Reactivos y materiales biológicos

Hojas de Coffea arabica L. cv. Catimor 5000, secadas al aire, se consiguieron a través del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) en Xalapa, Veracruz, México. Todos los reactivos utilizados fueron Sigma-Aldrich (Estado de México, México). Las células de adenocarcinoma de colon (HT-29) provinieron de American Type Culture Collection (ATCC® HTB-38™, CDMX, México).

Preparación de extractos

Para la preparación de las infusiones de hojas de Coffea se añadió 1 g de material molido a 100 mL de agua destilada a 80 °C y se dejó reposar durante 10 min. Las infusiones se liofilizaron y se mantuvieron protegidas de la luz y la humedad hasta su análisis.

El material vegetal se sometió a EAU a temperatura constante (<35 °C), utilizando una sonda de 13 mm (Sonifer® SFX250, BRANSON®) con profundidad de 2.5 cm, volumen de solvente de 200 mL, relación solvente-sólido (10:1.5), frecuencia de 20 KHz, potencia de 250 W y pulsos intermitentes de 5 s ON / 5 s OFF (^{Hossain et al., 2012}). Los factores variables fueron el tiempo de extracción (3, 6 y 9 min), el porcentaje de amplitud de onda (20, 30 y 40 %) y la relación de solventes agua/metanol (100/0, 60/40 y 20/80 v/v).

Contenido de fenoles totales

En una microplaca de 96 pozos se colocaron 25 μL de extracto a una concentración de 0.1 mg∙mL^-1 por triplicado, luego se añadieron 80 μL de agua destilada y 5 μL de reactivo Folin-Ciocalteu 2 N. La placa se tapó y se agitó durante 5 min, después se añadieron 80 μL de Na₂CO₃ al 7 % a cada pozo. Las muestras reposaron durante 30 min y se leyó su absorbancia a 765 nm (ELISA SYNERGY HT, Microplate Reader BioTek; Winooski, VT, EE. UU.). Los resultados se expresaron como mg equivalentes de ácido clorogénico por mg de extracto.

Contenido de flavonoides

En una microplaca transparente de 96 pozos se colocaron 20 μL de extracto a 0.1 mg∙mL^-1 y, posteriormente, 7.5 μL de NaNO₂ al 5 %, 15 μL de AlCl₃ al 10 %, 50 μL de NaOH 1 M y 157 μL de agua destilada se añadieron en cada pozo. La placa se agitó durante 1 min y se dejó reposar en la oscuridad durante 5 min. Después, se leyó la absorbancia a 570 nm como se indicó anteriormente. Los resultados se expresaron como mg de equivalentes de catequina por mg de extracto.

Identificación de compuestos fenólicos por HPLC-ESI-MS/MS

Los extractos se prepararon a 10 mg∙mL^-1 disueltos en metanol para HPLC. Se utilizó un cromatógrafo líquido de ultra alta resolución Acquity HPLC® (Waters, Milford, MA, EE. UU.) acoplado a un espectrómetro de masas (HPLC/MS) con un módulo de ionización por electrospray negativo (ESI^-). Se utilizó una columna ZORBAX RRHD Eclipse XDB-C18 de fase inversa (2.1 x 150 mm, 1.8 μm) (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) y se mantuvo a 30 °C. Se utilizaron las fases móviles 7.5 mM de ácido fórmico en agua desionizada (fase A) y acetonitrilo (fase B) a 0.21 mL∙min^-1 y 20 min de tiempo total de ejecución. El programa de gradiente binario fue: 0 min, 97 % A; 1.88 min, 91 % A; 5.66 min, 84 % A; 16.9 min, 50 % A; 19.62 a 20 min, 97 % A (^{Díaz-Rivas et al., 2018}).

El espectrómetro de masas se ajustó a 150 °C, temperatura de solvatación de 450 °C, flujo de gas de cono de 151 L∙h^-1 y flujo de N₂ de 796 L∙h^-1. Como cosolvente se usó metanol con 0.1 % de ácido fórmico. Se utilizó el modo de ionización de reacciones múltiples para los ensayos LC-MS/MS a un voltaje capilar de 2.5 kV, temperatura de desolvatación de 400 °C, temperatura de la fuente de 150 °C, flujo de gas de desolvatación de 800 L∙h^-1 y flujo de gas de cono de 150 L∙h^-1; el flujo de gas de colisión fue de 0.13 mL∙min^-1, energía de colisión de modo MS de 5.0 y la energía de colisión de modo MS/MS de 20.0. El volumen de inyección fue de 1 µL. La abundancia de ácidos fenólicos y flavonoides se calculó mediante curvas de calibración de varios estándares y se expresaron en µg∙g^-1.

