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Revista bio ciencias
On-line version ISSN 2007-3380
Revista bio ciencias vol.6 Tepic Jan. 2019 Epub Oct 02, 2020
https://doi.org/10.15741/revbio.06.e413
Artículos Originales
Hospederos y Vectores de Xylella fastidiosa en Viñedos de Parras, Coahuila, México
1Dpto. de Parasitología Agrícola Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro Calzada Antonio Narro #1923, Colonia Buenavista, C.P. 25315, Saltillo, Coahuila, México.
2Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria-SENASICA, Km. 37.5, carretera Federal México-Pachuca, C.P. 557401, Tecámac, Edo. de México, México.
Xylella fastidiosa es una bacteria fitopatógena que causa enfermedades de importancia en diferentes cultivos como la enfermedad de Pierce en vid (Vitis vinifera) y la clorosis variegada de los cítricos, entre otras. La bacteria se propaga de una manera muy rápida mediante insectos vectores, principalmente chicharritas (Cicadellidae) y salivazos (Cercopidae). La presente investigación tuvo como objetivo determinar los vectores y hospederos de Xylella fastidiosa en viñedos ubicados en el valle de Parras, Coahuila. Se colectaron muestras de 22 especies, entre ellas plantas de ornato, malezas, arbustos, árboles frutales, forestales perennes y caducifolios; al mismo tiempo, se colectaron e identificaron los insectos encontrados en las zonas de muestreo. La detección de X. fastidiosa en plantas e insectos se realizó mediante PCR utilizando los primers RST31/RST33. De igual forma, se llevó a cabo la identificación de X. fastidiosa subsp. multiplex con los primers ALM1/ALM2 y XF2542-L/XF2542-R en muestras vegetales que resultaron positivas en la primera prueba. Se detectó la presencia de X. fastidiosa en plantas de vid comercial y vid silvestre, mientras que en árboles de chabacano y fresno se identificó a X. fastidiosa subsp. multiplex. Entre los insectos colectados se identificaron seis géneros y cuatro especies de cicadélidos, sin embargo solo se detectó a X. fastidiosa en Homalodisca vitripennis.
Palabras clave: Xylella; Enfermedad de Pierce; Homalodisca
Xylella fastidiosa is a phytopathogenic bacterium that causes important diseases in different crops such as Pierce’s disease in grapevine (Vitis vinifera), citrus variegated chlorosis, among others. The bacterium spreads very fast through vector insects, mainly leafhoppers (Cicadellidae) and spittlebugs (Cercopidae). The objective of present investigation was to determine the vectors and hosts of Xylella fastidiosa in vineyards located in Parras valley, Coahuila. Samples of 22 species were collected, including ornamental plants, weeds, shrubs, fruit trees, evergreen and deciduous forest; At the same time, the insects found in the sampling areas were collected and identified. The detection of X. fastidiosa in plants and insects was performed by PCR using the primers RST31/RST33. In the same way, identification of X. fastidiosa subsp. Multiplex with primers ALM1/ALM2 and XF2542-L/XF2542-R in plant samples that were positive in first test was carried out. The presence of X. fastidiosa was detected in commercial vine and wild grape plants, while X. fastidiosa subsp. multiplex was identified in apricot and ash trees. Among the insects collected, six genera and four species of leafhoppers were identified, however, only X. fastidiosa was detected in Homalodisca vitripennis.
Key words: Xylella; Pierce disease; Homalodisca
Introducción
Xylella fastidiosa es una bacteria fitopatógena que causa enfermedades de importancia en diferentes cultivos como la enfermedad de Pierce en vid (Vitis vinifera), la crespera del café (Coffea arabiga), el síndrome de decaimiento súbito del olivo (Olea europea), la quemadura de la hoja del almendro (Prunus dulcis), la clorosis variegada de los cítricos, enanismo de la alfalfa (Medicago sativa) y quemaduras de la hoja en arboles urbanos (de Lima et al., 1998; Purcell et al., 1999; Li, et al., 2001; Almeida & Purcell, 2003; Sisterson et al., 2010; Costa et al., 2004). La bacteria se ha encontrado de forma latente en hospederos asintomáticos como artemisa (Artemisia douglasiana) y pasto pata de gallo (Echinochloa cruz-galli) que sirven como reservorios de inóculo (Hopkins & Purcell, 2002). Los síntomas que presentan las plantas infectadas por X. fastidiosa generalmente se manifiestan primero en algunas hojas y luego en casi todo el follaje. El área afectada está delineada por un estrecho halo clorótico que se vuelve especialmente claro en otoño. Se presenta defoliación prematura y malformación en hojas nuevas, los frutos crecen anormalmente, los tallos pueden mostrar decoloración interna y externa; en algunos casos ocurre una muerte regresiva y crecimiento anormal terminando eventualmente en la muerte del hospedero (Janse & Obradovic, 2010). X. fastidiosa se propaga naturalmente mediante insectos vectores principalmente chicharritas (Cicadellidae) y salivazos (Cercopidae) de manera muy rápida debido a que no hay periodo de latencia para su transmisión, algunas especies relacionadas como vectores de X. fastidiosa son: chicharrita cabeza roja (Xyphon fulgidum) (Catanach et al., 2013), chicharrita verde (Draeculacephala minerva), chicharrita verde-azulada (Graphocephala atropunctata), chicharrita de la alfalfa (Phera lacerta) (Burks & Redak, 2003a), chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis) y Oncometopia nigricans, entre otros (Hill & Purcell, 1997; Brlansky et al., 2002; Díaz, 2003; Hoddle, 2004; Blackmer, 2006; Daane et al., 2011). La bacteria no es trans-ovarial ni trans-estadial, se alimenta y se reproduce en el salivario de los insectos adultos los cuales pueden permanecer infectivos a lo largo de toda su vida (Almeida et al., 2005; Redak et al., 2004). La detección de la bacteria se realiza principalmente por técnicas serológicas como ELISA y técnicas moleculares como PCR en la que se utilizan primers específicos como los RST3/; RST33 (Minsavage et al., 1994) y XF1968-R/XF1968-L (Firrao & Bazzi, 1994). El objetivo de la presente investigación fue determinar los vectores y hospederos de Xylella fastidiosa en la zona vitivinícola de Parras, Coahuila, México.
