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INTRODUCCIÓN
La Fasciolosis, es una enfermedad helmíntica distribuida a nivel mundial que afecta al ganado bovino, ovino y caprino, así como al hombre y otros mamíferos (Olaechea 2004). Para completar su ciclo biológico Fasciola hepatica necesita dos hospedadores, uno intermediario, un caracol de la familia Lymnaeidae, y otro definitivo, que es un mamífero (Cruz 2011). La Fasciolosis es una de las enfermedades parasitarias más importantes, que provoca pérdidas económicas para los ganaderos, ocasionando baja producción y mala calidad de leche, reduce la tasa de crecimiento, ocasiona trastornos reproductivos, y la mortalidad. Los moluscos dulceacuícolas representan el eslabón más débil de la cadena de transmisión de muchos parásitos que requieren hospedadores intermediaros como la F. hepatica. Para el control de la parasitosis, lo recomendable es la disminución de las poblaciones de moluscos, lo que reduce la probabilidad de infección y transmisión al hospedero definitivo (Wong et al. 2010).
Para el control de los hospederos intermediarios los métodos más utilizados han sido los químicos inorgánicos y orgánicos (Becerra 2001). Debido a que los molusquicidas de origen sintéticos provocan la alteración de la estructura del medio ambiente, actuando como biocidas no específicos, con alto costo (Lannacone et al. 2008, Belete 2015, Njeh et al. 2016). En las tres últimas décadas se ha incrementado el interés en el campo de los productos naturales, lo que ha estimulado la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos para aplicaciones farmacéuticas o agroquímicas, como insecticidas, acaricidas, fungicidas, herbicidas, molusquicidas, entre otros, como loa extractos de L. racemosa y R. mangle (Alemán et al. 2011, Regalado et al. 2016).
En el estado de Tabasco, las dos especies de mangle con mayor distribución y abundancia son L. racemosa y R. mangle (CONABIO 2009, CONABIO-CONANP 2009). Estas dos especies de mangle tienen alto contenido de taninos, que constituyen los componentes mayoritarios de R. mangle (80 %), por lo que ha sido utilizado para la obtención de fitofármacos debido a sus propiedades medicinales que posee (Alemán et al. 2011, Regalado et al. 2016). Al respecto Rangel et al. (2016) probaron la eficiencia de extractos obtenidos por el método de reposo en crudo (EMRC), por infusión (EMI) y aplicación directa del polvo (ADP) de R. mangle sobre G. cubensis, obteniendo los mejores resultados para el EMI, con DL50 a 8.57 g L-1 y DL90 a 15.83 g L-1. El objetivo del presente trabajo es el evaluar la eficiencia molusquicida de L. racemosa sobre G. cubensis con dos extractos acuosos y una aplicación directa del polvo.
MATERIALES Y MÉTODOS
La colecta de G. cubensis se realizó de septiembre a noviembre de 2012, en el Rancho La Nueva Luz, en la ranchería Jahuacapa del municipio de Jalapa, Tabasco. Ubicado entre los 17o 44' 25.76" LN y los 92o 50' 25.25" LO. Los caracoles se recolectaron mediante colecta libre, el sustrato usado como sustrato en los terrarios fue sedimento y algas colectado del medio. Los terrarios para aclimatación de los caracoles fueron tinas de un 1 m3.
Se recolectaron 10 kg de hoja de L. racemosa en la localidad Arroyo Polo en el municipio de Centla, Tabasco, ubicado entre los 18o 30' 10.99" LN y los 92o 39' 3.64" LO. L. racemosa es un arbusto o árbol de hasta 20 m de alto, con 60 cm de diámetro de tallo a la altura del pecho. Su tronco es recto con ramas ascendentes, copa redonda y densa. Su distribución en México es de Tamaulipas a Yucatán por el Golfo de México, y de Baja California hasta Chiapas por el Océano Pacifico (CONABIO-CONANP 2009).
