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Introducción
El uso de Baculovirus para el control de plagas agrícolas se ha extendido a nivel comercial, y en la actualidad se aplica exitosamente en el control biológico de plagas del maíz, soya y algodón (Beas-Catena et al., 2014). Estos casos justifican la investigación sobre el uso de Baculovirus para controlar diferentes artrópodos que actúan como plagas forestales, y que causan graves daños en los bosques de pinos, cedros y encinos en distintas regiones de México.
Tal es el caso de las avispas de la familia Diprionidae, mejor conocidas como moscas sierra, estos insectos provocan la defoliación de miles de hectáreas de bosques de clima templado dentro del territorio mexicano, lo que origina cuantiosas pérdidas en recursos madereros (Gonzáles et al., 2014). En los últimos siete años se han registrado brotes epidémicos en Chihuahua, Durango, Guerrero, Jalisco, Oaxaca y San Luis Potosí, entre otros (González y Sánchez, 2018).
Los principales hospederos de las moscas sierra son especies de la familia Pinaceae y Cupresaseae, sus larvas ocasionan defoliaciones de los árboles al alimentarse de las acículas; aunque los daños provocados no causan la muerte de su hospedero, pero lo deja susceptible a otro tipo de plagas y enfermedades que podrían inducir severas afectaciones, incluso la muerte del árbol (González y Sánchez, 2018). La familia Diprionidae presenta varios géneros, en los bosques de México se han citado: Neodiprion spp., Monoctenus spp. y Zadiprion spp., como los principales responsables de las defoliaciones (Gonzáles et al., 2014).
En la actualidad, se utilizan distintos métodos para controlar este tipo de plagas, uno de ellos es el químico que, aunque es eficiente, causa severos daños al ambiente y afecta a otros organismos, por lo que se ha buscado implementar el uso del control biológico (Garcia-Robles et al., 2001). Al respecto, hay estudios en los que se utilizan hongos o bacterias entomopatógenas, pero estos afectan tanto a las moscas sierra, como a otras especies por lo que su uso no es recomendable para el biocontrol de esos insectos (González y Sánchez, 2018); por el contrario, los Baculovirus son específicos y eficientes para el control de las moscas sierra en los bosques de Canadá (Moreau et al., 2005).
Este tipo de virus pertenecen a la familia Baculoviridae, que poseen un genoma de ADN circular de doble cadena, cuyo tamaño varía desde 80 hasta 180 kpb. Los Baculovirus presentan dos fenotipos de viriones: los virus ocluidos (ODV) y los viriones brotantes (BV) que corresponden a su forma infectiva (Wang y Hu, 2019). Los que infectan a las moscas sierra pertenecen al género Gammabaculovirus, el cual se caracterizan por formar cuerpos de oclusión (OB) en el núcleo de las células del epitelio intestinal de las larvas, estas oclusiones también llamados poliedros son agregados de una proteína viral denominada poliedrina en el caso de los virus de poliedrosis nuclear (NPV), y granulina en los virus de granulosis (GV); ambas matrices proteícas brindan resistencia y estabilidad a las condiciones ambientales.
El insecto ingiere los OB y después de la ingesta, la matriz que los rodea es digerida en el intestino de la larva, debido a las condiciones alcalinas liberando a los BV, que son los que inician la infección sistémica del insecto, la cual desencadena su muerte.
Los Baculovirus se clasifican en cuatro géneros: Alphabaculovirus (NPV) y Betabaculovirus (GV) que afectan a lepidópteros; Gammabaculovirus (NPV) a Himenópteros y Deltabaculovirus (NPV) a Dípteros (Rohrmann, 2019; King et al., 2012). En Canadá se logró desarrollar una suspensión concentrada de NPV llamada Abietiv®, cuyo ingrediente activo es el virus de poliedrosis nuclear de Neodiprion abietis que se aplica de manera aérea en las zonas forestales afectadas por estos organismos. En bosques de abeto balsámico [Abies balsamea (L.) Mill.], se demostró la efectividad de este producto en el control de moscas sierra (Lucarotti et al., 2012).
El protocolo para la obtención de la suspensión viral consiste en la concentración del virus a partir de larvas infectadas, producto que se genera de manera cíclica; ya que en la región forestal donde se esparce, y una vez que se constata que las larvas mueren por la infección viral, se colectan los cadáveres que se consideran material infectante para la elaboración de un nuevo lote de la suspensión viral, esto se realiza sucesivamente cada que se requiere utilizar el biopesticida; sin embargo, los costos de producción son grandes (Moreau et al., 2005).
