Morfología y anatomía de la semilla

Las características morfológicas se evaluaron en una muestra tomada al azar compuesta por 25 semillas del lote. El peso (báscula Ohaus Scout®, precisión 0.001 g), longitud, anchura y grosor (vernier digital Truper®, precisión de 0.01 mm) se determinaron en cada semilla. La forma se describió con base en la terminología referida por ^{Niembro (1988}). La anatomía microscópica se describió a través de microfotos de la sección transversal de la cubierta seminal de semillas. Las fotografías se obtuvieron en muestras preparadas con las técnicas ambiental y ambiental complementada con tetróxido de osmio, para verlas al microscopio electrónico (FEI Quanta 450) con la técnica de barrido (MEB) (^{Sorrivas, Yañez, & Morales, 2014}).

Escarificación y resistencia a la ruptura

Las semillas se sometieron a escarificación química, mecánica y térmica. Estos tratamientos emulan agentes naturales que terminan con la latencia física (^{Baskin & Baskin, 2014}). Se buscó simular el paso de la semilla por el tracto digestivo de fauna, con escarificación química; el arrastre de semillas sobre el piso, mediante escarificación con lija; el masticado y pisoteo por fauna silvestre, mediante la prueba de resistencia a la ruptura; y el fuego con la escarificación térmica.

La escarificación química consistió en sumergir la semilla en HCl al 37 % (12 N) durante 30, 120, 150 y 180 min (tratamientos T1, T2, T3 y T4, respectivamente). La escarificación térmica se llevó a cabo introduciendo la semilla en un horno a 80, 100, 120 y 140 °C, durante 3 min (T5, T6, T7 y T8, respectivamente). La escarificación mecánica (T9) de la semilla de las dos especies de mezquite (Prosopis) se hizo con lija para madera calibre 150, grano fino (marca Truper®). Para las tres especies de huizache (Vachellia) se usó lija para lámina, calibre 60 X-86 de la marca Fandeli®. El lijado se hizo por un costado de la semilla hasta notar el desgaste de la cubierta y apreciar los cotiledones. También se tuvo un testigo no tratado (T10).

La variable resistencia a la ruptura por compresión se evaluó en muestras de 25 semillas por especie, con la máquina universal de pruebas Instron® (Norwood, Massachusetts, EUA, modelo 2285H) y el software Instron Bluehill (^{Instron, 2006}). La velocidad de desplazamiento fue de 0.60 mm∙min^-1 con una cédula de carga de 51.521 kN. La prueba era detenida cuando se detectaba un crujido ocasionado por la ruptura de la cubierta seminal, lo cual corresponde con la “caída” súbita de la curva en la gráfica generada por el programa del equipo.

Siembra y diseño experimental

Las semillas se sembraron en cajas de plástico (30 x 20 x 15 cm). La preparación de las semillas incluyó la desinfección con alcohol al 98 % hasta su evaporación, después se colocó tela fieltro de color crema como sustrato y se aplicaron 80 mL de fungicida comercial Bravo 720® (ingrediente activo Clorotalonil: Tetracloroisoftalonitrilo) al 10 %.

El experimento para cada especie se llevó a cabo mediante un diseño en bloques completos al azar con 10 tratamientos (considerando los niveles de los factores escarificación química, mecánica, térmica y testigo; la compresión se consideró un experimento aparte). En cada caja germinadora (bloque o repetición) se sembraron 20 semillas (unidad experimental) por cada uno de los 10 tratamientos. Cada especie involucró un experimento con cuatro bloques o repeticiones. En total se sembraron 20 semillas por unidad experimental x 10 tratamientos x 5 especies x 4 repeticiones (bloques) = 4 000 semillas.

Las cajas se colocaron en cámaras de ambiente controlado (marca Biotronette®) con un fotoperiodo (luz fluorescente) de 12 h día y 12 h noche, y un termoperiodo de 30 °C y 20 °C. La semilla se consideró germinada cuando la longitud de la radícula igualó la de la longitud de la semilla.

Intensidad de la latencia

Para definir la especie con la latencia más intensa y versátil ante los agentes naturales, se propuso el índice siguiente. Primero, se asignaron clases con base en los porcentajes de germinación: 1 = 0 a 67 %, 2 = 68 a 83 %, 3 = 84 a 100 %; para el caso de la resistencia, los intervalos y valor de calificación fueron: 1 = 341 a 450.4 N, 2 = 450.4 a 559.8 N, 3 = 559.8 a 669 N. Las cifras se sumaron y dividieron entre el total máximo, igual a 12 (4 factores x la calificación máxima posible [3]). A mayor valor del índice (máximo = 1), más intensa la latencia física ante los agentes.

