiciones de cría del rebaño muestreado hacían inviable la recogida de estos tejidos. La mayoría de los rebaños de nuestro estudio se mantienen bajo sistemas de manejo extensivo, donde las cabras sin supervisión recorren muchos kilómetros para llegar a los pastos comunales. Como estas condiciones de campo hacen inviable la recuperación y recogida de fetos y placentas, en su lugar tomamos muestras de exudados vaginales. Los estudios realizados tanto en México como en otros países han demostrado que los exudados vaginales son muestras adecuadas y pueden utilizarse ampliamente para el diagnóstico. (Papp et al., 1994; Jiménez-Estrada et al., 2008; Gutierrez et al., 2011; Campos-Henández et al., 2014; Mora et al., 2015; Laroucau et al., 2018; O' Neill et al., 2019)
Aunque se acepta que trabajar con tejidos que tienen una alta carga bacteriana favorece el nivel de sensibilidad de la PCR (Livingstone et al. 2009), otros estudios en México han utilizado con éxito la PCR para detectar C. abortus en exudados vaginales. En 2008, un estudio analizó 304 exudados vaginales de ovejas con historial de abortos procedentes del Estado de México. Este estudio encontró un 0,65% de positividad (Jiménez-Estrada et al., 2008) que es una tasa de positividad menor que la de nuestros resultados. Es posible que las prácticas ganaderas que permiten la interacción entre ovejas y cabras predispongan la diseminación de Chlamydia entre rebaños.
Como parte de la identificación de las especies de Chlamydia implicadas en nuestro estudio, y concretamente para descartar la posibilidad de que otra bacteria sea responsable de los abortos en las cabras (concretamente C. pecorum), fue necesario complementar la PCR con la secuenciación de fragmentos amplificados.
Las secuencias mostraron una alta identidad con la mayoría de las secuencias de C. abortus, disponibles en las bases de datos. Se obtuvo un resultado similar cuando se realizaron análisis filogenéticos, observando poca variación en el clado de C. abortus FMVZ455365, que un aparentemente separado de las cepas mexicanas de C. abortus con una probabilidad posterior del 98 y 99%, respectivamente.
A partir de 2016, la clamidiasis se considera endémica en México (DOF, 2016). Antes de esto, había sido considerada exótica, lo que impedía la implementación de técnicas de diagnóstico y medidas de control, lo que a su vez favorecía la propagación de la enfermedad. Es posible que las consecuencias de la presencia de Chlamydia abortus en México sean similares a las reportadas a nivel mundial, y que la falta de herramientas de detección necesarias haya favorecido su presencia en México sin que se haga evidente (Sachse et al., 2009). Además, el análisis de los estudios de ovejas y cabras puede mostrar que la bacteria se ha diseminado por todo el país, pero no en la misma proporción en las diferentes regiones. De hecho, los resultados serológicos positivos de zonas de México con importantes poblaciones caprinas (distribuidas por el norte, centro, oeste y este del país) parecen mostrar que la falta de diagnóstico rutinario antes del transporte de los animales ha fomentado la diseminación de la enfermedad, y los riesgos sanitarios y socioeconómicos concomitantes (Mora et al., 2015; Campos-Henández et al., 2014; Jiménez-Estrada et al., 2008).
El objetivo de nuestro estudio fue determinar la presencia de Chlamydia spp. en algunas regiones importantes de producción caprina en México. Aunque el tipo de muestreo que utilizamos no nos permitió medir la prevalencia de la enfermedad, nuestros resultados mostraron que Chlamydia abortus se aisló en el 23% de las cabras que habían sufrido abortos. Esto evidencia que C. abortus es un patógeno importante que requiere atención así como la implementación de medidas de control, tanto en cabras como en otras especies productivas en las que tenemos evidencia de la enfermedad. Estudios serológicos recientes en vacas lecheras mexicanas con abortos y trastornos reproductivos mostraron que de un total de 833 muestras analizadas, 90 (10,8%) resultaron positivas a C. abortus. En el estado de Guanajuato, el 6% (15/237) de los animales resultaron seropositivos y el 18,5% (15/81) de los rebaños muestreados tienen al menos un animal seropositivo (Limón et al., 2011). En un estudio serológico realizado en rebaños de ovejas entre 2011 y 2013, se analizaron 5.321 muestras de sangre de ovejas de 209 unidades de producción de 61 municipios de siete estados de México, y se encontraron tasas de positividad entre el 24% y el 67% (Palomares et al., 2020). Es necesario realizar más investigaciones sobre la prevalencia y la distribución de C. abortus para entender mejor su impacto en las cabras y la producción en México. También es necesario implementar medidas pertinentes para controlar y prevenir la transmisión de C. abortus entre los animales para evitar la infección humana. Además, es necesario prestar especial atención a la educación y concienciación sobre el riesgo de la enfermedad para las personas que trabajan directamente con los animales, así como en los laboratorios de microbiología, dado que los casos humanos de infecciones por C. abortus se derivan de la exposición a ovejas y cabras infectadas, aerosoles y materiales contaminados (Longbottom y Coulter, 2003; Ortega et al., 2015; Pichon et al., 2020).
CONCLUSIÓN
El presente estudio confirma que Chlamydia abortus se encuentra en cabras mexicanas que han tenido abortos, en los estados de Coahuila, Jalisco, Querétaro y Veracruz. Además, que Chlamydia abortus es el agente etiológico de la clamidiosis, lo que apoya y confirma la presencia de clamidiosis en México. Es de suma importancia estudiar la distribución de esta bacteria en todo México, con el fin de implementar medidas de prevención y control para evitar la propagación de la enfermedad, así como para disminuir el riesgo de infección en humanos.