Identificación de metilxantinas por HPLC-ESI-MS/MS

Se utilizó un espectrómetro ACQUITY HPLC® con acoplamiento de masa (HPLC/MS-MS) en módulo de ionización por electrospray positivo (ESI+) y un detector de triple cuadrupolo. Se utilizó una columna ACQUITY HPLC® HSS T3 de 1.8 μm a 40 °C; las muestras se mantuvieron a 6 °C y el volumen de inyección a 1 μL. Los extractos se prepararon a 10 mg∙mL^-1 disueltos en metanol para HPLC. Se utilizó una fase móvil binaria con solventes A (ácido fórmico a 0.1 % en agua) y B (ácido fórmico a 0.1 % en metanol) a 0.3 mL∙min^-1 y 12 min de tiempo total de ejecución. El gradiente de elución fue: 0 min, 99 % A; 1.5 min, 95 % A; 3 min, 80 % A; 5.5 min, 45 % A; 5.8 min, 2 % A; 7.6 a 12 min, 99 % A. Los parámetros de MS fueron temperatura de la fuente, 150 °C; temperatura de solvatación, 450 °C; voltaje del cono, 30 V; flujo de gas del cono, 150 L∙h^-1; y flujo de N₂, 800 L∙h^-1. Los patrones de fragmentación para 1,3,7-trimetilxantina (cafeína), 1,3-dimetilxantina (teofilina) y 3,7-dimetilxantina (teobromina) se evaluaron como lo indican ^{Huck, Guggenbichler, y Bonn (2005}). La abundancia se calculó mediante curvas de identificación de picos y se expresaron en mg∙g^-1.

Actividad antioxidante por capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC)

En una microplaca oscura de 96 pozos se añadieron 20 μL de extracto preparado a 0.01 mg∙mL^-1 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con pH 7.4 y 200 μL de fluoresceína a 1.09 µM. Después de la incubación (15 min a 37 °C) se tomó una primera lectura, luego se añadieron 75 μL de dihidrocloruro de 2,2-azobis (2-metilpropionamidina) (AAPH) a cada pozo, y la placa se leyó a intervalos de 210 s durante 120 min a 485 nm para excitación y 580 nm para longitudes de onda de emisión. El área bajo la curva se obtuvo con el software SigmaPlot® versión 12.0 (^{Systat Software Inc., 2014}). Se utilizó PBS como blanco y los resultados se expresaron en μM equivalentes de trolox por mg de extracto.

Capacidad antioxidante determinada por ensayo de óxido nítrico

La actividad de barrido de ON se determinó utilizando nitroprusiato de sodio (SNP) como donante de ON. En tubos de ensayo, 1 000 μL de extracto/solvente a 0.1 mg∙mL^-1 se mezclaron con 200 μL de 113 mM de SNP y la mezcla se incubó durante 2 h. Posteriormente, se transfirieron 100 μL de cada mezcla a pozos de una microplaca transparente de 96 pozos y se mezclaron con 100 μL de reactivo de Griess modificado (Sigma-Aldrich). La placa se agitó durante 15 min a 25 °C y la absorbancia se leyó a 546 nm, reportando el porcentaje de inhibición.

Actividad antioxidante por capacidad de barrido del radical ABTS

En microplacas transparentes de 96 pozos se mezclaron 10 μL de extracto en solución salina de fosfato (pH 7.4, 0.75 M) con 190 μL de ABTS (radical 2,2'-azino-bis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]) preparado 16 h antes del ensayo. La placa se agitó y se dejó reposar durante 10 min, después la absorbancia se leyó a 750 nm. Los resultados se expresaron como mg de equivalentes de trolox por mg de extracto.

Ensayo de poder antioxidante reductor férrico (FRAP)

El radical se preparó mezclando 400 mM de solución tampón de acetato, 30 mM de 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) y 60 mM de cloruro férrico hexahidratado al 1:1:10 (v/v/v). En una microplaca transparente de 96 pozos se mezclaron 10 μL de extracto a 0.1 mg∙mL^-1 y 190 μL de mezcla de reactivos, se agitó y se dejó reposar durante 20 min en la oscuridad. La absorbancia se leyó a 593 nm. Los resultados se expresaron como mM equivalente de trolox por mg de extracto.

