Identificación y actividad antagónica in vitro de aislados de bacterias contra hongos de importancia agrícola

Dios Avila, N. De; Ríos Velasco, C.; Luna Esquivel, G.; Cambero Campos, O. J.; Cambero Ayón, C. B.; Estrada-Virgen, M. O.; Dios Avila, N. De; Ríos Velasco, C.; Luna Esquivel, G.; Cambero Campos, O. J.; Cambero Ayón, C. B.; Estrada-Virgen, M. O.

doi:10.15741/revbio.07.e803

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Revista bio ciencias

On-line version ISSN 2007-3380

Revista bio ciencias vol.7 Tepic 2020 Epub Nov 18, 2020

https://doi.org/10.15741/revbio.07.e803

Artículos Originales

Identificación y actividad antagónica in vitro de aislados de bacterias contra hongos de importancia agrícola

N. De Dios Avila¹

C. Ríos Velasco²

G. Luna Esquivel³

O. J. Cambero Campos³

C. B. Cambero Ayón¹

M. O. Estrada-Virgen³^*

^¹ Universidad Autónoma de Nayarit, Unidad Académica de Agricultura, Posgrado en Ciencias Biológico Agropecuarias; Carretera Tepic-Compostela Km. 9. Xalisco, Nayarit; México.

^² Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Unidad Cuauhtémoc, Av. Río Concho s/n Parque Industrial, Ciudad Cuauhtémoc, Chihuahua; México.

^³ Universidad Autónoma de Nayarit, Unidad Académica de Agricultura; Carretera Tepic-Compostela Km. 9. C.P. 63155. Xalisco, Nayarit; México.

Resumen

Debido al uso desmedido de moléculas químicas en el control de enfermedades que provocan desequilibrios ecológicos, efectos en la salud humana y daños ambientales, la implementación de estrategias de control biológico para el manejo de problemas fitosanitarios es una opción sustentable. Para generar alternativas que contribuyan a la gestión sostenible de los cultivos en Nayarit, México, se aislaron e identificaron bacterias antagónicas de suelo de la rizosfera de agroecosistemas de aguacate Hass (recolectadas de enero a diciembre de 2014). Se obtuvieron 10 aislados bacterianos: cuatro pertenecientes a B. subtilis, cuatro a B. amyloliquefaciens, una Bacillussp. y una perteneciente a Burkholderia cepacia. Se estimó el porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PIRG) de estos aislados, al confrontarse in vitro contra los hongos Phytophthora cinnamomi, Fusarium oxysporum y Collectotrichum sp. principales hongos de importancia económica en México. El PIRG de las cepas bacterianas sobre P. cinnamomi fluctuó de 42.25 a 70.24 %, de 33.2 a 56.33 % para F. oxysporum y de 35 a 64.43 % para Collectotrichum sp. Los resultados mostraron el potencial de las bacterias evaluadas sobre P. cinnamomi, F. oxysporum y Collectotrichum sp.

Palabras clave: Bacillus; inhibición; antagonismo; hongos fitopatógenos; control biológico

Abstract

Due to the excessive use of chemical molecules in the control of diseases that cause ecological imbalances, effects on human health and environment damage, the implementation of biological control strategies for the management of phytosanitary problems is a sustainable option. In order to generate alternatives that contribute to the sustainable management of crops in Nayarit, Mexico, antagonistic bacteria collected from the rhizosphere of the Hass avocado agroecosystem (January to December 2014) were isolated. We obtained 10 bacterial isolates, four belonging to B. subtilis, four to B. amyloliquefaciens, one to Bacillus sp. and one identified as Burkholderia cepacia. The percentage of inhibition of radial growth (PIRG) of these isolates was estimated when confronted in vitro against Phytophthora cinnamomi, Fusarium oxysporum and Colletotrichum sp. which are of economic importance in Mexico. The PIRG of the bacterial isolates on P. cinnamomi ranged from 42.25 to 70.24 %, 33.2 to 56.33 % for F. oxysporum and 35 to 64.43 % for Colletotrichum sp. The results showed the potential of the bacteria evaluated on P. cinnamomi, F. oxysporum, and Colletotrichum sp.

