Sustancias químicas

En la elaboración de las nanopartículas se empleó gelatina tipo A (Sigma-Aldrich, EUA), Ca(NO₃)₂·4H₂O (Meyer, México) y ácido cítrico (Merck, Alemania) como agente entrecruzante. En todos los experimentos y análisis se utilizó agua desionizada (18 MΩ·cm^-1).

Síntesis de nanopartículas de gelatina cargadas con calcio

Para sintetizar las nanopartículas se pesaron 3.8 g de Ca(NO₃)₂·4H₂O y se disolvieron en 300 mL de agua desionizada; de manera simultánea, se disolvieron 4.5 g de gelatina en 700 mL de agua desionizada a 80 °C. Previo a ser mezcladas entre sí, ambas soluciones se filtraron a través de membranas de PVC de 0.45 µm (Millipore, Irlanda). La solución resultante se mantuvo en agitación durante 2.5 h a 80 °C y se sonicó por 15 min en un baño ultrasónico (TI-H-5, Elma, Alemania). Posteriormente, se agregaron a la solución 1.2 g de ácido cítrico y se mantuvo en agitación por 12 h a temperatura ambiente. Finalmente, se sonicó la solución durante 15 min y se filtró con una membrana de PVC con diámetro de poro de 0.22 µm (Millipore, Irlanda).

Para generar las nanopartículas se empleó un Nano Spray Dryer B-90 (Büchi, B-90, Suiza) con una rejilla de 4 µm. La temperatura de secado fue de 100 °C a una presión de 3 500 Pa y 100 % de apertura de boquilla. Para obtener las nanopartículas sin carga de calcio (testigo), se utilizó la metodología mencionada anteriormente, pero sin la adición de nitrato de calcio en el proceso.

Microscopia electrónica de barrido

La morfología y tamaño de las partículas se estudiaron con un microscopio electrónico de barrido (JSM-6390LV, JEOL, Japón). Previo al análisis, las muestras se recubrieron con oro-paladio mediante sputtering (Desk IV, Denton Vacuum). Las micrografías se obtuvieron a una magnificación de 10 000 X con un voltaje acelerador de 20 kV. El tamaño promedio se calculó a partir de la medición de 400 partículas con el programa Scandium (Olympus, ResAlta Research Tecnologies, Golden, CO, USA, 2010).

Espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier

Para evaluar las posibles interacciones entre la carga de calcio y la gelatina dentro de la nanopartícula, se realizaron determinaciones de FTIR con el equipo Cary 630 (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA). Para los análisis se utilizó una celda de reflectancia total atenuada (ATR), un intervalo de 4 000 a 600 cm^-1 y una resolución de 4 cm^-1 a los 32 scans.

Cuantificación de calcio y pruebas de liberación

La cuantificación de calcio total contenido en los nanomateriales se realizó con un equipo de espectroscopia de emisión atómica de inducción por plasma acoplado (ICP-OES 725, Agilent Technologies, EUA). Previo a las determinaciones, las muestras se sometieron al procedimiento de digestión húmeda propuesto por ^{Alcántar-González y Sandoval-Villa (1999)}.

La liberación de calcio a través del tiempo se determinó siguiendo la metodología propuesta por ^{Miranda-Villagómez et al. (2019)}, utilizando un espectrómetro de absorción atómica (PinAAcle 900, PerkinElmer, EUA). Para la determinación se prepararon varias soluciones con 0.30 g del material encapsulado y 50 mL de agua desionizada, las cuales se mantuvieron en agitación constante durante 30, 60, 90 y 120 min, 24, 48 y 72 h. Paralelamente, se evaluó la liberación de Ca²⁺ por parte del Ca(NO₃)₂·4H₂O y de las nanopartículas sin carga (testigo).

Análisis estadístico

Los datos obtenidos, de la cuantificación y liberación de calcio, se sometieron a un análisis de varianza y, posteriormente, a una prueba de comparación de medias de Fisher (P ≤ 0.05), para lo cual se empleó el programa estadístico Design Expert ver. 8.0 (Stat-Ease, Inc. MN, EUA). Los análisis se realizaron por triplicado y los resultados se presentaron como la media ± desviación estándar.

Microscopia electrónica de barrido

El tamaño y la forma de las nanopartículas obtenidas en esta investigación son el resultado de las condiciones de síntesis y de la técnica empleada, ya que estos dos factores proveen los medios para adaptar las propiedades de los materiales a una aplicación específica (^{Li, Anton, Arpagaus, Belleteix, & Vandamme, 2010}).

La Figura 1 muestra la morfología y la distribución de tamaño de las partículas de gelatina con y sin carga de calcio. En las Figuras 1A y 1C se observa que, independientemente de la incorporación de calcio, ambos grupos de partículas presentaron perímetros definidos, con formas mayoritariamente esféricas y superficies lisas. En cuanto al tamaño y su distribución (Figuras 1B y 1D), no se observaron cambios al incorporar iones de Ca²⁺, ya que los tamaños promedio de las partículas, con y sin carga, fueron de 680 y 698 nm, respectivamente.

Figura 1 Morfología y distribución de tamaño de nanopartículas de gelatina con y sin carga de calcio. Micrografía de partículas con carga de calcio (A) y sin carga (C). Histograma de distribución de tamaño de partículas con carga de calcio (B) y sin carga (D). 

