Cepas y semillas utilizadas

Fueron utilizadas tres cepas de B. subtilis para la presente investigación (BSN, BS14, and BS8). La cepa BSN fue proporcionada por el Centro de investigación y de estudios avanzados del IPN (CINVESTAV) unidad Irapuato, por su parte, BS8 y BS14 fueron provistas por el Departamento de parasitología molecular de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Las cepas fueron activadas en medio TGE (triptona glucolsa extracto de levadura) a 28 °C (^{Calvo & Zuñiga, 2010}). Las semillas de Arabidopsis thaliana fueron provistas por el CINVESTAV Irapuato.

Obtención de caldos de fermentación de B. subtilis

La fermentación fue realizada en medio Landy adicionado con triptófano. El medio Landy fue preparado como sigue: ácido glutámico 5.0 g/L, KH₂PO₄ 0.5 g/L, K₂HPO₄ 0.5 g/L, MgSO₄ .7 H₂O 0.2 g/L, MnSO₄ .H₂O 0.01 g/L, NaCl 0.01 g/L, FeSO₄ .7 H₂O 0.01 g/L, CuSO₄ .7 H₂O 0.01 g/L, CaCl₂ .2 H₂O 0.015 g/L y triptófano (concentración final 5mM). Posteriormente, fue adicionada una solución de glucosa esterilizada por microfiltración (filtro de 0.2 μm) para una concentración final de 1 %. Fue realizado un preinóculo de Bacillus en 50 mL de medio Landy e incubado a 28 °C por 48 h. Del preinóculo fueron preparados los caldos de fermentación a una concentración de 1x10⁷ CFU/mL en el medio, se agitaron a 120 rpm a 25 °C por 72 h (^{Awais et al., 2010}).

Obtención de sobrenadante libre de células

Para la obtención de los sobrenadantes libres de células, los caldos de fermentación de B. subtilis (BS8, BS14 y BSN) fueron centrifugados a 4 °C y 12,000 g (centrífuga 5810/5810 R) por 10 min y posteriormente fueron filtrados para esterilización con un microfiltro de 0.20 μm.

Detección de sideróforos por medio CAS

Para la detección de sideróforos se utilizó la técnica de ^{Brian et al. (2011)}. La técnica está basada en el uso de cromo azurol S (CAS) y bromuro dehexadeciltrimetilamonio (HDTMA) e indicadores (^{Abdel-Aziz, 2013}).

Cuantificación de auxinas y ácido jasmónico por HPCL

Se utilizó HPLC acoplado a UV para la cuantificación de auxinas (IAA, triptamina, 3-indolilacetonitrilo) y ácido jasmónico en los caldos de fermentación de B. subtilis. Para las curvas de calibración se utilizaron estándares grado reactivo en un rango de 1 a 1000 ppm en fase móvil (metanol-agua-ácido acético en una relación 60:40:1). Para la preparación de las muestras, se tomaron 50 mL del sobrenadante de fermentación, se ajustó el pH a 2.8 con HCl 1M y se realizaron 3 extracciones con 50 mL de acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron y se les añadió sulfato de sodio anhidro para remover la humedad (^{Castillo, et al., 2005}). El solvente fue removido con rotavapor a 60 °C. Finalmente, el residuo fue resuspendido con 2 mL de fase móvil (metanol-agua-ácido acético en una relación 60:40:1) y se microfiltró. La separación cromatográfica se realizó en fase reversa con una columna C18, utilizando la fase móvil mencionada (previamente desgasificada) con un flujo de 0.7 mL/min. La detección se realizó con un UV a 296 nm y se interpoló en la curva de calibración (^{Castillo et al., 2005}).

Evaluación de promoción de crecimiento en semillas

Semillas de Solanum lycopersicum y Arabidopsis thaliana fueron tratadas con sobrenadante libre de células y con caldo de fermentación para la evaluación del porcentaje de germinación. Para la evaluación de los sobrenadantes, se mezcló medio Murasige y Skoog (MS) con 1 mL del sobrenadante por caja, antes de la solidificación del medio, y posteriormente se colocaron las semillas previamente esterilizadas. Para la evaluación de los caldos de fermentación, las semillas previamente esterilizadas, se sumergieron durante 30 min en los caldos y posteriormente las cajas petri se colocaron en las cajas con medio MS. Las cajas fueron colocadas verticalmente en una cámara bioclimática a 25 °C con fotoperiodo de 16/8 h de luz-obscuridad. El porcentaje de germinación de semillas fue evaluado después de 7 días que inició el experimento. El experimento fue realizado con 9 réplicas (semillas) con un diseño ANOVA totalmente al azar con un nivel de significancia de 0.05 y comparación de medias de Tukey.