Análisis estadístico

La germinación y la presión para la ruptura se analizaron con ANDEVA, utilizando el programa estadístico SAS® versión 9.4 (^{Statistical Analysis System Inc., 2015}). Las medias se compararon con la prueba de comparación múltiple de medias de Tukey (α = 0.05). Los datos de germinación se transformaron con la función arco seno debido a que se trata de una variable binomial. El modelo estadístico fue:

donde,

y_ijk = valor de la respuesta

µ = media general

T_i = efecto del i-ésimo tratamiento

B_j = efecto del j-ésimo bloque

ε_ijk = error experimental independiente e idénticamente distribuido con N (0, σ²).

Calidad de los lotes de semillas

De acuerdo con el Cuadro 1, los lotes de semilla de las especies evaluadas tuvieron pureza mayor de 93 %; las impurezas fueron residuos de la vaina. El número de semillas por kilogramo varió de acuerdo con el tamaño en cada especie. Las semillas de V. schaffneri fueron relativamente grandes, con 7 400 semillas∙kg^-1 (1 000 semillas pesaron 135.14 g); las más pequeñas fueron las de P. laevigata, con 24 313 semillas∙kg^-1 (1 000 semillas pesaron 41.13 g). La viabilidad de V. farnesiana fue de 96 % y en el resto de las especies alcanzó 100 %. Todas las semillas fueron ortodoxas, debido a su bajo contenido de humedad (<6 %).

Anatomía y características morfológicas de la semilla

La cubierta seminal presentó cutícula, esclerénquima y parénquima. A la cubierta seminal siguen endospermo y el embrión cotiledonar (Figuras 1 y 2). En las cinco especies, el parénquima presentó una pared con poros en forma de eslabón a lo largo del endospermo, el cual está presente en diferentes proporciones de la cavidad seminal, y el pleurograma está bien marcado con areolas largas. No obstante, existe una diferencia entre los géneros estudiados; en Vachellia, la areola presenta líneas de fracturas y en Prosopis son lisas, como en el resto de la cubierta seminal.

Figura 1 Microfotografías de la semilla de las especies estudiadas de Vachellia. a) cotiledón, b) endospermo y capas de su cubierta seminal, c) parénquima esponjoso, d) esclerénquima y e) cutícula. 

Figura 2 Microfotografías de la semilla de las especies estudiadas de Prosopis: a) cotiledones, b) endospermo y capas de su cubierta seminal, c) parénquima, d) esclerénquima y e) cutícula. 

El Cuadro 2 indica que las semillas del género Vachellia tuvieron longitud, anchura, grosor y peso mayores que las semillas de Prosopis, siendo V. pennatula la más voluminosa y P. laevigata la más pequeña. Con respecto a la forma, las semillas de Vachellia son ovaladas, mientras que las de Prosopis son ovoides y menos gruesas.

Germinación

La curva de germinación acumulada en las dos especies de mezquite fue muy similar; su germinación fue rápida y uniforme, por ello, la Figura 3 solo ilustra la germinación de P. laevigata. Por el contrario, la Figura 4 muestra que la germinación en las semillas de los huizaches (Vachellia) fue más lenta y un poco menor (también se muestra solo una especie).

Figura 3 Curvas de germinación acumulada en semillas de Prosopis laevigata. Escarificación química con HCl: T1 = 30 min, T2 = 120 min, T3 = 150 min y T4 = 180 min; escarificación térmica por 3 min: T5 = 80 °C, T6 = 100 °C, T7 = 120 °C y T8 = 140 °C; T9 = lijado; y T10 = testigo. 

Figura 4 Curvas de germinación acumulada en semillas de Vachellia schaffneri. Escarificación química con HCl: T1 = 30 min, T2 = 120 min, T3 = 150 min y T4 = 180 min en HCl; escarificación térmica por 3 min: T5 = 80 °C, T6 = 100 °C, T7 = 120 °C y T8 = 140 °C; T9 = lijado; y T10 = testigo. 

Acorde con el Cuadro 3, la escarificación mecánica (lijado) permitió 100 % de germinación final en los dos mezquites, siendo estadísticamente superior a los demás tratamientos. En P. laevigata, la inmersión en HCl por 180 min (72.5 %) resultó superior al testigo (31.3 %) y al resto de los tratamientos con escarificación química y térmica.