El tamaño y morfología de las partículas se pueden atribuir a factores como la naturaleza del polímero empleado y su concentración, el diámetro del orificio de la rejilla empleada en el equipo Nano Spray Dryer B-90 (^{Beck-Broichsitter et al., 2012}; ^{Schafroth, Arpagaus, Jadhav, Makne, & Douroumis, 2012}), la temperatura de secado, el caudal de gas o velocidad de alimentación (^{Richard & Benoit, 2000}) y el contenido de solutos dentro de cada gota formada antes del secado (^{Kumar, Bhanjana, Sharma, Sidhu, & Dilbaghi, 2014}). En esto último, se ha encontrado que existe una correlación estrecha entre el tamaño de la gota a pulverizar y el tamaño de partícula sólida obtenida después del secado, tal como lo reportan ^{Schmid, Arpagaus, y Friess (2011)} en trabajos realizados con albumina de suero bovino. Por su parte, ^{Li et al. (2010)} mencionan que la distribución del tamaño de partículas de cloruro de sodio, obtenidas con el mismo tipo de equipo, estuvo relacionada con la concentración de la muestra.

Espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier

La Figura 2 muestra los espectros FTIR del nitrato de calcio y de las nanopartículas, con y sin carga. El espectro de las partículas sin carga (testigo) reveló bandas de absorción características de la gelatina a 1 633 cm^-1 (amida I, tensión del enlace C=O) y 1 529 cm^-1 (amida II, tijereteo del enlace N-H y tensión del enlace C‒N) (^{Lai, Chenga, Yang, & Yen, 2018}). Por su parte, las bandas de absorción registradas en el intervalo de 1 300 a 1 500 cm^-1 en el espectro del Ca(NO₃)₂·4H₂O son atribuidas a tensiones asimétricas de los enlaces N‒O en los iones nitrato (^{Ofer-Rozovsky et al., 2019}).

Figura 2 Espectros de FTIR de la fuente de calcio y de las nanopartículas de gelatina con y sin carga de calcio. 

La incorporación del calcio en la gelatina conllevó a cambios identificables en el espectro FTIR del nanofertilizante. El ensanchamiento y desplazamiento de la banda a 1 310 cm^-1, y la notable disminución en la intensidad de la banda a 1 415 cm^-1 son visibles. Adicionalmente, se observa una disminución en la intensidad de las bandas correspondientes a las amidas I y II de la proteína. Con estos resultados se puede inferir que los iones de Ca²⁺ fueron adsorbidos por las moléculas de gelatina mediante la coordinación de los iones con los grupos carbonilo (C=O) de la amida.

Cuantificación de calcio y pruebas de liberación

La cuantificación de calcio por ICP arrojó que las nanopartículas cargadas contenían 60.28 g·kg^-1 de calcio, valor que resulta semejante al teórico calculado (67.20 g·kg^-1), y la concentración en el nitrato de calcio resultó ser la esperada (163.12 g·kg^-1 de calcio). Por su parte, las partículas sin carga presentaron una concentración de 0.876 g·kg^-1 de calcio, la cual se puede atribuir a la gelatina, ya que en dicho material se obtuvo una concentración 0.840 g·kg^-1 de calcio.

La Figura 3 muestra las curvas de liberación de calcio de las nanopartículas, el nitrato de calcio y la gelatina, a través del tiempo. En dicha figura se puede observar que solo las partículas cargadas presentaron un incremento de 97.6 a 154.1 g·kg^-1 en la concentración de calcio conforme transcurrió el tiempo. Dichos valores fueron significativamente diferentes (P < 0.05) de los obtenidos con el nitrato de calcio, a excepción de la determinación a las 72 h en donde este compuesto presentó un valor de 164.2 g·kg^-1. Lo anterior permite asumir que en este punto se logró la liberación total de la carga de la matriz biopolimérica. Los otros compuestos analizados presentaron una variación pequeña en la concentración de calcio, obteniéndose valores promedio de 3.7 g·kg^-1 en las partículas sin carga y de 2.9 g·kg^-1 en la gelatina.

Figura 3 Curva de liberación de calcio a través del tiempo. 

Debido al comportamiento observado de las nanopartículas cargadas con calcio, estas se pueden definir como un sistema de control de difusión, más específicamente como un sistema de nanoesfera, ya que el agente activo se encuentra distribuido uniformemente en toda la matriz polimérica y la velocidad de liberación está determinada por la carga o concentración del agente disperso, la naturaleza de los componentes y la forma de la partícula (^{Lshizawa y Nakamatsu, 2002}). ^{Rai et al. (2015)} mencionan que la preparación de formulaciones nanométricas de insumos de nutrientes puede tener un efecto sobre la eficiencia del fertilizante, provocando un comportamiento diferente al de un fertilizante convencional. Lo anterior se puede observar en la Figura 3, donde la concentración de calcio en solución presentó un ligero aumento en la primera hora y media de agitación, para después mantenerse casi constante hasta las 48 h e incrementar nuevamente a las 72 h, lo que indica que la formulación polimérica ayudó a retardar la liberación del calcio. Lo anterior implicaría que los iones de calcio cercanos a la superficie de las partículas serán los que se desprenden primero de la matriz, dejando cavidades que se convierten en vías por las cuales el calcio del interior puede liberarse más rápidamente, lo que ocasiona un incremento del elemento en el medio.