Para la obtención del EMRC a concentración de 500 g L-1, se pesaron 5 kg de hoja y se licuaron en 10 L de agua, el extracto se dejó reposar por cinco días, trascurrido el tiempo se retiró el material vegetal por filtrado. Para obtener las concentraciones de 400, 333 y 286 g L-1, se realizaron las diluciones correspondientes. Para el EMI se pesaron 1.5 Kg de hojas, las cuales se deshidrataron a temperatura de 60 ± 2 oC por 24 h, para luego triturarlas en un molino casero, y mezclar 50 g del polvo en 1.0 L de agua, que se puso a hervir por 10 min, y dejó enfriar a temperatura ambiente. Cuando el extracto se enfrió, se filtró para obtener la concentración de 50 g L-1, de la misma manera se repitió el procedimiento para obtener las concentraciones de 25, 12.5 y 6 g L-1. Para la ADP se pesaron 0.135, 0.270 y 0.540 g de las hojas molidas para aplicarlas de forma directa.
Se determinó el pH, temperatura y salinidad de los extractos y el polvo de L. racemosa. La toxicidad de los extractos EMRC y EMI se realizó bajo un diseño completamente al azar, con cuatro concentraciones y un testigo con cinco repeticiones. Para la ADP se probaron solo tres concentraciones. Para la evaluación del EMRC, EMI y ADP se elaboraron 75 terrarios en charolas de plástico de 15 cm de diámetro, a los cuales se les agregaron 200 g de sustrato esterilizado, y se saturo con agua declorinada con el fin de simular el hábitat donde se encuentran los caracoles. En cada terrario se colocaron 10 caracoles y se aplicaron 3 ml de los extractos acuosos con un aspersor, y 0.135, 0.270 y 0.540 g para la aplicación directa del polvo. Después de 2 h post tratamiento y luego cada 2 h se registró el número de caracoles vivos y muertos. Como referencia de mortalidad se tomó el movimiento del cuerpo ante la luz y al tacto con una aguja de disección.
Eficacia de los tratamientos
La eficacia de cada tratamiento se calculó por la comparación del número de caracoles vivos y muertos, con el número de caracoles del grupo control. Para lo cual se realizaron evaluaciones cada 2 h hasta las 24 h y luego a las 48, 72 y 96 h, de acuerdo con Abbott (1987) y Otranto et al. (2005). Para lo cual se aplicó la siguiente formula: Porcentaje de eficacia = (número promedio de caracoles vivos en el lote control - número promedio de caracoles vivos en los lotes tratados) / número promedio de caracoles vivos en el lote control) X 100.
Residualidad del extracto acuoso de EMI a 50 g L-1 de L. racemosa en el sustrato
Para determinar el tiempo en el que el extracto acuoso por infusión de L. racemosa obtenido por infusión a 50 g L-1, provoca una mortalidad superior al 90 % de los caracoles, se evaluó su residualidad después de 2, 4, 6, 8 y 10 h de la aplicación y se comparó con el testigo de sustrato y agua destilada (Arcila et al. 2013). La mortalidad se determinó cada 2 h hasta las 10 h.
Análisis estadíticos
Para establecer las diferencias entre las concentraciones, se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis y la prueba de Rangos Múltiples con el programa estadístico de Statgraphics Centurión XV. Para establecer las diferencias de la efectividad de la residualidad del extracto en el sedimento, se aplicó un ANOVA Factorial (p ≤ 0.05). Para determinar la DL50 y DL90 se utilizó regresión Probit-Log, con el programa SPSS Versión 20. El tiempo letal TL50 y TL90 para cada concentración se consideró, como el tiempo que tarda en morir el 50 y 90 % de los caracoles, respectivamente.