Para las especies de Vachellia, el tratamiento de lijado (81.2 a 96.2 % de germinación) superó en gran medida al resto de los tratamientos, los cuales no mostraron diferencias con respecto al testigo (27.5 %).

Resistencia a la ruptura

El Cuadro 4 muestra que existen diferencias en los valores de resistencia a la compresión hasta la ruptura de la cubierta seminal. Las especies V. schaffneri y V. pennatula mostraron los valores más altos (669 y 653 N, respectivamente) y V. farnesiana (482 N) solo fue superior a P. laevigata (341 N).

Intensidad de latencia

Con base en el índice propuesto, la especie con la latencia más intensa fue V. schaffneri, pues mostró mayor resistencia a la ruptura mecánica y a la escarificación química y térmica, mientras que la especie con la latencia más leve fue P. glandulosa. En general, las tres especies de Vachellia tuvieron una latencia física más intensa que las dos especies de Prosopis (Cuadro 5).

Análisis y anatomía de las semillas

Al parecer no se ha publicado la anatomía macroscópica de las semillas de V. farnesiana y V. pennatula, por lo que su comparación anatómica se hizo con las de P. juliflora (Sw.) DC. (^{Niembro, 1988}). ^{Capparelli (2008}) reconoce para P. chilensis y P. flexuosa DC.: epidermis, subepidermis, parénquima esponjoso, células empalizadas, albumen y cotiledón. Las partes observadas en la semilla, en especial la cubierta seminal, son consistentes con las de otras especies de los géneros estudiados (Capparelli, 2008; Niembro, 1988) y similares a otras leguminosas como Glycine max L. Merr. (^{Shao, Meyer, Ma, Peterson, & Bernards, 2007}) y Crotalaria juncea L. (^{Beltramini & Pascualides, 2017}). La impermeabilidad al agua de la cubierta seminal en diversas leguminosas es proporcionada por la capa en empalizada de macroesclereidas lignificadas, que están impregnadas con sustancias impermeables del tipo de fenoles y suberina (^{Lazarević et al., 2017}; ^{Robles-Díaz, Flores, & Yañez-Espinosa, 2016}; ^{Steinbrecher & Leubner-Metzger, 2018}). La semilla de las cinco especies estudiadas muestra claramente esta capa de macroesclereidas lignificadas e impermeables. Beltramini y Pascualides (2017) y Shao et al. (2007) reportan la presencia de una capa de células, la más externa del endospermo vecina a la cubierta seminal, llamada aleurona. Dicho tejido puede ser otro mecanismo que ayuda a regular la entrada de agua a la semilla una vez superada la latencia física, pues una imbibición súbita causa daños e inhibe la germinación (^{Sato, Jitsuyama, Yamada, Liu, & Abe, 2019}). En el presente trabajo no se logró distinguir con claridad la capa de aleurona en las especies estudiadas, por lo menos con la técnica utilizada, pero no se descarta su posible presencia.

Germinación

Los resultados de germinación de los mezquites coincidieron con los de ^{Miranda et al. (2011}), quienes también determinaron una germinación potencial de 100 % para P. juliflora en semillas sin endocarpo. De igual forma, ^{Sánchez-Soto et al. (2016}) hallaron 98.9 % de germinación con abrasión, utilizando lija, en Caesalpinia platyloba S. Watson. Los datos de ^{Ffolliott y Thames (1983}) muestran que la germinación en especies del género Prosopis en América Latina es de 95 %. Las semillas de V. schaffneri de la Mixteca Alta oaxaqueña tuvieron 87 % de germinación por el método de lijado (^{Martínez-Pérez, Orozco-Segovia, & Martorell, 2006}). En V. farnesiana,^{Godínez-Álvarez y Flores-Martínez (2000}) lograron 86.7 %, y ^{Maldonado-Arciniegas, Ruales, Caviedes, Ramírez, y León-Reyes (2018}) obtuvieron 45 % de germinación con el lijado de semillas de la especie sudamericana Vachellia macracantha (Humb. & Bonpl. ex Willd.) Seigler & Ebinger. Estos valores son menores que los conseguidos en la presente investigación, debido posiblemente a que la semilla utilizada en esos experimentos pudo tener menor viabilidad, no ser tan reciente o a que no se logró proporcionar el mejor ambiente para la germinación, como la temperatura.

