Material micológico

Para seleccionar el material de estudio se hizo un recorrido en el mercado del municipio de Zacapoaxtla con el fin de localizar a las “hongueras tradicionales”, poseedoras del conocimiento micológico tradicional. Estas personas brindaron orientación y acompañamiento en la recolecta (septiembre del 2018) de alrededor de 20 especies de hongos comestibles, de las cuales se eligieron L. indigo, H. lactifluorum y R. flava con base en su abundancia y frecuencia de consumo (Figura 1).

La recolecta se hizo en la comunidad La Loma, municipio de Zacapoaxtla, Puebla, México (19° 49' 38.6” LN y -97 36' 10.7” LO a 2 140 m) (Figura 2). El tipo de vegetación es bosque templado de pino-encino. En la zona se encontraron individuos maduros de Pinus pseudostrobus Brongn.; dominancia de encinos como Quercus castanea Née, Q. laurina Bonpl., Q. crassifolia Bonpl. y Q. rugosa Née; individuos de Alnus acuminata Kunth, Buddleja sp. y Juniperus spp. cercanos a caminos y carreteras; y presencia de herbáceas de las familias Asteraceae, Lamiaceae y Fabaceae.

Las especies fúngicas se determinaron con base en la literatura siguiente: ^{Guzmán (1977)}; ^{Chacón, Guzmán, Montoya-Bello, y Bandala-Muñoz (1995)}; ^{Montoya-Bello (1987)}; ^{Mata et al. (2003)}; y ^{Montoya y Bandala (2005)}. Las descripciones se hicieron a partir de cortes de los cuerpos fructíferos para observación en microscopio estereoscópico y compuesto; posteriormente, se hicieron tinciones con hidróxido de potasio y azul de lactofenol. Los nombres científicos, derivados a partir de las observaciones, se cotejaron con el estudio etnomicológico de Contreras et al. (2018) y se verificó la vigencia del nombre científico en la base de datos de ^{Index Fungorum (2021)}. Un ejemplar de cada especie se depositó en la colección del herbario de la División de Ciencias Forestales de la Universidad Autónoma Chapingo (UACh).

Figura 1 Especies de hongos recolectadas en la comunidad La Loma, municipio de Zacapoaxtla, Puebla, México: a) Hypomyces lactifluorum, b) hongueras tradicionales, c) Ramaria flava, d) Lactarius indigo y e) zona de recolecta. 

Figura 2 Ubicación de la zona de recolecta de los hongos comestibles silvestres en el municipio de Zacapoaxtla, Puebla, México. 

De cada una de las tres especies de hongos comestibles silvestres se recolectaron aproximadamente 2 kg de cuerpos fructíferos. Los hongos cultivados A. bisporus y P. ostreatus se adquirieron en un supermercado de la Ciudad de México; estos se estudiaron para hacer una comparación directa con las especies silvestres. Los cuerpos fructíferos se limpiaron del exceso de tierra y hojarasca; la parte basal del estípite, cuando se encontraba dañada, se retiró con una navaja. Todos los ejemplares se liofilizaron y conservaron en congelación a -18 °C hasta su análisis.

Reactivos e instrumentación

Los reactivos Folin-Ciocalteu, carbonato de sodio, acetato de sodio trihidratado 2,4,6-tripiridil-s triazine (TPTZ), cloruro de hierro (III) hexahidratado, catequina, cloruro de aluminio, acetato de potasio, persulfato de potasio, 2,2-azinobis,3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico (ABTS) y los ácidos 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxilico (trolox) y gálico corresponden a productos Sigma Aldrich (St. Louis, Mo., EUA). Las absorbancias para la cuantificación de fenoles, flavonoides y capacidad antioxidante se midieron en un lector de microplacas Synergy 2 Microplate Reader, software Gen5 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, EUA).

Propiedades nutricionales y potencial nutracéutico

La composición proximal de los hongos liofilizados se determinó por triplicado de acuerdo con los métodos de la AOAC (2005). La proteína cruda (N x 6.25) se estimó por el método Kjeldahl, el extracto etéreo se obtuvo por Soxhlet y el contenido de cenizas se determinó por incineración a 550 °C.

