Preparación de la suspensión de alginato con sulfato ferroso y reticulante

Se prepararon cinco suspensiones usando 1.5 g de SA en 60 mL de agua. Las suspensiones se agitaron en una placa magnéticamente (Modelo SP46925, Barnstead Thermolyne, USA) por 30 minutos a 25 °C, posteriormente se aforó a 90 mL. Posteriormente, el FS fue solubilizado en 10 mL de agua. La solución se mezcló con 90 mL de la suspensión de SA para tener las siguientes concentraciones: 16, 25, 33, 50 y 75 % de material de pared. Las suspensiones se agitaron (Modelo SP46, Barnstead Thermolyne, USA) por 5 min. Se preparó la solución reticulante con una concentración de 1N de CaCl₂.

Viscosidad y conductancia de suspensiones de SA/FS

Se determinó la viscosidad de las suspensiones de SA/ FS (16, 25, 33, 50 y 75 % con respecto al material de pared), usando un reómetro (modelo MCR-101, Anton Parr, Austria) a 25 °C, adaptado con una geometría ST24-2D/2v/2v-30. Además, se midió la conductancia, mediante un conductímetro (modelo PCE-CM 41, PCE Ibérica, España) a 25 °C.

Equipo de coacervación electrostática

El equipo de coacervación electrostática fue diseñado y construido en el CICATA-IPN Unidad Querétaro (Figura 1). El equipo consta de una bomba de jeringa motorizada construida en laboratorio donde se coloca la suspensión de SA/FS, una aguja de 30 G conectada a la bomba de jeringa por medio de manguera de silicón, una fuente de alto voltaje variable de 1 a 30 KV para generar las fuerzas de atracción electrostática (modelo 30A24-P30, Ultravolt, USA), fuente de bajo voltaje variable de 1 a 12 VDC (LM317) para control de la bomba de jeringa, un agitador magnético (modelo PC-320, CORNING, USA) con un vaso de precipitado de 250 mL para la solución de CaCl₂. Se conectó el positivo del alto voltaje en la aguja de 30G y el negativo del alto voltaje se colocó debajo del vaso de precipitado, como se muestra en la Figura 1.

1) Panel de control: motores y alto voltaje. 2) Bomba de jeringa. 3) Jeringa de 1mL con aguja de 30 G. 4) Electrodo común. 5) Electrodo de alto voltaje posicionado en la aguja de la jeringa. 6) Suspensión reticulante de CaCl₂.

Figura 1 Equipo de coacervación electrostática para obtener microcápsulas de SA/FS. 

Obtención de microcápsulas mediante el proceso de coacervación electroestática

Las suspensiones de SA/FS se colocaron en jeringa de 10 mL con una aguja de 30 G, la cual se acoplo en el equipo de coacervación electroestática (Figura 1). syringe with a 30 G needle, which was attached to the electrostatic coacervation equipment (Figure 1). Las variables evaluadas fueron: alto voltaje, velocidad del flujo de avance y de la distancia entre electrodos sobre la obtención de microcápsulas. La suspensión de SA/FS se depositó en una jeringa, y con la ayuda de una bomba de jeringa se formaron gotas que al caer al CaCl₂ formaron cápsulas por coacervación con el alginato. La velocidad de flujo vario entre 0.01 mL/ min hasta 0.02 mL/min. Se conectó el alto voltaje en la aguja polarizando la solución de SA/FS y por fuerzas electrostáticas de atracción se formaron gotas de menor que cayeron en la solución reticulante (CaCl₂) en agitación continua a una distancia de 10 cm (Figura 1). Las microcápsulas formadas por coacervación electrostática se filtraron y enjuagaron con agua para eliminar el exceso de CaCl₂. Las microcápsulas de cada tratamiento se almacenaron en frascos de vidrio de 50 mL en refrigeración y protegidas de la luz, hasta su análisis.