Una solución para evitar el procedimiento antes descrito es el cultivo in vitro del Baculovirus. Para ello, se necesita implementar un cultivo celular capaz de replicar el virus y obtener cantidades considerables del mismo (Rohrmann, 2019).
Actualmente, se han establecido distintos cultivos de células hospederas de AlphaBaculovirus, pero dada su alta especificidad es muy difícil utilizarlos para cultivar Gammabaculovirus (Lucarotti et al., 2012), por lo que es necesario el desarrollo de líneas celulares de diferentes géneros de moscas sierra destinadas a la obtención y propagación de un Gammabaculovirus que afecte a especies mexicanas de avispas dipriónidas y que sea útil para su control biológico. Estos Baculovirus comienzan la fase infectiva y su replicación en el intestino de las larvas, y acorde a los antecedentes bibliográficos es el único órgano susceptible de infectarse, por esa razón el cultivo celular tiene que derivarse de células intestinales epiteliales (Lucarotti et al., 2012).
El objetivo del presente trabajo es implementar una técnica de obtención de un cultivo celular de diferentes especies de moscas sierra a partir de larvas de los géneros de Neodiprion spp. y Monoctenus spp.; para lo cual se siguieron técnicas de cultivos celulares aplicadas en otros artrópodos (Cossio-Bayugar y Miranda-Miranda, 2007; Mosqueda et al., 2008), en lepidópteros y para Alfabaculovirus (Summers y Smith, 1987).
Materiales y Métodos
Obtención y manejo de las muestras
Las larvas de avispas dipriónidas fueron proporcionadas por el Laboratorio de Sanidad Forestal y Agrícola del Campo Experimental Pabellón en Aguascalientes (INIFAP-CIR Norte Centro-Cepab), recolectadas en bosques de pino y de cedro blanco en Hidalgo y Guerrero, respectivamente durante actividades del proyecto Conafor 2017 C02 Núm. 291304. Se recibieron lotes de aproximadamente 50 larvas, las correspondieron a dos géneros: Neodiprion sp. y Monoctenus sp. Se guardaron en botes de plástico a 4 °C hasta su uso.
Lavado y disección de las muestras
Se seleccionaron cinco larvas de cada género, que se lavaron con distintas soluciones desinfectantes, consistentes en una solución de Benzal al 100 %. Posteriormente, se colocaron en un tubo cónico de 15 mL con 5 mL de Benzal y se dejaron en agitación durante 10 min; después, se desechó el Benzal y se agregaron 5 mL de Etanol al 70 %, nuevamente se colocaron en agitación durante 10 min; por último, se realizó un lavado con agitación durante 30 min en 5 mL de ABAM (antibiótico-antimicótico Gibco®; concentración final Penicilina 100 U mL-1, estreptomicina U mL-1 y Fungizona (anfotericina B) 0.25 (g mL-1) (Cossio-Bayugar y Miranda-Miranda, 2007). Se disectaron los órganos con una navaja bisturí estéril, se realizaron dos cortes: uno en el abdomen posterior y el otro en el anterior, este corte provocó la exposición del intestino, el cual se tomó con unas pinzas en medio y se colocaron en microtubos de 1500 (L con ABAM. Para la identificación del intestino de las larvas, se realizó una comparación con fotografías de Neodiprion abietis (Lucarotti et al., 2011). Una vez identificado el tracto intestinal y órganos accesorios, se continuó con el protocolo para la obtención de líneas celulares que se describe a continuación.
Glándulas salivales y red intersticial celular
Estos órganos accesorios del intestino, se colocaron por separado en un tubo de Eppendorf de 1.5 mL y se realizó un lavado con 500 µL de ABAM, durante 10 min en agitación; enseguida, se decantó el ABAM 1X y se les agregó 500 µL de solución balanceada de Hank's (HBSS, ThermoFisher Scientific) 1X.; posteriormente, se centrifugaron a 2 000 rpm durante dos min; por último, se retiró la solución HBSS 1X y se añadieron 500 µL de un medio de cultivo preparado con partes iguales de medio mínimo esencial (MEM; ThermoFisher Scientific), medio Leibovitz L-15 (ThermoFisher Scientific), suplementado con 20 % de suero fetal de bovino (FBS; Gibco™, ThermoFisher Scientific), 10 % caldo soya tripticaseina (TSB; Sigma), una solución antibiótico antimicótico (ABAM, Gibco™,ThermoFisher Scientific; concentración final Penicilina 100 U mL-1, estreptomicina 100 U mL-1 y anphotericina B 0.25 ug mL-1) (Cossio-Bayugar y Miranda-Miranda, 2007).