RESULTADOS
Los extractos acuosos de L. racemosa y la aplicación en polvo tuvieron diversos grados de toxicidad para G. cubensis. Para el EMRC la mortalidad acumulada a las 96 h fue del 100, 96, 90 y 66 % para las concentraciones de 500, 400, 333 y 286 g L-1, respectivamente. Presentando diferencias significativas solo la concentración de 286 g L-1 (P = 0.0017). De acuerdo con el análisis Probit-Log la DL50 se obtuvo a concentración de 267.559 g L-1 y la DL90 a 392.683 g L-1 (Figura 1). El TL50 se presentó a las 10, 14, 16 y 48 h para las concentraciones de 500, 400, 333 y 286 g L-1, respectivamente; y el TL90 a las 18, 72 y 96 para las concentraciones de 500, 400, 333 g L-1 (Tabla 1).
Figura 1. Mortalidad de G. cubensis por la aplicación del extracto acuoso de L. racemosa obtenido por el método de reposo en crudo.
Tabla 1. Tiempos letales de dos extractos acuosos y aplicación directa de polvo de L. racemosa sobre G. cubensis.
- tiempo no alcanzado.
El EMI presento una mortalidad acumulada a las 96 h de 100, 98, 92 y 20 % para las concentraciones de 50, 25, 12.5 y 6 g L-1, respectivamente; presentando diferencias significativas las concentraciones de 6 y 12.5 g L-1 (P = 0.0020) contra las de 50 y 25 g L-1. Para este extracto la DL50 fue de 8.076 g L-1 y la DL90 de 12.776 g L-1 (Figura 2). El TL90 se presentó a las 2 h para las concentraciones de 50 y 25 g L-1 y a las 14 h en la de 12.5 g L-1. Hasta las 96 h la concentración de 6 g L-1 no alcanzo la TL50 (Tabla 1).
Figura 2. Mortalidad de G. cubensis por la aplicación del extracto acuoso de L. racemosa obtenido por el método de infusión.
La aplicación directa en polvo (ADP), tuvo una mortalidad acumulada a las 96 h de 50, 48 y 48 % para las concentraciones de 0.540, 0.270 y 0.135 g, respectivamente; no presentándose diferencias significativas entre ellas (P = 0.0682). La DL50 se tuvo a una concentración de 1.0 g y nunca se alcanzó la DL90, la cual de acuerdo al análisis Probit-Log se debe presentar en una concentración de 648.941 g (Figura 3). Mientras que la TL50 se tuvo a las 72 h (Tabla 1).
Eficacia de los tratamientos
La mayor eficacia para los tratamientos del EMRC la tuvo la concentración de 500 g L-1 con el 100 % a las 72 h de la aplicación; siguida de la concentración de 400 g L-1 con 96 % de eficacia a las 96 h; mientras que la concentración de 333 g L-1 tuvo una eficacia del 90 % a las 96 h. Para los tratamientos del EMI la concentración de 50 g L-1 tuvo el 100 % de eficacia a las 2 h; siguido de la concentración de 25 g L-1 con el 98 % de eficacia a las 2 h; mientras que las concentraciones de 12.5 y 6 g L-1 tuvieron una eficacia del 92 % a las 14 h y del 20 % a las 24 h, respectivamente. Para la AP, ninguna concentración supero el 90 % (Tabla 2). Debido a que en los bioensayos no se encontraron mortalidades diferentes a cero en ninguno de los lotes testigo, los resultados de eficacia corresponden a mortalidad promedio a las 96 h de exposición.
Evaluación de la residualidad del EMI a 50 g L-1
La residualidad del EMI a 50 g L-1 tuvo baja persistencia de toxicidad sobre el sustrato. La mortalidad de G. cubensis fue del 100 % a las 2 h y del 58 % a las 4 h (Tabla 3); mientras que el testigo no tuvo mortalidad. La mortalidad promedio entre los lotes a las 2 y 4 h fueron diferentes, en los tiempos de 6, 8 y 10 h (P= 0.0000), mientras que los lotes de los tiempos 5, 6 y 8 h y el testigo no fueron diferentes (p ≥ 0.05) (Figura 4).