Material y Métodos
Colecta de material vegetal
La colecta de material vegetal se realizó en el área circundante a 4 viñedos de Parras, Coahuila, México durante el 2016. Se colectaron hojas y brotes de 22 especies de plantas con síntomas similares a los ocasionados por X. fastidiosa.
Colecta de insectos
Utilizando una red entomológica de golpeo a través de una serie de 500 redeos efectuados en la periferia de los viñedos se colectaron insectos en malezas y de manera manual se colectaron en los arbustos, árboles frutales y forestales. Los insectos fueron conservados en etanol al 70 %.
Identificación de insectos
Los insectos fueron separados y agrupados mediante observaciones morfológicas, la identificación se realizó con ayuda de claves taxonómicas (DeLong & Davidson, 1935; Young, 1958; Blocker, 1967) y extracción de genitales masculinos.
Extracción de DNA de plantas e insectos
Para esta investigación, se utilizó el método de extracción de CTAB DNA (Doyle & Doyle, 1987) con modificaciones. De cada planta se tomaron de 50 a 100 mg de tejido y en el caso de los insectos, se consideró al espécimen completo. De las plantas se seleccionaron las nervaduras principales y el peciolo de cada hoja, estos se maceraron con 300 µL de buffer CTAB, se colocaron en tubos eppendorf y se agregó 1 mL de buffer CTAB, se agregaron 100 µL de NaCl 5M, se incubaron a 95 °C por 90 min, se centrifugaron a 12,000 rpm por 1 min y se recuperó el sobrenadante. Se agregaron 500 µL de cloroformo alcohol isoamílico (24:1), se mezclaron por inversión y se centrifugaron 12,000 rpm durante 10 min; se recuperó el sobrenadante y se agregaron 500 µL de isopropanol frío. Las muestras se incubaron toda la noche a -20 °C, posteriormente se centrifugaron a 12,000 rpm durante 15 min, se decantaron y la pastilla obtenida se lavó con 1 mL de etanol al 70 % centrifugando a 12,000 rpm por 5 min. La pastilla se re suspendió en 100 µL de agua estéril libre de nucleasas.
Detección de X. fastidiosa en plantas e insectos
La detección de la bacteria se realizó mediante PCR utilizando los primers RST31 (5´-GCGTTAATTTTCGAAGTGATTCGATTGC-3´) y RST33 (5´CACCATTCGTATCCCGGTG-3´) (Minsavage et al., 1994). El procedimiento para la reacción PCR consistió en 1 ciclo a 95 °C por 5 min, 35 ciclos de amplificación: 95 °C por 30 s, 60 °C por 30 s, 72 °C por 45 s y la extensión final a 72 ºC por 7 minutos. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1.5 %, para la tinción se utilizó bromuro de etidio.
Detección de X. fastidiosa subsp. multiplex.
Las muestras que resultaron positivas para X. fastidiosa se analizaron nuevamente por PCR para la identificación de subespecie utilizando los primers específicos para la subsp. multiplex XF1968-L (5′-GGAGGTTTACCGAAGACAGAT-3′) y XF1968-R (5′ATCCACAGTAAAACCACATGC-3′), ALM1 (5′-CTGCAGAAATTGGAAACTTCA G-3′) y ALM2 (5′-GC CACACGTGATCTATGAA-3′) (Hernández-Martínez et al., 2006). La amplificación consistió en 1 ciclo a 94 °C por 5 min, 40 ciclos a 94 °C por 1 min, temperatura de anillamiento 55 °C por 1 min, 72 °C por 1 min y la extensión final fue de un ciclo a 72 °C por 10 min. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1.5 %
Resultados
Identificación de insectos y detección de X. fas-tidiosa en insectos
Se identificaron seis géneros y cuatro especies de cicadélidos mediante observaciones morfológicas y con el uso de claves taxonómicas. Uno de los cicadélidos se identificó como Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae) conocida comúnmente como chicharrita de alas cristalinas (Figura 1). De los géneros analizados mediante PCR solo se detectó a X. fastidiosa en H. vitripennis (Tabla 1) misma que se reporta como el principal vector de la bacteria. En relación con lo anterior, Almeida & Purcell (2003) demostraron que H. vitripennis es vector de X. fastidiosa mediante un experimento de transmisión en invernadero. Asimismo, Hopkins & Purcell (2002) confirmaron que H. vitripennis es el principal vector transmisor de la bacteria al relacionar la coincidencia de patrones de altas poblaciones del insecto con la aparición de nuevos brotes de la enfermedad de Pierce en el valle de Napa, Sonoma y Temecula en Estados Unidos. La literatura no menciona a los demás géneros de cicadélidos identificados en esta investigación como insectos vectores de X. fastidiosa.