Key words: Bacillus; inhibition; antagonism; phytopathogenic fungi; biocontrol

Introducción

La mayoría de las enfermedades en los cultivos del mundo son causadas principalmente por hongos, bacterias, virus y nematodos, éstos son responsables de cuantiosas pérdidas económicas, debido a la disminución de la calidad del producto o la pérdida total del cultivo cuando la severidad es alta. Sin embargo, los hongos, son con mayor frecuencia los causantes del daño a los cultivos (^{Rios et al., 2016}).

El manejo de enfermedades en los cultivos, depende básicamente de la aplicación de fungicidas químicos (^{APEAM, 2019}), algunos de estos conocidos por sus impactos negativos al ambiente e incluso a la salud de trabajadores agrícolas y consumidores; así como en el desarrollo de hongos patógenos resistentes a los fungicidas sintéticos usados en respuesta a la fuerte presión de selección, además de la pérdida de la biodiversidad en los agroecosistemas. Ante la presión social por obtener alimentos inocuos, se ha intensificado la búsqueda de alternativas para el manejo de enfermedades en cultivos agrícolas (^{Fisher et al., 2012}; ^{Gerbore et al., 2014}), entre ellas destacan las culturales y genéticas, y recientemente, el uso de agentes de control biológico con énfasis en microorganismos antagonistas nativos como cepas bacterianas (^{Zeilinger & Omann, 2007}; ^{Andrade et al., 2015}), esto como alternativas sustentables en el manejo de enfermedades (^{Ait-Lahsen et al., 2001}). Dentro de estas, las bacterias antagónicas como Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter, Arthrobacter, Azospirillum, Serratia y Bacillus (^{Suárez & Rangel, 2013}; ^{Zavaleta et al., 2015}), son una alternativa prometedora por su capacidad antagónica contra una gran variedad de fitopatógenos debido a la producción de diversos compuestos antimicrobianos y por sus múltiples efectos positivos sobre las plantas como promotoras del crecimiento vegetal (^{Kloepper et al., 2004}; ^{Carreras, 2011}; ^{Pliego et al., 2011}).

Las especies del género Bacillus son las más ampliamente distribuidas y estudiadas debido a su capacidad antagónica contra una gran variedad de fitopatógenos (^{Pozo et al., 2007}; ^{Leelasuphakul et al., 2008}). Se han aislado de diferentes hábitats, generalmente asociadas a la rizosfera o a tejidos de plantas, donde destaca B. megaterium, B. licheniformis, B. circulans y B. subtilis; esta última, como la más utilizada como antagonista de fitopatógenos (^{Cazorla et al., 2007}; ^{Tendulkar et al., 2007}; ^{Ali et al., 2009}; ^{Mehta et al., 2010}; ^{Rios et al., 2014}). A pesar de la necesidad urgente de nuevas alternativas, en México, existen pocos productos comerciales disponibles para el control biológico de fitopatógenos, de los cuales se desconoce en su mayoría si los microorganismos antagonistas son nativos o exóticos (^{Zavaleta et al., 2015}). Por lo tanto, el objetivo del estudio fue identificar y evaluar la actividad antifúngica in vitro de aislados bacterianos contra hongos de importancia económica para México.

Material y Métodos

Ubicación del sitio experimental.

Las bacterias antagónicas, se aislaron de muestras de suelo (500-600 g), asociado a la rizosfera de árboles de aguacate Hass (10-15 cm profundidad). Los muestreos se realizaron de enero a diciembre del 2014 (^{Rios et al., 2014}), en 20 huertos comerciales de los municipios de Tepic y Xalisco, Nayarit, México (Tabla 1). Las muestras se trasladaron en bolsas de polietileno (Ecobolsas® 20 × 30 cm) al Laboratorio de Parasitología Agrícola del Centro Multidisciplinario de Investigación Científica (CEMIC) de la Universidad Autónoma de Nayarit (UAN) donde fueron almacenadas a 4 °C, hasta su procesamiento.