Tabla 3. Residualidad del extracto acuoso de L. racemosa por el EMI a 50 g L-1.
Promedios con las mismas letras no son diferentes estadísticamente (p ≥ 0.05)
DISCUSIÓN
De los dos extractos acuosos, el EMI tuvo el mayor porcentaje de mortalidad, el cual fue superior al 90 % en la concentración de 12.5 g L-1 a las 14 h, seguida de la concentración de 25 y 50 g L-1 a las 2 h. El EMRC tuvo tres concentraciones que superaron el 90 % de mortalidad, con concentraciones que son superiores a las del EMI. Los resultados obtenidos por el método de eficacia son similares a los resultados obtenidos del análisis Probit-Log, que indican que se obtuvo una DL90 de 12.776 g L-1 a las 14 h. Este mismo comportamiento se observó con el EMI del mangle rojo (Rhizophora mangle) en concentración 15.83 g L-1 en la DL90 (Rangel et al. 2016). La disminución de la residualidad del extracto a 50 g L-1 del 100 al 58 % a las 4 h, muestra una alta efectividad y baja persistencia. Por lo que la mejor opción para la aplicación en campo es la concentración de 50 g L-1 para tener el 100 % de mortalidad a las 2 h de exposición, por su mayor eficacia en el menor tiempo y baja residualidad. La eficiencia en los extractos de L. racemosa, probablemente se debe a su composición química de sus compuestos activos, como esteroides, taninos, antocianinas y saponinas (Bandaranayake 2002). Los taninos tienen interés especial como fitofármacos, debido a sus propiedades medicinales, también se aplican contra diferentes especies de helmintos como F. hepatica. Los cuales se encuentran en gran concentración en L. racemosa (Rangel et al. 2016), destacando la presencia de epicatequinas, catequinas, ácido clorogénico, ácido gálico, ácido egálico, galotaninos, elagitaninos y taninos condensados con actividad antiséptica, antibacteriana, antifúngica, entre otras (Alemán 2011).
El tiempo de permanencia del extracto en condiciones de campo depende de las características del suelo en que se aplique, entre ellas el relieve, composición física y química, vegetación, permeabilidad, contenido de minerales, materia orgánica, proporción de arcilla, arena, grava y otros factores como el clima. El suelo en donde se colectaron los caracoles y de donde se tomó el sedimento para los cultivos y terrarios de prueba de este trabajo es de tipo fluvisol formado por sedimentos aluviales obscuros, de textura media a media-gruesa (franco arenoso a arcillosa) bien estructurada, con contenido medio de materia orgánica, con pendiente menor a 2 % y sujeto a inundación por algunos días (Palma-López et al. 2007, Zavala Cruz et al. 2011). Es necesario tomar en cuenta que L. racemosa se encuentra sujeta a protección por la Norma Oficial Mexicana NOM-059-2010-SEMARNAT (SEMARNAT 2010) que la coloca en la categoría de amenazada, además de su protección por la NOM-022-SEMARNAT-2003 (SEMARNAT 2003) por el peligro de desaparecer a corto o mediano plazo. Por lo anterior para el uso extensivo de las hojas de mangle blanco, estas se tienen que obtener de plantaciones especiales como Unidades de Manejo Forestal (CONAFOR 2013, Rangel et al. 2016).
CONCLUSIONES
El EMI a 50 g L-1 de L. racemosa es un buen molusquicida, eficaz en bajas concentraciones con rápida acción y baja persistencia, lo que evita efectos colaterales sobre la diversidad de organismos que habitan junto a G. cubensis. Crece en zonas costeras, tiene alta capacidad de regeneración de las partes utilizadas para la elaboración del extracto, por lo que no se daña la planta y los procedimientos de extracción son fáciles y económicos.