Caracterización de las microcápsulas de SA/FS

Tamaño y morfología de la microcápsula

Para el estudio de la morfología de la microcápsula, se utilizó un microscopio electrónico de barrido ambiental Phenom Pro (Desktop SEM, Eindhoven, Países Bajos) que se acondicionó para trabajar en módulo de bajo vacío, con el haz de electrones ajustado a 5 kV. Las imágenes se tomaron a 150X y 500X. Para determinar el tamaño se empleó un microscopio óptico modelo digital con sensor 2 MP en un rango de 300x - 1000X en magnificación. Se evaluaron 60 microcápsulas por tratamiento, mostrando el tamaño promedio ± desviación estándar. Esta prueba se realizó por triplicado.

Estabilidad térmica de la microcápsula

La estabilidad térmica se analizó en un calorímetro diferencial de barrido Marca Mettler Toledo (modelo DSC1, Switzerland), se pesaron 3 g de muestra en un crisol de aluminio de 40 µL sellado mediante presión mecánica (modelo ME-00119410). La muestra se dejó reposar por 15 minutos. Posteriormente se realizó un isoterma de 30 a 240 °C a una razón de calentamiento de 10 °C/min. Se empleó un crisol vacío como referencia. Se reporta la temperatura de estabilidad y la entalpia de degradación. Las mediciones se realizaron por duplicado. Se reporta la medición ± desviación estándar.

Perfil de liberación de la microcápsula

El perfil de liberación se evaluó colocando 12 gramos de microcápsula en una solución buffer a pH 2, 4 y 7.4 a una temperatura de 37 °C durante 4 horas. Se analizó la cantidad de hierro liberado, cada 10 minutos los primeros 60 minutos, posteriormente se midieron cada 30 min. La cantidad de hierro fue analizada por titulación por volumetría (^{Cendejas & Ortega, 2017}). Se reporta el porcentaje de liberación a un determinado tiempo. La prueba se realizó por triplicado.

Caracterización de la suspensión de SA/FS

La Figura 2, muestra los valores de viscosidad y conductividad eléctrica de las suspensiones de SA adicionadas con FS (SA/FS). La viscosidad de las suspensiones estuvo entre 224 ± 4.37 mPa•s (relación 16 % de FS) hasta 1227 ± 11.01 mPa•s (relación 75 % de FS). Estos resultados están asociados con el peso molecular del SA que influye directamente en la viscosidad (^{Avendaño-Romero, 2013}).

Figura 2 Viscosidad. (a) y conductividad eléctrica (b) de las suspensiones de alginato de sodio y sulfato ferroso. 

La interacción de SA con FS mostró un efecto significativo sobre la viscosidad de las suspensiones (p < 0.05). En la Figura 2 (a), se puede observar que conforme aumenta la concentración de FS se incrementa la viscosidad. ^{Soto-Martínez (2018)}, reportaron que la viscosidad de las suspensiones usadas es un factor determinante en la formación de las microcápsulas cuando se emplea la técnica de electrostática. Los autores reportan que a viscosidad menores de 800 cP es posible generar gotas, lo que favorece la formación de las microcápsulas. La concentración de 16 % de FS fue la solución de menor viscosidad y la que permitió la mejor formación de gotas y, en consecuencia, la de mayor eficiencia de encapsulamiento.

Otro factor determinante para la técnica de electrostática es la conductividad eléctrica. En la Figura 2(b), se muestra la conductividad en función de la concentración de FS. Los valores obtenidos de conductividad estuvieron entre 0.299 mS/m (relación de 16 % de FS) hasta 0.581 mS/m (relación de 75 % de FS). Los polisacáridos no son buenos conductores de electricidad aunado a que la concentración de alginato fue constante por lo que el cambio de conductividad es atribuido al FS. ^{Colín-Orozco et al. (2013)} reportan que la conductividad está influenciada por el tipo de solvente, el material disuelto y la disponibilidad de iones libres, estos últimos asociados con el contenido de FS. Lo anterior coincide con los resultados en donde el aumento en la conductividad eléctrica es proporcional al incremento en la cantidad de hierro añadida, ya que el FS es una sal que se disocia en agua. ^{Pérez-Calderón et al. (2018)}, reportó que el agua tiene 0.04 mS/m hasta 0.2 mS/m, por otra parte, ^{Quintero et al. (2018)} reportaron valores de soluciones a base de quitosano al 2 % con conductividad eléctrica de 0.214x10^-3 mS/m. La suspensión del 16 % de FS presento una conductividad de 0.299 mS/m, estos valores de conductividad son mayores que los reportadas debido a la adición del FS. Lo anterior se debe a que las sales se disocian en soluciones acuosas ocasionando mayor conductividad.