Experimentos de cultivo celular

Medición de especies reactivas de oxígeno inducidas por H₂O₂

Las células se sembraron en placas oscuras de 96 pozos con 9 600 células por pozo en 0.2 mL de RPMI con 10 % de SFB y, como antibióticos, sulfato de estreptomicina (0.6 mg∙mL^-1) y penicilina (1 mg∙mL^-1), incubadas durante 72 h a 37 °C y 5 % de CO₂. Las células se mantuvieron con 200 µL de extractos a 50 ng∙mL^-1 durante 4 h. Posteriormente, las células se cargaron con diclorofluoresceína-diacetato (10 mM) y se incubaron durante 15 min a 37 °C; luego se lavaron con PBS y se expusieron a H₂O₂ (100 mM) durante 1 h. Finalmente, la fluorescencia se midió a 37 °C a 485/530 nm de longitud de onda de excitación/emisión, respectivamente.

Análisis estadístico

Para reducir el número de ejecuciones experimentales, energía y materiales correspondientes, se utilizó un diseño experimental basado en el criterio D-óptimo con 10 combinaciones que comprendieron todas las variables experimentales, como se muestra en el Cuadro 1. Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza de una vía y las diferencias entre tratamientos se determinaron por comparación de medias mediante pruebas de Fisher con una significación estadística de P < 0.05, utilizando el programa Minitab versión 7 (^{Minitab Inc., 2009}). El análisis de componentes principales (ACP) se realizó con el programa XLSTAT.

Identificación fitoquímica

Las extracciones de hojas de Coffea se realizaron con ultrasonidos e infusiones (forma convencional). El contenido de fenoles totales y flavonoides en las extracciones se muestra en la Figura 1, en la cual se observa que la infusión tuvo la mayor concentración de compuestos fenólicos totales. Los flavonoides representaron aproximadamente 20 a 40 % del contenido de fenoles totales. Esta determinación está influenciada por la capacidad del reactivo Folin-Ciocalteu de interactuar con los compuestos reductores de la muestra; por ello, para una identificación más precisa se utilizó cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS).

Figura 1 Contenido de fenoles totales y flavonoides en infusión y extractos de hojas de Coffea. Infusión: 1 g de material molido en 100 mL de agua destilada a 80 °C, reposado durante 10 min. Condiciones de extracción: Relación agua/metanol (%) - Tiempo de extracción (min) - Amplitud (%). EAC: equivalentes de ácido clorogénico; EC: equivalentes de catequina. Literales distintas indican diferencias significativas (Fisher P = 0.05).  

Se identificaron ácidos fenólicos, flavonoides y xantona mangiferina (Cuadro 2). Los extractos acuosos 2, 3, 5, 8, 10 y la infusión tuvieron contenidos más bajos de compuestos flavonoides específicos (<197.0 µg∙g^-1), especialmente flavanoles como la catequina, procianidina y mangiferina en comparación con los extractos hidroalcohólicos 1, 4, 6, 7 y 9 (>274.0 µg∙g^-1); sin embargo, la mangiferina en los extractos fue el doble (>54.0 µg∙g^-1) que la encontrada en infusiones (25.8 ± 0.12 µg∙g^-1). Por el contrario, se encontraron concentraciones más elevadas de ácidos fenólicos (735.6 a 899.7 µg∙g^-1) en todos los extractos obtenidos con ultrasonido en comparación con la infusión (597.2 µg∙g^-1) (Cuadro 3). No se observaron diferencias significativas entre extractos acuosos y mezclas de agua/metanol. El grupo de ácidos hidroxicinámicos fue el predominante con ácidos quínico, 3-4/4-5 dicaffeoilquínico y clorogénico como los principales compuestos identificados tanto en la infusión como en los extractos.

Las cantidades de cafeína en las muestras de hojas de Coffea se ilustran en la Figura 2. A excepción del extracto 9 (relación agua/metanol [60/40 %] - tiempo de extracción [6 min] - amplitud [40 %]), la infusión superó el contenido de cafeína con respecto al resto de los extractos. Una taza de café contiene aproximadamente 137 mg de cafeína (^{Setiawan et al., 2015}) y, según los resultados, una taza de infusión de hojas de Coffea tiene alrededor de 1.4 mg. Se ha informado la disminución de la concentración de cafeína en los extractos obtenidos por asistencia de ultrasonido, probablemente debido a su degradación por efecto de sonicación (^{Guglielmetti, D'Ignoti, Ghirardello, Belviso, & Zeppa, 2017}). La teofilina y la teobromina fueron bajas en todas las muestras.