La composición nutracéutica se evaluó in vitro; para ello, se obtuvieron extractos con metanol al 80 % siguiendo el método reportado por Hernández-Rodríguez et al. (2016). El contenido fenólico total en cada extracto se cuantificó por el método de Folin-Ciocalteu adaptado a microplacas (Hernández-Rodríguez et al., 2016). La curva de calibración se preparó a partir de una disolución stock de ácido gálico en el intervalo lineal de concentraciones de 2.5 a 29.0 µg∙mL^-1. Los resultados se expresaron como miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de muestra en base seca (mg EAG∙  gbs-1). Los flavonoides totales se cuantificaron en los extractos de acuerdo con el método de Kubola y Siriamornpun (2011). El intervalo de concentraciones de la curva de calibración de catequina fue de 0.7 a 34.5 µg∙mL⁻¹. Los resultados se expresaron como miligramos equivalentes de catequina por gramo de muestra en base seca (mg EC∙  gbs-1).

Determinación de carotenoides totales

Los carotenoides se determinaron en H. lactifluorum de acuerdo con el procedimiento de Camargo, Xavier, Alves, Flanch, y Ruffo (2015) con algunas modificaciones. La muestra liofilizada (0.2 g) y protegida de la luz se mezcló con 10 mL de una solución de hexano/acetona (6:4, v/v), se agitó en vortex por 1 min y se incubó por 10 min a 150 rpm. El sobrenadante se separó por filtración y se obtuvo el espectro ultravioleta-visible (UV-VIS) en el que se observó un máximo a 450 nm, correspondiente a los carotenoides. El intervalo de la curva de calibración del β-caroteno fue de 0.5 a 4.0 µg∙mL⁻¹. Los resultados se expresaron como miligramos de β-caroteno por gramo de muestra en base seca (mg EβC∙ gbs-1).

Capacidad antioxidante

La capacidad antioxidante de los extractos se evaluó mediante los ensayos ABTS (Re et al., 1999) y FRAP (ferric reducing ability of plasma; Benzie & Strain, 1996) adaptados a microplacas. Las curvas de calibración de trolox se prepararon en rangos de concentración de 5.0 a 60 μM y de 3.8 a 46.0 μM, para ABTS y FRAP, respectivamente. Los resultados se expresaron como micromoles equivalentes de trolox por gramo de muestra en base seca (µm ET∙ gbs-1).

Tratamiento térmico

La cinética de degradación del contenido fenólico total y la pérdida de la capacidad antioxidante de los hongos se evaluaron a 50 °C (temperatura cercana al inicio de la degradación de compuestos fenólicos; Zhou et al., 2016) y 92 °C (punto de ebullición del agua en el sitio de experimentación) por 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 min para cada temperatura. En cada especie, una porción (0.5 g) previamente liofilizada se transfirió a un tubo Pyrex® y se hidrató con 10 mL de agua destilada. Las muestras se colocaron en un baño termostático de agua precalentada a cada una de las temperaturas de estudio y se retiraron a intervalos de tiempo de 10 hasta 60 minutos. Inmediatamente, las muestras se enfriaron en un baño de agua con hielo y se liofilizaron; en cada una se determinó, por triplicado, el contenido fenólico total y la capacidad antioxidante.

Análisis de datos

Los fenoles, flavonoides y carotenoides totales, así como la capacidad antioxidante, se determinaron por triplicado y se obtuvieron las medias y la desviación estándar. El contenido de nutrientes se comparó entre las especies mediante un diseño completamente al azar y se utilizó, como estadístico de análisis, la prueba de medias de Tukey (P ≤ 0.05).

El orden de reacción de la cinética de degradación de los compuestos fenólicos se determinó graficando la concentración de fenoles totales con respecto al tiempo, probando los modelos cinéticos de primer y segundo orden:

donde,

k = constante de velocidad de degradación (mol∙g^-1∙min^-1) de los compuestos antioxidantes durante el tratamiento térmico

t = tiempo del tratamiento (s)

C_A y C_A0 = concentraciones de los compuestos fenólicos en el tiempo t y en el tiempo 0, respectivamente.

Composición nutracéutica

El Cuadro 2 muestra que R. flava tuvo mayor contenido fenólico (P < 0.05) que H. lactifluorum y L. indigo; sin embargo, la concentración más alta se encontró en A. bisporus que, en conjunto con P. ostreatus, se estudiaron para hacer una comparación directa con las especies silvestres. Las concentraciones de fenoles totales fueron menores comparadas con las determinadas por ^{Yahia et al. (2017}) para L. indigo, H. lactifluorum y R. flava (6.6, 6.33 y 7.26 mg EAG∙ gbs-1, respectivamente) en el estado de Querétaro, México; y mayores que en L. indigo (1.81 mg EAG∙gbs-1 ) y R. flava y (2.07 mg EAG∙ gbs-1) recolectados en el estado de Hidalgo (López-Vázquez et al., 2017). Las diferencias observadas podrían deberse al lugar de recolecta y al procedimiento de extracción (Pumtes, Rojsuntornkitti, Kongbangkerd, & Jittrepotch, 2016). Se ha demostrado que los compuestos fenólicos son benéficos para la salud, debido a que disminuyen el riesgo de contraer enfermedades cardiovasculares, cáncer y diabetes (Shahidi & Ambigaipalan, 2015).