Escarificación química

En Norteamérica, las semillas de P. velutina Wooton son parte de la dieta de especies como ratones (Peromyscus), ratas canguro (Dipodomis), ratas de la madera (Neotoma), ardillas de tierra (Sciuridae), ardillas de las rocas (Otospermophilus), conejos cola de algodón (Leporidae), zorrillos (Mephitidae), codornices (Cyrtonix montezumae Vigors), palomas (Columbidae), cuervos (Corvidae), liebres (Lepus), mapache (Procyon lotor Linnaeus), coyote (Canis latrans Say), venado cola blanca (Odocoileus virginianus Zimmermann), venado bura (Odocoileus hemionus Rafinesque), pavo silvestre (Meleagris gallopavo Linnaeus), entre otros (^{Uchytil, 1990}). La relevancia ecológica de la endozoocoria en semillas con latencia física es clara (^{Jaganathan, Yule, & Liu, 2016}). El paso de la semilla por el tracto digestivo de estas especies con jugos gástricos que incluyen ácido clorhídrico, la escarifican, por lo que la escarificación química con ácidos emula tal proceso natural.

El ramoneo o consumo de los frutos de mezquite y huizache por los animales silvestres o domesticados, como los rumiantes, son un factor importante en la dispersión de las semillas. El abomaso es el cuarto y último compartimento del estómago del rumiante, en este se concentran los jugos gástricos que contienen HCl, entre otros compuestos (^{Rodríguez-Carias & Valencia-Chin, 2007}). ^{Kneuper, Scott, y Pinchak (2018}) hallaron que la semilla de P. glandulosa Torr. var. glandulosa es consumida y dispersada de manera viable por bovinos, mientras que los ovinos y caprinos consumen el fruto y reducen la viabilidad.

Los resultados de germinación utilizando HCl (método químico) fueron bajos (28.8 a 72.5 %) para los tiempos mayores de inmersión (hasta 180 min), comparados con 99 % de germinación de semillas de P. juliflora sin endocarpo, escarificadas con H₂SO₄ por 5 a 40 minutos (^{Miranda et al., 2011}) y con 100 % de germinación de semillas de P. velutina, sometidas a H₂SO₄ por 10 min (^{Martínez-Rodríguez, Rivera-Maya, & Santamaría-César, 2000}). También en Acacia tortilis ssp. tortilis Forsk. (Hayne), de Egipto y Qatar, la germinación del control (25 %) incrementó a 67, 70 y 75 % con escarificación química (H₂SO₄ al 98 %) por 20, 25 y 30 min, respectivamente (^{El-Azazi, Sourour, Belal, & Khalifa, 2013}). En contraste, ^{D’Aubeterre, Principal, y García (2002}) obtuvieron 9 % de germinación en semillas de P. laevigata escarificadas en H₂SO₄ por 8 minutos. Es claro que el tipo de ácido (el ácido sulfúrico es más fuerte), el tiempo de inmersión y la concentración empleada pueden ser la diferencia entre un valor de germinación alto y bajo. El tiempo de inmersión adecuado maximizará la germinación, pero una inmersión muy breve, por ejemplo <120 min para P. laevigata, no afectará la cubierta seminal lo suficiente, en tanto que un tiempo muy largo de inmersión puede dañar el embrión. ^{Ghassali, Salkini, Petersen, Niane, y Louhaichi (2012}) probaron tratamientos con agua hirviendo, mecánicos y con ácido sulfúrico en 14 especies de Acacia y encontraron que el mejor tratamiento fue el químico pues produjo la germinación máxima en siete especies (Acacia farnesiana [L.] Willd., A. victoriae Benth., A. deanei ssp. deanei [R. T. Baker] M. B. Welch et al., A. deanei ssp. paucijuga [F. Muell. ex N. A. Wakef.], A. karroo Hayne, A. pruinocarpa Tindale y A. saligna [Labill.] H. L. Wendl).

Escarificación térmica

En un incendio forestal, el fuego (≥250 °C) consume todo material vegetal, pero si las semillas están un poco enterradas resultan protegidas; sin embargo, reciben temperaturas menores que pueden degradar los tegumentos o escarificar las cubiertas seminales duras de especies como las leguminosas (^{Scott, Bowman, Bond, Pyne, & Alexander, 2014}).