Los órganos fueron suspendidos en el medio y se añadieron a placas de cultivo de 12 pozos (Corning), cada uno contenía 2.5 mL de MEM suplementado fresco, el volumen final del cultivo fue de 3 mL en cada pozo de una placa de 12 pozos; la placa se mantuvo a una temperatura de 28 °C y una atmosfera de 5 % de CO2 (Mosqueda et al., 2008; Cossio-Bayugar et al., 2011).
Intestino
Los intestinos obtenidos de la disección se colocaron en un tubo Eppendorf de 1.5 mL con 500 µL de ABAM 1X durante 10 min; terminado el tiempo de incubación se centrifugó a 2 000 rpm por dos min, para sedimentar los intestinos; se decantó el ABAM 1X y se les agregó 500 µL de HBSS para realizar un lavado, se repitió la centrifugación e igualmente se decantó el HBSS 1X; una vez que estuvieron limpios los intestinos, se adicionaron 500 µL de medio de cultivo y se procedió a realizar la disgregación mecánica con una punta de micropipeta de 1 000 (L, mediante una presión ligera de los intestinos. Finalmente, las células disgregadas se suspendieron en 2.5 mL de MEM suplementado que estaba en cajas de cultivo celular de 12 pozos, el volumen total de cultivo fue de 3mL por pozo; los cultivos se mantuvieron a 28 °C en una atmosfera de 5 % de CO2 (Mosqueda et al., 2008; Cossio-Bayugar et al., 2011; Lucarotti et al., 2011).
Los cultivos se verificaron diariamente en un microscopio invertido Zeiss Axiovert 40.
Resultados
Morfología de los intestinos de las larvas de moscas sierra
Se identificaron diferentes órganos de las moscas sierra de la zona torácica-abdominal, entre los que destacan: el intestino, las glándulas salivales y la red intersticial de células (Figura 1a).
Figura 1 a. Aspecto del intestino de una larva de Monoctenus sp., Intestino o canal alimentario de larva (I), intestino anterior (IA), intestino medio (IM), intestino posterior (IP), glándulas salivales (GS), red intersticial celular (RI), barra escala 2mm. b. Intestino de larva Monoctenus sp., intestino anterior (IA), intestino medio (IM) e intestino posterior (IP). Las flechas señalan la unión que delimita cada sección del intestino. En el intestino medio se diferencia el bolo alimenticio de la larva, barra escala 2 mm. c. Células epiteliales del intestino de larvas del género Neodiprion sp., son células de morfología cilíndrica con núcleo definido, barra escala 100 µm. d. Aglomerado de células epiteliales intestinales de larvas de Neodiprion sp., núcleo celular definido (flecha), barra escala 50 µm. e. Células epiteliales del intestino de larvas del género Monoctenus sp., son células de morfología cubica con núcleo definido, barra escala 100 µm. f. Aglomerado de células epiteliales del intestino de larvas del género Monoctenus sp., núcleo celular definido (flecha), barra escala 25 µm. g. Glándulas Salivales (GS) de larvas del género Monoctenus sp. barra escala 2 mm. h. Cultivo celular de glándulas salivales de Monoctenus sp., célula granulada (CG), ductos alargados (D). Las células rodean los ductos transparentes a lo largo de todas las glándulas celulares, barra escala 100 µm. i. Cultivo celular de red intersticial de Monoctenus sp., red intersticial formada por la unión de las células (RI), célula vacuolada granulada (CV), barra escala 100 µm. Imágenes tomadas al microscopio óptico usando objetivo 40X.
Intestinos
El intestino se caracteriza por ser un tubo seccionado en tres partes: intestino anterior, medio y posterior (Figura 1b); una sección se diferencia por el angostamiento del inicio de cada porción. La parte anterior del intestino se conecta a la cavidad bucal, seguida por el intestino medio que es la porción más ancha del intestino y donde se encuentra la mayor cantidad de bolo alimenticio, por lo que se le atribuye la función de digerir el alimento, y finalmente, la región posterior que es el ducto más delgado, en comparación con las otras secciones (Figura 1b).
Cultivo celular de intestino del género Neodiprion sp.
Las células epiteliales del intestino tienen características muy distintivas y comunes a la estructura celular del epitelio intestinal de los artrópodos; poseen un núcleo definido y tienen una morfología cúbica, plana o cilíndrica (Lucarotti et al., 2011). Los cultivos celulares obtenidos demostraron tener esas características (Figuras 1c y 1d); las células se revisaron cada tercer día y se observó que no había proliferación ni crecimiento celular. El tiempo aproximado de duración para este cultivo fue de un mes; debido a que no se registró una proliferación o crecimiento se consideró como un cultivo primario de intestino de la larva. El cultivo mostró una buena adaptación al medio MEM y a las condiciones de cultivo establecidas. La formación de aglomerados (Figura 1d) de las células y los residuos celulares del cultivo se deben al tipo de disgregación aplicada.