Detección de X. fastidiosa en plantas
De las 22 especies de plantas analizadas se detectó a X. fastidiosa en plantas de vid (muestras vid 1 y vid silvestre), en chabacano (muestras 1, 2 y 3) y en fresno (muestras 1 y 2) (Tabla 2). La identificación se realizó mediante la observación de una banda de 733 pb en el gel de electroforesis. Los resultados encontrados en este estudio son similares a los descritos en la base de datos de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (European Food Safety Authority-EFSA) en el 2016, éstos señalan que X. fastidiosa subsp. fastidiosa se detectó en plantas de vid, mientras que X. fastidiosa subsp. multiplex se encuentra presente en árboles de fresno y chabacano, así como en árboles de olivo.
Tabla 2 Resultados de la prueba de PCR en plantas para la detección de X. fastidiosa.
| Plant | Scientific name | PCR Result |
|---|---|---|
| Wild vine | Vitis sp. | Positive |
| Eucalyptus | Eucalyptus sp. | Negative |
| Rose | Rosa sp. | Negative |
| Pear | Pyrus communis | Negative |
| Peach | Prunus domestica | Negative |
| Oriental persimmon | Diospyrus kaki | Negative |
| Carnation | Dianthus caryophyllus | Negative |
| Chinese palm | Yucca filifera | Negative |
| Pecan | Carya illinoensis | Negative |
| Vine 1 | Vitis vinifera | Positive |
| Vine 2 | Vitis vinifera | Negative |
| Jupiter tree | Lagerstroemia indica | Negative |
| Cedar | Cedrela sp. | Negative |
| Japanese privet | Ligustrum japonicum | Negative |
| Olive | Olea europea | Negative |
| Lily | Lilium candidum | Negative |
| Johnson grass | Sorghum alepense | Negative |
| Apricot 1 | Prunus armeniaca | Positive |
| Apricot 2 | Prunus armeniaca | Positive |
| Apricot 3 | Prunus armeniaca | Positive |
| Mandarin | Citrus reticulata | Negative |
| Bouganvilla | Bougainvillea sp. | Negative |
| Avocado | Persea americana | Negative |
| Fig | Ficus carica | Negative |
| Ash 1 | Fraxynus sp. | Positive |
| Ash 2 | Fraxynus sp. | Positive |
| Ash 3 | Fraxynus sp. | Negative |
| Ash 4 | Fraxynus sp. | Negative |
Detección de X. fastidiosa subsp. multiplex
La identificación de X. fastidiosa subsp. multiplex se llevó a cabo utilizando los primers XF1968-L/XF1968-R y ALM1/ALM2. Se logró detectar a la bacteria en plantas de chabacano (muestras 1, 2 y 3) y fresno (muestras 1 y 2) mediante la observación de un amplificado de 638 y 521 pb correspondientes a los primers antes mencionados. La prueba de PCR multiprimers con los pares de primers: XF1968-L/ XF1968-R, XF2542-L/XF2542-R y ALM1/ALM2 utilizados para diferenciar X. fastidiosa en plantas infectadas de vid, almendro y laurel de flor fue desarrollada por Hernández-Martínez et al. (2006)). En su ensayo, las subespecies fueron diferenciadas en base al conjunto de primers que amplificaron; en base a esto, reportaron que las muestras que amplificaron con los tres pares de primers corresponden a X. fastidiosa subsp. multiplex.
Conclusiones
Se demostró que X. fastidiosa se encuentra afectando a diferentes hospederos en la zona vitivinícola de Parras, Coahuila. Además de detectar a X. fastidiosa en plantas de vid comercial y vid silvestre, se identificó a X. fastidiosa subsp. mutiplex en otros hospederos como fresno y chabacano. De igual forma, detectó a X. fastidiosa en H. vitripennis el cual es un potencial vector de la bacteria en el valle de Parras, Coahuila, México.
REFERENCIAS
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1Como citar este artículo: Camacho Aguilar, I. I., Hernández Castillo, F. D., González Gallegos, E., Blanco Rodríguez, E., Flores Olivas, A., García Martínez, O. (2019). Host and Vectors of Xylella fastidiosa in Parras, Coahuila Vineyards, Mexico. Revista Bio Ciencias 6, e413. doi: https://doi.org/10.15741/revbio.06.e413
Recibido: 12 de Diciembre de 2017; Aprobado: 15 de Junio de 2018
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