Tabla 1 Huertos de aguacate muestreados, ubicación geográfica de los municipios de Nayarit, México.

Municipalities
Xalisco			Tepic
Locality	Geographic location	Altitude (mamsl)	Locality	Geographic location	Altitude (mamsl)
Emiliano Zapata	21°22'50" N 104°56'01" O	1,191	Camichin III	21°29'57" N 104°46'39" O	1,022
Curva	21°22'11" N 104°53'38" O	1,033	Camichin II	21°29'31" N 104°47'22" O	1,006
Xalisco	21°26'00" N 104°54'11" O	1,002	Libertad	21°31'44" N 105°01'29" O	1,008
Tacote	21°24'46" N 104°55'35" O	1,129	Yerba	21°31'27" N 105°02'45" O	850
Cuarenteño	21°27'49" N 105°01'38" O	1,118	Guayabitos	21°31'11" N 104°59'51" O	1,120
Carbonera	21°27'40" N 105°00'28" O	1,423	Venustiano Carranza	21°31'00" N 104°58'58" O	1,099
Xalisco U.A.A.	21°25'32" N 104°53'31" O	977	Ahuacate	21°31" 03" N 104°56'26" O	978
Tezcalate	21°31'44" N 105°01'29" O	1,030	Fortuna	21°32'47" N 104°56'33" O	862
Comunidad Indígena	21°23'35" N 104°53'46" O	1,027	Tintilagua	21°29'02" N 104°46'38" O	1,148
Pantanal	21°25'54" N 104°52'16" O	952	Noria	21°30' 33" N 104°58'20" O	1,254

* mamsl: metros sobre el nivel del mar.

Aislamiento e identificación de bacterias.

Para el aislamiento e identificación de bacterias, se homogeneizaron las muestras de suelo de cada huerto y se tomó una sub-muestra de 10 g, se colocó en 90 mL de agua destilada estéril, se mantuvo en agitación constante por 30 min. Subsecuentemente, se tomó una alícuota de 1 mL y se colocó en un tubo de ensayo con 9 mL de agua destilada estéril. Se realizaron diluciones consecutivas, hasta obtener las diluciones 10^-3, 10^-4 y 10^-5, de las cuales se tomaron 80 µL y se depositaron por duplicado en cajas de Petri de 90 mm de diámetro que contenían medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) y se homogenizaron mediante la técnica de difusión (^{Guigón & González, 2004}). Se incubaron a 28 °C, hasta observar crecimiento bacteriano. Las colonias bacterianas que mostraron inhibición contra hongos u otras bacterias que crecieron en las cajas de Petri se aislaron y crecieron en PDA a las 48 h a 28 °C. La identificación bacteriana se llevó a cabo mediante el análisis de la secuencia de la región 16S rDNA. Para lo cual, el DNA genómico (DNAg) de las bacterias fue extraído con el kit comercial ZR Fungal/bacterial DNA Miniprep™ (Zymo Research, Irving CA, USA) con base en las instrucciones del fabricante. La calidad y cantidad de DNA fue determinada mediante espectrofotometría a D.O. 260 nm. La integridad del DNA se evaluó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 %. La región ribosomal 16S de cada uno de los aislados bacterianos se amplificó mediante la técnica de PCR, utilizando los oligonucleótidos FD1 (5´-TCGTC-GACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) yRD1 (5´-CC-CGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3´). Las condiciones de amplificación por PCR se llevaron a cabo a 94 °C por 2 min (1 ciclo), 94 °C por 30 s, 55 °C por 30 s, y 72 °C por 1.5 min (35 ciclos), con una extensión final a 72 °C por 5 min. Los productos de PCR amplificados fueron purificados con el Kit Gen Elute PCR Clean-up kit (Sigma, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuenciación fue hecha por el Instituto de Biotecnología UNAM (IBT-UNAM, Morelos, México). Las secuencias de los aislados bacterianos fueron comparadas con las bases de datos del Ribosomal Database Project (RDP) y NCBI GenBank, usando el algoritmo de BLAST para verificar el porcentaje de identidad correspondiente a la especie.