Evaluación de promoción de crecimiento en plántulas tratadas con caldos de fermentación de B. subtilis

La promoción de crecimiento se evaluó adicionando caldo de fermentación de B. subtilis a plántulas de Solanum lycopersicum. Las plántulas de Solanum lycopersicum se germinaron en charolas con sustrato turba de musgo. A los 21 días después de la germinación se transplantaron a contenedores con turba de musgo, perlita y verniculita (3:2:1). Se adicionó a las plántulas 3 mL del caldo de fermentación (BS8, BS14 y BSN), homogenizado por agitación antes de la adición, cerca de las raíces con ayuda de una jeringa. Se utilizaron plantas sin tratamiento y con medio Landy como control. Cada tratamiento fue realizado con 7 repeticiones (^{Mena-Violante et al., 2009}). A partir de la aplicación del tratamiento se tomaron mediciones diarias del largo del tallo y número de foliolos por 60 días. En el día 60 se evaluaron: largo de raíz, peso húmedo de plántulas, peso húmedo de raíz, peso seco de plántula, peso seco de raíz, peso húmedo de tallo y hojas, porcentaje de humedad de plántulas y porcentaje de humedad de raíz (^{Gómez-Luna et al., 2012}; ^{Mena-Violante et al., 2009}; ^{Airola, 2010}). El experimento fue realizado bajo un diseño ANOVA completamente al azar con un nivel de significancia de 0.05 y comparación de medias de Tukey.

Síntesis de sideróforos

Las tres cepas de B. subtilis fueron capaces de producir sideróforos, según los halos observados en los medios CAS (Figura 1). Según ^{Bolívar-Anillo et al. (2016)}, los sideróforos hacen más asequible el hierro para las plantas y promueven el crecimiento de las mismas. La producción de sideróforos se considera importante en la supresión de microorganismos deletéreos al monopolizar el hierro disponible en el suelo, y en algunos casos parece desencadenar resistencia sistémica inducida en las plantas (^{Suárez-Moreno et al., 2012}).

Figura 1 Halo de sideróforos en medio CAS. Donde A es la cepa BS8, B es BS14 y C es BSN. 

Producción de índoles

En la cuantificación de compuestos indólicos se observó que las cepas evaluadas producen IAA y otras índoles en concentraciones variables. La concentración de índoles en las cepas se presenta en la Tabla 1. La concentración de IAA fue elevada en comparación con estudios previos (^{Wahyudi et al., 2011}; ^{Luna et al., 2013}), razón por la que las cepas tuvieron un efecto positivo en la promoción de crecimiento. La presencia de precursores de IAA (triptamina y 3-indolilacetonitrilo) indican el potencial de las cepas para producir más IAA bajo condiciones específicas de fermentación. En general, la producción de auxinas por las bacterias, especialmente el IAA, ha evidenciado influir significativamente en sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas (^{Sánchez et al., 2012}).

Producción de ácido jasmónico

De las tres cepas evaluadas solo la BS8 mostró producción de ácido jasmónico a una concentración de 54.48 ppm. Microorganismos promotores de crecimiento como Thrichoderma sp. activa el mecanismos de defensa de la planta a través del ácido jasmónico, pudiendo también intervenir en la producción del ácido salicílico, mensajero de resistencia sistémica adquirida (^{Alcedo & Reyes, 2018}). De esta forma estimulan el crecimiento de plantas.

Porcentaje de germinación

No se mostró incremento en los porcentajes de germinación de semillas de Solanum lycopersicum tratadas con B. subtilis o sus metabolitos. En cuanto a Arabidopsis thaliana el porcentaje de germinación incrementó con la adición del sobrenadante (metabolitos) de BS14, y con los caldos de fermentación de BS8 y BS14. BSN provocó un decremento en los porcentajes de germinación. Los porcentajes de germinación de Arabidopsis thaliana se muestran en la Figura 2.

Figura 2 Porcentajes de germinación de semillas de Arabidopsis thaliana a los 7 días de ser tratadas con sobrenadantes o caldos de fermentación de cepas de B. subtilis. 