En este estudio, la escarificación térmica no causó mayor germinación que el testigo en las especies estudiadas, pero tampoco afectó adversamente a las semillas. Es posible que, a temperaturas mayores o con tiempos de exposición más altos, se pudiera estimular la germinación de las especies estudiadas; por ejemplo, en la leguminosa Stylosanthes montevidensis Vogel de un pastizal brasileño, su germinación se estimuló a 120 °C durante 1 min (^{Fidelis, Daibes, & Redondo-Martines, 2015}). Incluso ^{Liyanage y Ooi (2015}) hallaron en un matorral australiano que las temperaturas de hasta 100 °C estimulan la germinación de Acacia linifolia (Vent.) Willd., Viminaria juncea (Schard.) Hoffmans., Aotus ericoides (Vent.) Don, Dillwynia floribunda Sm. y Bossiaea heterophylla Vent.; sin embargo, hubo variabilidad en la intensidad de la latencia y respuesta a los tratamientos térmicos. También la semilla de la leguminosa brasileña Mimosa calodendron Mart. tuvo mayor germinación que el control cuando fue sometida a tratamientos térmicos (^{Campos-Dayrell, Goncalves-Alvym, Negreiros, Fernandes, & Oliveira-Silveira, 2015}). Prosopis juliflora tuvo mayor germinación a una temperatura constante de 35 °C durante 24 h (^{Ffolliott & Thames, 1983}) y P. velutina de Durango germinó 71 % luego de 10 min de inmersión en agua caliente (85 °C), mientras que la germinación fue 0 % en el control (Martínez et al., 2000).

En otra investigación llevada a cabo por ^{Sabiiti y Wein (1987}) se produjo una germinación de 65 % en un banco de semillas de V. siberiana (DC.) Kyal. & Boatwr. recolectadas del suelo de áreas quemadas, en comparación con 10 % de la semilla procedente de áreas no quemadas. Por otra parte, ^{Zalamea, Sarmiento, Arnold, Davis, y Dalling (2015}) señalan que, en bosques tropicales de Panamá, la variación en la temperatura del suelo fue suficiente para romper la latencia física en la semilla de cuatro especies arbóreas pioneras. En algunas especies de los géneros estudiados se encontró que el humo de incendios forestales favorece la germinación. En Australia, fue el caso para Acacia hebeclada DC., y en Sudáfrica, para Acacia mearnsii De Wild. (^{Kulkarni, Sparg, & Van Staden, 2007}); sin embargo, en el presente trabajo no se investigó el posible efecto del humo.

Resistencia a la ruptura

Durante el consumo por grandes herbívoros o ganado, la semilla puede ser sometida a fuerte presión física por mordidas, pero también puede ser pisoteada. La fuerza de fractura en la cubierta seminal es un indicador de la resistencia a la compresión que la semilla ofrece ante los factores referidos. De aquí el interés de establecer cuál es la resistencia de la cubierta seminal a la ruptura. Los valores de resistencia obtenidos en la máquina universal de pruebas sugieren que las semillas escarificadas por pisadas de bovinos, ovinos, caprinos o animales silvestres deben ser pocas, ya que el peso vivo de los animales pequeños está en un intervalo de 70 a 75 kg, aunque pueden darse las condiciones para que esto suceda (sobre las rocas, por ejemplo). No obstante, la mordida de herbívoros grandes y ganado es potente y puede afectar la cubierta de las semillas mecánicamente. El presente trabajo establece la presión requerida para romper la cubierta seminal y superar la latencia física en las cinco especies estudiadas.

La escarificación mecánica se compara con tres agentes naturales: dispersión hidrócora, por escurrimientos superficiales y pisoteo o masticado de animales. En las zonas áridas y semiáridas, generalmente, las lluvias escasas se presentan como tormentas. Esto provoca que algunas semillas sean arrastradas por los escurrimientos superficiales y que en su trayectoria vayan chocando y friccionando con otros materiales, principalmente rocas y partículas de suelo. Durante dicho arrastre es posible que las semillas sufran raspaduras ligeras o que se les formen grietas pequeñas; es decir, una escarificación natural (observaciones personales de los autores). En el medio natural puede darse la combinación de la ruptura por pisoteo o masticado y la escarificación en el aparato digestivo de animales. Las semillas pueden ser masticadas, consumidas y defecadas por los animales y, posteriormente, pisadas por otros. Estas pueden resultar beneficiadas o perjudicadas, según la intensidad de cada tratamiento y la latencia física de la especie involucrada.