Contenido de hierro y porcentaje en eficiencia de encapsulamiento

En la Tabla 1, se muestra el efecto de las variables del proceso de coacervación electroestática en la formación de las microcápsulas. El alto voltaje y el flujo de alimentación no tuvieron efecto significativo en la formación de las microcápsulas mientras que la relación SA/FS influyó significativamente.

Los resultados obtenidos muestran que cuando la concentración de FS es menor (16 %), la eficiencia de encapsulamiento (EE) es mayor. La EE, estuvo entre 59.49 ±0.37%(50%deFS)y66.94±1.11%(16%deFS)(Tabla 1). Estudios previos sobre el efecto de la concentración de FS sobre la EE son variados. ^{Valenzuela et al. (2014)} reportó valores de 59.5 % a 75.7 % EE usando hierro hémico obtenido a partir de eritrocitos.

Por otro lado, en la Tabla 1 muestra que al aumentar la concentración de FS disminuyó la EE y aumento el contenido de hierro, es decir, la capacidad de retención disminuyó lo que indican que la sal se encuentra al interior de la micropartícula de alginato así como también podría estar adherida a su superficie. Otra razón por la que la EE, disminuye a medida que la relación de AS/FS se incrementa, puede estar asociada con una desproporción del material de pared, lo que genera incrustaciones de material que hacen que disminuya la EE (^{Cuatzo, 2010}), e incrementando la viscosidad, lo cual interfiere con la formación de la gota. En la literatura se reporta que las sales de hierro III tienen hasta un 80 % de EE, sin embargo, son menos biodisponibles para el organismo (^{Durán et al., 2017}).

Tamaño y morfología de la microcápsula

El tamaño de la microcápsulas obtenidas se muestra en la Tabla 1. Las condiciones del potencial electroestático, la relación de SA/FS tuvieron efecto significativo en este parámetro. Lo anterior puede estar relacionado debido a que, a mayor contenido de hierro, aumenta la viscosidad por el alto contenido de sales de hierro dificultando la formación de las microcápsulas.

La morfología de las microcápsulas de hierro obtenidas por coacervación electroestática se presenta en la Figura 3. Las microcápsulas presentan una forma esférica y sus tamaños fluctuaron entre los 350 a 850 µm, valores más bajos que lo reportado en la literatura para cápsulas obtenidas por coacervación (^{Valenzuela et al., 2014}). Se observaron microcápsulas que no presentan forma esférica, pero con tamaños similares. En las muestra 11-14, 18 y 23, se presentó un efecto propio del electro spinning el cual es la incorporación de monofilamentos adheridos a la micro capsula. (Figura 3). Otros tratamientos mostraron una apariencia rugosa en la superficie de la microcápsula (Figura 3, muestra 1, 8, 9, 22, 24 y 27), esto se puede deber a la combinación del flujo de alimentación y el potencial aplicado. Mientras que en los tratamientos 10, 16, 25 y 26 (Figura 3) se presentaron fisuras. ^{Menger et al. (1998)} indican que la unión electroestática de los iones puede formar agregados de positivo a negativo en la formación de coacervado, manifestándose en deformación, lo cual se puede acentuar por el potencial aplicado.

Figura 3 Micrografías de las microcápsulas obtenidas por coacervación electrostática. 

Los tratamientos 19, 20 y 21 (Figura 3) presentaron una apariencia lisa en la superficie, posiblemente debido a la diferencia de potencial eléctrico. Los tratamientos 2, 3, 4, 5 y 6 (Figura 3), que contienen un 16 % de FS fueron esféricos y con apariencia uniforme.

^{Valenzuela et al. (2014)}, reportaron cápsulas de 830 µm a 1.57 mm, usando como fuente de hierro Eritrocitos bovinos deshidratados (EBDA) usando coacervación clásica. ^{Durán et al. (2017)} reportan que la encapsulación de hierro usando secado por aspersión genera tamaños de partícula entre 200 a 600 µm, menores a los encontrados en el presente trabajo. Sin embargo, la técnica usada por los autores puede oxidar el hierro lo que afectaría su biodisponibilidad en el organismo.