^{Liu et al. (2013)}, demostraron que la dormancia de las semillas es reducida por la presencia de auxinas a través de la estimulación de señalización del ácido abcísico. Las cepas de estudio demostraron la capacidad para producir auxinas (IAA, triptamina y 3-indolilacetonitrilo), por lo que la promoción en el porcentaje de germinación esta posiblemente relacionada a estos metabolitos. Posteriormente a la toma de lecturas de germinación, las semillas control se contaminaron con patógenos, pero no aquellas semillas con tratamiento de B. subtilis, esto se puede atribuir a la capacidad de las cepas de producir sideróforos, que según investigaciones previas, tienen la capacidad de controlar patógenos por limitar la disponibilidad de hierro (^{Jung et al., 2006}; ^{Cazorla et al., 2007}; ^{Woo & Kim, 2008}; ^{Tejera-Hernández et al., 2011}; ^{Yu et al., 2011}).

Largo de tallo

Las cepas de B. subtilis evaluadas mostraron promoción en el largo del tallo de las plántulas de Solanum lycopersicum. Los tres tratamientos presentaron diferencias significativas según el análisis estadístico (Figura 3). BS8 (a) incrementó el largo del tallo en un 45 %, BS14 (b) en 33 %, y BSN (c) en un 17 % respecto al CA (e).

Figura 3 Parámetros agronómicos evaluados en plántulas tratadas con cepas de B. subtilis (BSN, BS8, BS14), control químico (C.Q.) y control absoluto (C.A.). 

Número de foliolos

BS8 (a) mostró el mayor número de foliolos, seguido de aquellos tratados con BS14 (b), BSN (bc) y los controles (bc) (Figura 3). El incremento en número de foliolos se relaciona a la presencia de auxinas en los caldos de fermentación. Las auxinas retrasan la abcisión de órganos (hojas, flores y fruto joven) por inhibición de la hormona etileno (^{Van Doorn & Stead, 1997}). Como se muestra en las evaluaciones del largo del tallo y número de foliolos, BS8 es el mejor tratamiento, probablemente se debe a la producción de otro tipo de fitohormonas como citoquininas. En previos estudios se ha asociado la acumulación de citoquininas al incremento de peso de plantas (30 %), en complejo con altos niveles de hormonas como IAA y ácido abcísico (ABA) (^{Arkhipova et al., 2005}; ^{Rojas-Solis et al., 2013}).

Largo de raíz

No se observaron diferencias significativas en el largo de raíces respecto a los controles (Figura 3). No obstante, BS8 presentó mayor cantidad de raíces secundarias. ^{Jordan & Cassareto (2006)} indican que altas concentraciones de IAA promueven la elongación del tallo pero inhibe el crecimiento de raíz, mientras que bajas concentraciones de IAA induce el crecimiento de raíz. La concentración óptima de IAA depende de cada especie vegetal, sin embargo, en el presente trabajo, las concentraciones de metabolitos promovieron el largo del tallo pero no el largo de raíz.

Peso húmedo

Los resultados del peso húmedo de raíz no muestran diferencia significativa entre tratamientos (Figura 3). En cuanto al peso húmedo de plántula, BS8 (a) es mejor que CA (b) y BS14 (b), pero no mejor que CQ (ab) y BSN (ab). La efectividad de BS8 en el incremento de peso húmedo se podría lograr incrementando la concentración de L-triptófano en el medio de cultivo. ^{Ali et al. (2009)} encontraron que diferentes aislamientos de Bacillus sp. aumentaron la concentración de IAA producido al aumentar la concentración de L-triptófano.

Peso seco

No se observó diferencia significativa en el peso seco de raíz (Figura 3). En la prueba de peso seco de plántula, solo el tratamiento BS8 (a) fue mejor que CA (b), BS14 (ab), BSN (ab), CQ (ab) no presentaron diferencias significativas a los antes mencionados. Según los estudios de ^{Marquina et al. (2018)} la adición de triptófano a las plantas puede promover el incremento en el peso seco. Por lo que probablemente mayor concentración de triptófano en los medios de cultivo habría promovido el peso seco de las plántulas.

Porcentaje de humedad

En cuanto al porcentaje de humedad de plántula y raíz no se observaron diferencias significativas de los tratamientos respecto a los controles (Figura 3). Esto se relaciona a los resultados obtenidos tanto de peso húmedo como seco de raíz y plántula. Las cuales en su mayoría no mostraron diferencia significativa a excepción de los tratamientos con BS8. Los resultados muestran que las cepas evaluadas podrían ser mezcladas en bioformulados para promover diferentes parámetros agronómicos a los que promueven de forma individual. Se ha demostrado que las interacciones de las rizobacterias del hospedero interaccionan favorablemente con Bacillus spp. para la promoción de crecimiento (^{Martínez-Viveros et al., 2010}).