Figura 2 Contenido total de cafeína en la infusión y extractos de hojas de Coffea. Infusión: 1 g de material molido con 100 mL de agua destilada a 80 °C en reposo durante 10 min. Condiciones de extracción: Relación agua/metanol (%) - Tiempo de extracción (min) - Amplitud (%). Letras distintas indican diferencias significativas (Fisher P = 0.05). 

Varios compuestos fenólicos y alcaloides como la cafeína se han reportado previamente en las hojas de Coffea (^{Ratanamarno & Subkar, 2017}) y muchos de estos fitoquímicos pueden estar relacionados con las propiedades terapéuticas. En particular, el ácido clorogénico y la mangiferina muestran importantes efectos farmacológicos como antidiabético, antilipidémico (^{Ong, Hsu & Tan, 2013}), antinflamatorio (^{Hwang, Kim, Park, Lee, & Kim, 2014}), anticancerígeno (^{Ebkatan, Li, Ghorbani, Azadi, & Kubow, 2018}; ^{Yamagata, Izawa, Onodera, & Tagami, 2018}) y aumento de capacidad antioxidante (^{Shi et al., 2016}).

En este trabajo se ha señalado por primera vez la identificación de dos flavanonas en las hojas de Coffea: neohesperidina y naringenina. Su detección fue posible principalmente en los extractos realizados por sonicación y con disolventes hidroalcohólicos (extractos 1, 4, 6, 7 y 9). Dichos compuestos también se extrajeron con agua, pero con la mayor amplitud y tiempos de extracción; es decir, solo con mayor energía administrada al extracto o en combinación con metanol fue posible la obtención de estas flavanonas. La aglicona naringenina y la forma glucósida de hesperetina, neohesperidina son flavanonas importantes. Estas han mostrado varias propiedades funcionales como actividades antioxidantes, antiproliferativas, antivirales, antialérgicas, antinflamatorias, antiateroscleróticas y anticancerígenas (^{Kim et al., 2011}). La naringenina ha sido muy estudiada por su actividad antidiabética. Algunos mecanismos de esta flavanona son sus efectos moduladores sobre la secreción y la sensibilidad a la insulina; la producción hepática, los transportadores, la captación periférica y la absorción intestinal de glucosa; los lípidos sanguíneos y la biosíntesis del colesterol; así como el estrés oxidativo y la inflamación (^{Joshi, Kulkarni, & Wairkar, 2018}). La naringenina es una flavanona primaria que abunda en muchos cítricos como las naranjas (1.47 a 11.15 mg∙100 g^-1) y toronjas (14.17 a 53 mg∙100 g^-1) (^{Nogata et al., 2006}); en este estudio, la mayor concentración fue de 1.75 mg∙100 g^-1 en el extracto 9.

En cuanto a los ácidos fenólicos, se identificó un grupo de ácidos hidroxibenzoicos no reportados previamente en las hojas de café, como los ácidos vanílico, shikímico, siríngico y elágico, junto con el 2,4,6 trihidroxibenzaldehído y el ácido 2,3 dihidroxibenzoico. Entre estos, el ácido vanílico se encontró en mayor concentración y está relacionado con múltiples actividades farmacológicas como la inhibición de la actividad del veneno de serpiente, además de propiedades antioxidantes, antimicrobianas y antinflamatorias (^{Dhananjaya, Nataraju, Raghavendra Gowda, Sharat, & D’Souza, 2009}; ^{Tai, Sawano, & Ito, 2012}).

Actividad antioxidante

Los resultados de los ensayos antioxidantes se muestran en el Cuadro 4. Los ensayos ABTS y FRAP cuantifican esencialmente la capacidad del extracto para neutralizar un radical por transferencia de un solo electrón (SET); sin embargo, el ensayo ABTS también podría actuar bajo el mecanismo de una transferencia de átomos de hidrógeno (HAT). Los ensayos ORAC y ON evalúan el mecanismo de HAT. La actividad de barrido de radicales ABTS mostró correlación positiva y estadísticamente significativa con el contenido de fenoles totales (Pearson 0.754, P = 0.007) y flavonoides (Pearson 0.854, P = 0.001).