Las condiciones de procesamiento de 16 % de FS con un voltaje de 8 KW y un flujo de 0.012 mL/min fueron las que permitieron obtener la mayor eficiencia de encapsulamiento (66.94 ± 1.11) además, con apariencia esférica, uniforme con un tamaño de 632.30 ± 29.14 µ. Por lo tanto, este tratamiento fue seleccionado para pruebas de estabilidad térmica y determinar el perfil de liberación del compuesto encapsulado.

Estabilidad térmica de la microcápsula

Para comparar la estabilidad térmica que ofrece la microcápsula al hierro se uso el FS libre, la microcápsula con hierro y sin hierro ambas obtenida con flujo de alimentación de 0.12 mL/min y un voltaje aplicado de 8 kw a 10 (Figura 4). El FS mostró dos endotermas, una entre los 66 °C y 80 °C, y la otra a 117 °C-131 °C (Figura 4), el primero corresponde a la inestabilidad (72 °C), lo que afecta su funcionalidad.

Figura 4 Estabilidad térmica de sulfato ferroso (FS), microcápsulas de alginato de sodio (SA) y microcápsulas de SA/FS. 

Las microcápsulas de SA/FS obtenidas por coacervación electrostática presentaron un endoterma entre los 130 °C y 141 °C. Estos resultados demuestran que el material de pared (Alginato) ofrece una protección térmica al material encapsulado (FS). ^{Rodríguez-Llimos et al. (2003)} reportaron que el SA como material de pared brinda estabilidad térmica a los materiales encapsulados, al encapsular paracetamol.

Perfil de liberación de Fe de microcápsulas de SA/FS

Se evalúo el mecanismo de liberación controlada del FS a pH 2.0, 4 y 7.2 (Figura 5). Se observó una liberación más lenta de FS de los coacervados a pH 2 en comparación con los coacervados sometidos a pH 4 y 7 (p ≤ 0.05) (Figura 5). ^{Barros et al. (2016)} reportaron que esta misma combinación, haciendo pasar las microcápsulas de un medio ácido a uno básico, mostró una mejora en la liberación del compuesto.

Figura 5 Perfil de liberación de hierro de microcápsula de SA/FS a diferentes pH. 

Las microcápsulas que se sometieron a pH 7.4 presentó el efecto estallido (Gran porcentaje de material liberado en corto tiempo) en la segunda hora, seguido de una liberación gradual en el resto del tiempo (p ≤ 0.05) (Figura 5). La liberación a pH 4 y 7 no presentaron diferencias significativas hasta los 60 min de exposición al pH. Sin embargo, a los 240 min se tuvo un 82.39 ± 0.72 % a pH de 7.4, seguido de pH 4 con un 64.37 ± 0.28 % y a pH 2 la liberación fue de 21.52 ± 1.68 %

^{Sankalia et al. (2005)}, describieron tiempos muy cortos de liberación, para cápsulas de SA al encapsular papaína. Los autores liberaron el 100 % de su contenido en 60 minutos de incubación in vitro en solución intestinal simulada a pH 6.8; argumentando este hecho como consecuencia de un incremento en la afinidad entre el ion Ca²⁺ y el tampón fosfato de Na⁺, debilitando la reticulación del polímero, generando la desintegración total de la matriz de SA

Por otra parte, ^{Durán et al. (2017)} reportó un tiempo de liberación de tres horas de los componentes sensibles, como minerales y vitaminas, encapsulados con SA en medios a pH superior a 6.5, lo que corresponde con los resultados encontrados. Con base en los resultados encontrados sería recomendable la incorporación de las microcápsulas de hierro obtenidas por coacervación electroestática, en alimentos con pH ácidos para asegurar su integridad y conservación del Fe por mayor tiempo. Por otro lado, los resultados encontrados son alentadores ya que el pH del intestino delgado, lugar en donde debe liberarse el hierro para ser absorbido, es aproximadamente 7.