Ensayos in vitro de la actividad antifúngica.

La capacidad antagónica de las 10 cepas bacterianas aisladas de rizosfera de aguacate contra Phytophthora cinnamomi, Fusarium oxysporum y Collectotrichum sp., hongos obtenidos del cepario de microorganismos del CEMIC, se evaluaron mediante confrontaciones in vitro por medios difusibles con la prueba de cuatro cuadrantes. Los aislados de B. methylotrophicus (Bm-10) y B. amyloliquefaciens (Ba-01) incluidas en estos ensayos fueron proporcionadas por el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. Dichas cepas han sido reportadas previamente con potencial para el control de hongos fitopatógenos (^{Rios et al., 2014}).

Con respecto a las confrontaciones de bacterias contra hongos, se realizaron de acuerdo con la metodología descrita por ^{Rios et al. (2014)} con modificaciones. Se colocaron explantes de 5 mm de diámetro de hongo (conidios sin cuantificar) de ocho días de crecimiento, en el centro de la caja de Petri conteniendo PDA, la bacteria antagónica fue inoculada el mismo día, en los cuatro puntos cardinales de la caja de Petri con explantes de PDA del mismo diámetro de los hongos con crecimiento bacteriano de 72 h de edad. Los testigos consistieron en explantes de los hongos de 5 mm de diámetro crecidos en PDA en ausencia de los aislados bacterianos.

Las cajas se incubaron a 28 °C en una cámara bioclimática (Novatech Ei45) y se realizaron mediciones sistemáticas cada 24 h por 10 d, del crecimiento radial de las colonias de los hongos y bacterias antagonistas en confrontación y de los testigos. La capacidad antifúngica de los aislados bacterianos se determinó con base en el porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PIRG) de acuerdo a la formula PIRG = (R1 - R2) / R1 × 100, donde R1 fue el radio del hongo testigo y R2 fue el radio del hongo en la confrontación con los antagonistas (^{Ezziyyani et al., 2004}).

Para el análisis estadístico, se utilizó un diseño completamente al azar, el experimento consistió en 12 tratamientos (aislados de bacterias antagonistas), confrontados contra tres hongos putativamente fitopatógenos, además de un testigo para cada hongo, donde cada repetición constó de tres cajas de Petri (unidades experimentales). Todas las evaluaciones se realizaron por triplicado. Los datos del PIRG y halo de inhibición se analizaron mediante el paquete estadístico Statistical Analysis System versión 9.0 (^{SAS, 2002}), para el análisis de varianza (ANOVA) y las medias fueron separadas con la prueba de Tukey (p=0.05).

Resultados y Discusión

Se obtuvieron 10 aislados bacterianos, la mayoría correspondió al género Bacillus de acuerdo con sus caracteres morfológicos. Mediante la comparación de las secuencias obtenidas de estos aislados bacterianos con las registradas en el NCBI GenBank y RDP, se corroboró su identidad morfológica previa (Tabla 2). El municipio de Tepic presentó la mayor frecuencia de aislamientos de bacterias antagónicas, una cepa perteneciente a Burkholderia cepacia, una a Bacillus sp., tres a B. amyloliquefaciens y tres a B. subtilis, mientras que en el municipio de Xalisco se obtuvieron dos aislados, una de B. amyloliquefaciens y otra de B. subtilis.

Tabla 2 Bacterias antagonistas identificadas molecularmente aisladas de rizosfera de huertos comerciales de aguacate de los municipios de Tepic y Xalisco, Nayarit, México.

Origen/Locality	Key of the isolated	Molecular identification
Ahuacate	Bc-02	Burkholderia cepacia
Camichin II	Ba-12	Bacillus amyloliquefaciens
Camichin III	Bsp-03	Bacillus sp.
Carbonera	Ba-04	Bacillus amyloliquefaciens
Comunidad Indígena	Bs-06	Bacillus subtilis
Fortuna	Bs-11	Bacillus subtilis
Guayabitos	Bs-09	Bacillus subtilis
Noria	Bs-07	Bacillus subtilis
Noria	Ba-05	Bacillus amyloliquefaciens
Yerba	Ba-08	Bacillus amyloliquefaciens

Actividad antagónica de aislados bacterianos contra fitopatógenos.