Por otro lado, como se muestra en el Cuadro 2, la concentración de flavonoides totales en R. flava, respecto al contenido fenólico total, corresponde al 51.1 %, mientras que en H. lactifluorum, dichos compuestos no se detectaron, probablemente por el método de extracción utilizado. Las concentraciones de flavonoides en L. indigo y R. flava fueron inferiores a las obtenidas por ^{Yahia et al. (2017}) para las mismas especies, pero en el caso de L. indigo (con base en catequina, 0.83 mg EC∙ gbs-1) fue mayor que el valor señalado (con base en quercetina, 0.25 mg EQ∙ gbs-1) por López-Vázquez (2017).

En el espectro UV-VIS del extracto de hexano/acetona de H. lactifluorum se observó un máximo a una longitud de onda de 450 nm, característico de los carotenoides (Camargo et al., 2015). El contenido de carotenoides en este hongo fue superior al encontrado en hongos comestibles silvestres de Polonia y Portugal (Barros, Ferreira, Queirós, Ferreira, & Baptista, 2007; Robaszkiewichz, Bartosz, Lawrynowicz, & Soszynski, 2010) y en frutos como Artocarpus heterophyllus Lam (0.0018 a 0.0079 mg∙ gbs-1 considerando el contenido de humedad), pero fue menor que en la flor de Cucurbita pepo L. (10.5 mg∙gbs-1 considerando el contenido de humedad) (Aquino-Bolaños, Urrutia-Hernández, López del Castillo-Lozano, Chavéz-Servia, & Verdalet-Guzman, 2013; de Faria, De Rosso, & Mercadante, 2009). La inclusión de carotenoides en la dieta se ha correlacionado con la disminución en el riesgo de desórdenes degenerativos, incluyendo varios tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares y oftalmológicas; además, estos compuestos son precursores de vitamina A y tienen efectos antioxidantes y antinflamatorios (Rao & Rao, 2007).

Capacidad antioxidante

Los agentes antioxidantes reducen radicales libres mediante dos mecanismos: por la trasferencia de electrones o por la transferencia de átomos de hidrógeno. Los ensayos ABTS y FRAP permiten medir la reducción de radicales libres mediante el mecanismo de transferencia de electrones (^{Ozgen, Reese, Tulio, Scheerens, & Miller, 2006}); por tanto, estos dos métodos se usaron para corroborar la capacidad antioxidante en los extractos polares de los hongos bajo estudio. Los hongos mostraron diferencia significativa en la capacidad antioxidante en cada uno de los ensayos; A. bisporum y R. flava tuvieron los valores más altos, mientras que H. lactifluorum y P. ostreatus presentaron los más bajos (Cuadro 2). De acuerdo con los resultados descritos por ^{Yahia et al. (2017}), R. flava también tuvo la mayor capacidad antioxidante, seguido de L. indigo y H. lactifluorum. Debido a que los carotenoides son compuestos con propiedades antioxidantes sería recomendable probar la capacidad antioxidante en extractos no polares.

En general, las muestras con mayor capacidad antioxidante también tuvieron mayor contenido fenólico (Cuadro 2). Según ^{Cheung, Cheung, y Ooi (2003)}, las propiedades antioxidantes de los hongos se atribuyen principalmente a compuestos de bajo peso molecular como los flavonoides, ácidos fenólicos y cinámicos. En años recientes, la demanda en el consumo de componentes bioactivos ha sido creciente, por lo tanto, los hongos son una buena alternativa.

Los compuestos fenólicos en los alimentos de origen vegetal (Faller & Fialho, 2009; Kalogeropoulos, Grigorakis, Mylona, Falirea, & Andrikopoulos, 2006) y en los hongos (Jaworska et al., 2015) pueden ser afectados por el procesamiento térmico. De acuerdo con Patras, Bruton, Tiwari, y Butler (2011) es recomendable el empleo de un modelo cinético que prediga la influencia del procesamiento de los alimentos sobre parámetros críticos de calidad. El orden de reacción correspondiente a la cinética de degradación de los compuestos en los hongos se determinó graficando la concentración de fenoles totales contra el tiempo (0 a 60 min) a 50 y 92 °C, probando los modelos cinéticos de primer y segundo orden, hasta encontrar relación lineal. Los parámetros cinéticos se obtuvieron aplicando las ecuaciones Ln(C_A/C_A0) = -kt (primer orden) y (1/C_A -1/C_A0) = kt (segundo orden). De acuerdo con el Cuadro 3, los dos modelos presentaron coeficientes de determinación aceptables; no obstante, el modelo matemático de primer orden tuvo coeficientes de determinación mayores.