El extracto 6 (relación agua/metanol [20/80 %] - tiempo de extracción [9 min] - amplitud [30 %]) mostró los valores más altos de ABTS y FRAP, mientras que el extracto 9 (relación agua/metanol [60/40 %] - tiempo de extracción [6 min] - amplitud [40 %]), la mayor actividad en los ensayos ORAC y ON. El extracto 9 mostró mayor concentración de flavanonas, flavonoles y cafeína en comparación con el extracto 6. Se ha reportado que bajas concentraciones de cafeína pueden favorecer un efecto antioxidante al ejercer una fuerte capacidad de atrapamiento del radical •OH (^{Petrucci, Zollo, Curulli, & Marrosu, 2018}). No obstante, también se ha sugerido que la cafeína no influye en la capacidad antioxidante mediante ensayos basados en el mecanismo HAT (Petrucci et al., 2018). Por otra parte, el extracto 6 también mostró mayor concentración de epicatequina y mangiferina en comparación con el extracto 9.

Está comprobado que tanto el estrés oxidativo como el nitrosativo, debido a circunstancias tanto intrínsecas como extrínsecas, inducen a los mecanismos biológicos para perder el control sobre los radicales libres con el consiguiente desequilibrio entre las condiciones oxidantes y defensas antioxidantes celulares. Por ello, es interesante evaluar no solo el potencial antioxidante de un material vegetal, sino también su capacidad antinitrosativa. El potencial inhibidor del óxido nítrico de los extractos evaluados osciló entre 36 y 58 % y el extracto 9 fue el más eficiente para eliminarlo.

Viabilidad celular

Diferentes concentraciones de extractos e infusiones en cultivos HT-29 se evaluaron y se obtuvieron sus IC₅₀. El Cuadro 5 muestra que los valores de IC₅₀ de todas las muestras fueron inferiores de 13 µg∙mL^-1. Según estos resultados, se propuso una concentración fija de extractos e infusiones de 50 ng∙mL^-1 (donde la viabilidad celular fue de 100 %) para evaluar su efecto protector. Los fitoquímicos presentes en los extractos e infusiones en esta concentración baja fueron capaces de inhibir el estrés generado en las células por exposición a H₂O₂. En comparación con el 100 % de estrés en el control positivo con H₂O₂, todos los tratamientos fueron capaces de reducir el estrés en 5.9 a 16 %, especialmente el extracto 9 (Figura 3). Las condiciones de extracción del proceso 9 favorecieron un extracto rico en mangiferina, la cual muestra protección celular atenuando la expresión del estrés oxidativo (^{Rocha, Bonet, Tambeli, de-Faria, & Parada, 2018}).

Figura 3 Capacidad de los extractos de hojas de Coffea para inhibir el estrés oxidativo en un ensayo de células de adenocarcinoma de colon humano (HT-29). Control positivo con H₂O₂. Letras distintas indican diferencias significativas (Fisher, P = 0.05). Infusión: 1 g de material molido con 100 mL de agua destilada a 80 °C en reposo durante 10 min. Condiciones de extracción: relación agua/metanol (%) - tiempo de extracción (min) - amplitud (%). 

En la Figura 4 se muestra el ACP de las variables respuesta y de los procesos de extracción (ultrasonidos e infusión). En el cuadrante 1 se observa un grupo con la mayoría de las respuestas y todos los procesos de extracción por ultrasonido en los que se utilizó un medio hidroalcohólico (agua/metanol). En este grupo, todas las respuestas antioxidantes (ON, ORAC, ABTS y FRAP) están relacionadas con extractos hidroalcohólicos, así como con la evaluación del estrés oxidativo en las células. También se observan compuestos fenólicos con actividad terapéutica importante. La correlación entre las respuestas observadas, así como los fitoquímicos de importancia biológica, convierten estas condiciones de extracción en una buena alternativa para la obtención de compuestos fenólicos con capacidad potencial como ingredientes nutracéuticos.

En los cuadrantes inferiores se observaron los procesos de extracción con asistencia de ultrasonido, exclusivamente en el medio acuoso, y se relacionaron con la recuperación de compuestos fenólicos simples, mientras que la infusión se encontró en el cuadrante 2. Este proceso de extracción tiene una alta correlación específicamente con la recuperación de ácido quínico. Los 11 procesos evaluados mostraron la capacidad de recuperación de los compuestos fenólicos, y los obtenidos por sonicación y combinación con alcohol como solvente tuvieron, además, una actividad antioxidante importante.

Figura 4 Análisis de componentes principales que involucra las variables respuesta, así como las condiciones de extracciones por sonicación e infusión de hojas de Coffea.