De acuerdo con las confrontaciones in vitro, se determinó que los 10 aislados bacterianos obtenidos, mostraron actividad antagónica contra Phytophthora cinnamomi, Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp. (Figura 1). Los aislados Bc-02 y Ba-05, identificados como B. cepacia y B. amyloliquefaciens, respectivamente mostraron la mayor capacidad de inhibición 70.24 % y 61.08 % sobre P. cinnamomi, mientras que el aislado Bm-10 identificado como B. amyloliquefaciens mostró el menor PIRG (42.25 %) contra P. cinnamomi (Figura 1A). Adicionalmente, se observó una reducción en la tasa de crecimiento micelial de P. cinnamomi con el aislado Bc-02 de 9.1 mm/día.

Figura 1 Efecto antifúngico de cepas bacterianas en el crecimiento radial, tasa de crecimiento y porcentaje de inhibición micelial de A) Phytophthora cinnamomi, B) Fusarium oxysporum y C) Colletotrichum sp. * GR= Tasa de crecimiento. Valores con la misma letra son estadísticamente iguales de acuerdo con la prueba Tukey (p=0.05).

Los ensayos in vitro de los aislados Ba-05 y Bs-11 contra F. oxysporum mostraron inhibiciones de 33 % a 56.33 % con reducciones en su tasa de crecimiento de 7.33 mm/ día, respectivamente (Figura 1B). Los aislados Bs-11 y Bs-06 identificadas como B. subtilis mostraron inhibiciones superiores al 63.24 % sobre Colletotrichum sp., mientras que el aislado B. cepacia (Bc-06) mostró la menor inhibición (35.72 %) con respecto al testigo (Figura 1C). En este hongo, se observó una reducción en la tasa de crecimiento micelial 10.47 mm/día al confrontarse con el aislado Bs-11 de B. subtilis.

De los 10 aislados bacterianos obtenidos de rizosfera de árboles de aguacate, 90 % perteneció al género Bacillus y el 10 % al género Burkholderia. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por ^{Pozo et al. (2007)} quienes aislaron bacterias de diferentes regiones de la Habana, Cuba, con un gran número de cepas correspondientes al género Bacillus spp. ^{Garbeva et al. (2003)} en estudios de la microbiota de suelos agrícolas, determinaron que aproximadamente el 95 % del DNA presente en estos, pertenecía a los géneros Bacillus y Paenibacillus. El aislado Bc-02 de B. cepacia mostró la mayor inhibición de crecimiento (70.24 %) sobre P. cinnamomi, seguida por los aislados Ba-05 y Bs-06 pertenecientes a B. amyloliquefaciens y B. subtilis, con inhibiciones de crecimiento de 61.08 % y 57.54 %, respectivamente. Estos resultados coinciden con ^{Ezziyyani et al. (2004)}, quienes reportaron a B. cepacia con una inhibición de Phytophthora capsici del 81 % a las 96 h y a los 8 d fue sobrecrecida por la bacteria. Este aislado tiene potencial de uso como agente de control biológico de fitopatógenos, por su alta capacidad inhibitoria atribuida a la producción de metabolitos secundarios como pirrolnitrina, altericidina, cepacina, entre otros compuestos volátiles y no volátiles (^{Kraus & Loper, 1995}; ^{Rosales et al., 1995}; ^{El-Banna et al., 1998}; ^{De La Fuente et al., 2001}; ^{Quan et al., 2006}).