De forma similar, la cinética de degradación de la capacidad antioxidante de los hongos se determinó a 50 y 92 °C con intervalos de 10 a 60 minutos. Las constantes de velocidad de la pérdida de capacidad antioxidante para cada especie se muestran en el Cuadro 4. La aplicación del modelo cinético de primer orden tuvo coeficientes de correlación más altos.

La Figura 3 muestra el comportamiento lineal cuando se aplica el modelo cinético de primer orden, tanto del contenido fenólico total como de la capacidad antioxidante (ABTS y FRAP), en las especies sometidas a tratamiento térmico de 50 y 92 °C desde un tiempo 0 a 60 minutos. En las tres variables evaluadas se observa la misma tendencia, a medida que el tiempo y temperatura de cocción incrementan también la degradación de compuestos fenólicos y antioxidantes se eleva. El hongo H. lactifluorum presentó mayor degradación de fenoles totales cuando se aplicó una temperatura de 92 °C por 60 min y R. flava mostró mayor disminución de capacidad antioxidante a una temperatura de cocción de 92 °C.

Figura 3 Pérdida del contenido fenólico total y de la capacidad antioxidante (ensayos ABTS [2,2-azinobis,3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico] y FRAP [poder antioxidante férrico reductor]) en hongos comestibles silvestres a dos temperaturas durante 60 minutos de calentamiento. C_A y C_A0: concentraciones de los compuestos (fenólicos y antioxidantes) en el tiempo t y en el tiempo 0, respectivamente. 

De acuerdo con los resultados, las pérdidas de contenido fenólico total fueron 14 % para H. lactifluorum y 21 % en R. flava bajo condiciones de 50 °C por 60 min, pero a mayor temperatura (92 °C, 60 min), la reducción varió de 31 % para L. indigo a 48 % para H. lactifluorum. Estas pérdidas son inferiores a las reportadas por Jaworska et al. (2015) para A. bisporus (38 %) y P. ostreatus (65 %) cocinados en estofado. En otro trabajo realizado por ^{Öztürk, Öztürk, y Duru (2014)} se encontró que, antes de cocinar, el extracto metanólico de R. flava contenía 5.9 mg de fenoles por gramo de extracto y, después de cocinar, la concentración aumentó a 9.84 mg de fenoles por gramo de extracto; estos resultados difieren de los obtenidos en el presente trabajo. La aplicación de tratamientos térmicos en alimentos ricos en antioxidantes disminuye su contenido, debido a la naturaleza termosensible de estos compuestos. De acuerdo con ^{Blessington et al. (2010)}, las diferencias observadas de pérdida podrían estar relacionadas con la naturaleza química de los compuestos fenólicos de cada una de las especies y con la complejidad de la matriz en la que están unidos a biomoléculas como carbohidratos, grasa o proteínas.

Con respecto a la capacidad antioxidante, en el caso del ensayo FRAP, el intervalo de pérdida varió entre 26 % para L. indigo y 74 % para R. flava, mientras que para ABTS, la pérdida fue de 29 % para L. indigo y 34 % para R. flava. En general, la pérdida de capacidad antioxidante fue inferior que la reportada por Jaworska et al. (2015) para A. bisporus (50.34 % [ABTS] y 53.55 % [FRAP]) y P. ostreatus (53.39 % [ABTS] y 48.52 % [FRAP]).

El estudio cinético de la disminución del contenido fenólico total y de la capacidad antioxidante de los hongos evaluados es de gran utilidad para la optimización de temperaturas y tiempos de cocción; por ejemplo, de acuerdo con la información proporcionada por personas del municipio de Zacapoaxtla, Puebla, la preparación de los hongos recolectados consiste en un tratamiento térmico a ebullición por un tiempo de 20 minutos. Con esta información, se puede estimar la pérdida del contenido fenólico total y la capacidad antioxidante de cada una de las especies (Cuadros 3 y 4); además, se podría recomendar disminuir la temperatura de cocción para la preservación de los compuestos bioactivos.