La inhibición del crecimiento de F. oxysporum y Colletotrichum sp., inducida por los aislados de Bacillus spp. fue significativamente diferente, estas diferencias pudieron deberse a la capacidad de cada aislado para producir compuestos antimicrobianos como bacilomicina, micosubtilina, fungimicina y zwittermicina que inhiben el crecimiento de diversos microorganismos incluidos los hongos (^{Pal & Gardener, 2006}; ^{Madhaiyan et al., 2010}; ^{Zhang et al., 2012}). Al respecto, ^{Edwards et al. (1994)} menciona que la antibiosis es el modo de acción más común en el género Bacillus.

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp. mostraron inhibiciones en su crecimiento de 56.33 % y 64.43 %, inducidos por el aislado Bs-11 de B. subtilis. ^{Corrales et al. (2011)} reportaron a esta especie con una inhibición in vitro del 71.71 % sobre Fusarium spp. ^{Kim et al. (2010)} reportaron la producción de fracciones de iturina A y fengicina por una cepa de B. subtilis al confrontarse contra Colletotrichum gloeosporioides. Los antibióticos del grupo Iturin son secretados por la mayoría de las cepas de Bacillus spp. e inhiben el crecimiento micelial y la esporulación del hongo al alterar la permeabilidad de la membrana y la composición lipídica de la célula fúngica (^{Romero et al., 2007}; ^{Li et al., 2009}). Las inhibiciones mostradas por Bacillus methylotrophicus (Bm-10) sobre Fusarium sp. (53.32 %) y Colletotrichum spp. (63.16 %), fueron similares a lo reportado por ^{Rios et al. (2016)}. Al respecto, ^{Madhaiyan et al. (2010)} y ^{Zhang et al. (2012)}, demostraron que B. methylotrophicus tiene capacidad antifúngica contra una gran diversidad de hongos fitopatógenos.

Bacillus methylotrophicus (Bm-10) y B. subtilis (Bs-11) mostraron la mayor capacidad antifúngica contra los tres hongos, lo cual pudiera deberse a la producción de antibióticos y/o compuestos volátiles como cianuro de hidrógeno, que se ha reportado como uno de los responsables de la inhibición del crecimiento de hongos fitopatógenos, además de sus efectos nocivos en el crecimiento in vitro de varios fitopatógenos al afectar la actividad de enzimas fúngicas específicas (^{Wheatley, 2002}; ^{Duffy et al., 2003}; ^{Correa et al., 2009}; ^{Zhang et al., 2012}). Al respecto, ^{Souto et al. (2004)} reportaron que la capacidad antifúngica de B. amyloliquefaciens al ser confrontada in vitro se debe a la producción y liberación de péptidos y lipopéptidos al medio de cultivo, tales como fungicina, iturina, bacilomicina, entre otros. Conocer la capacidad antagónica de las cepas bacterianas sobre los diferentes fitopatógenos es de gran interés, ya que algunas cepas evaluadas en nuestro estudio mostraron mayor capacidad antifúngica in vitro contra P. cinnamomi y menor efecto al confrontarse con F. oxysporum (Figura 1B). Estos resultados muestran la variabilidad existente entre aislados, debido a la especificidad de los antibióticos producidos por bacterias (^{Schippers et al., 1987}). Además de los mecanismos de defensa propios de los hongos.

Conclusión

En suelos rizosféricos de huertos de aguacate en Nayarit, existe diversidad de cepas bacterianas, ya que se identificaron las especies de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Burkholderia cepacia y Bacillus sp. con capacidad antagónica in vitro contra Phytophthora cinnamomi, Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp. Algunas de estas podrían ser candidatas potenciales para incluirse en esquemas de manejo integrado de los tres hongos de interés agrícola estudiados.

Agradecimientos

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) y a la Universidad Autónoma de Nayarit.

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Como citar este artículo: De Dios Avila, N., Ríos Velasco, C., Luna Esquivel, G., Cambero Campos, O. J., Cambero Ayón, C. B., Estrada-Virgen, M. O. (2020). Identification and antagonic activity in vitro isolation of bacteria against fungi of agricultural important. Revista Bio Ciencias 7, e803. doi: https://doi.org/10.15741/revbio.07.e803

Recibido: 23 de Agosto de 2019; Aprobado: 10 de Febrero de 2020

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