Cultivo celular de intestino del género Monoctenus sp.
Los cultivos mostraron las mismas características morfológicas que las células epiteliales; sin embargo, en comparación con las células de Neodiprion sp. son más pequeñas y alargadas (Figura 1f). También, destacaron las aglomeraciones de pequeños grupos de células que no se disgregaron correctamente, el tiempo de cultivo celular se aproximó a un mes.
Glándulas salivales
Las glándulas salivales (Figura 1g) se observaron en una gran proporción, flanqueando el canal alimentario de la larva; son un par de ductos transparentes alargados que están rodeados por un gran número de células granuladas.
Cultivo celular de glándulas salivales de Neodiprion sp.
Es un órgano resistente a la manipulación y mostró tener una excelente tolerancia al medio de cultivo, se consideró como un cultivo primario ya que no presentó proliferación celular; la duración del cultivo fue mayor a los 3 meses y las células no presentaron adhesión a las placas de cultivo; y debido a su longevidad in vitro se consideran ideales para ensayos de infección (Figura 1h).
Red intersticial de células
Está formada por un conjunto de células granuladas unidas, rodea al intestino y a las glándulas salivales, su función podría ser fundamental en el cambio de muda de la larva (Figura 1a).
Cultivo celular de red intersticial de Neodiprion sp.
El cultivo celular se mantuvo alrededor de 1 mes con medio de cultivo, no hubo adhesión celular a la placa de cultivo y las células no evidenciaron ningún tipo de proliferación, ni crecimiento debido a que es un cultivo primario (Figura 1i).
Discusión
Las moscas sierra son himenópteros de la familia Diprionidae que ocasionan defoliaciones de hasta sesenta mil ha al año (González y Sánchez, 2018). Es por esta razón que se buscan métodos de control biológico eficientes y seguros que no provoquen daño al ambiente, o a especies endémicas no objeto de control. El uso de Baculovirus es eficiente para tratar este tipo de plagas; al respecto, hay numerosos ejemplos sobre la producción comercial de Alfa Baculovirus destinados al control de plagas agrícolas (Grzywcz et al., 2014; Grzywacz y Moore 2017), pero solo algunos ejemplos en la producción de suspensiones virales para el control de moscas sierra; un ejemplo es el uso del Gammabaculovirus NeabNPV que fue purificado y secuenciado por investigadores canadienses, cuyo uso aumentó la mortalidad de Neodiprion abietis y redujo los niveles de afectación a nivel endémico (Moreau et al., 2005).
Durante el presente estudio se establecieron varias líneas celulares de moscas sierra a partir de los intestinos y órganos accesorios intestinales que se consideran como una herramienta esencial para la obtención, caracterización y propagación de un Gammabaculovirus utili en el control biológico y en estudios de metabolismo celular de estas plagas forestales en México.
La producción de un cultivo celular puede tardar meses e incluso años; actualmente, no existe ningún registro de una línea celular de las moscas sierra de la familia Diprionidae en México. Los resultados obtenidos reflejan un gran avance para el establecimiento de una línea celular de epitelio intestinal. Este tipo de células es el único que puede incubar un virus para su replicación y propagación (Lucarotti et al., 2012), por lo que es importante tener un método para su cultivo y definir las condiciones adecuadas para la incubación de las células.
Existen diferencias celulares entre los distintos géneros de moscas (Neodiprion y Monoctenus), especialmente en la forma y el tamaño. Las células de Monoctenus son más pequeñas y de forma cúbica; mientras que, las células del género Neodiprion son cilíndricas y de mayor tamaño, ambos cultivos celulares presentaron una duración de aproximadamente un mes, las condiciones establecidas fueron adecuadas para su mantenimiento, y aunque no hubo proliferación o crecimiento celular son buenos candidatos para la infección con el Baculovirus, debido a que los virus pueden multiplicarse en los núcleos celulares de las células epiteliales intestinales; lo anterior se observó de manera notable, ya que un núcleo definido abarcaba gran parte de la célula.
Las aglomeraciones de células formadas en los cultivos podrían deberse a la deficiencia en la disgregación mecánica; por lo que no se descarta el uso de un método químico para la separación de las células, mediante el uso de enzimas como la colagenasa, tripsina, elastasa, papaína o pronasa (Beltrán y Gonzáles, 2016). Este tipo de enzimas ayudarían con la correcta disgregación de los tejidos y se utilizarían junto con la disgregación mecánica. Debido al tipo de disgregación empleada el cultivo mostró una gran cantidad de sedimentos celulares, por lo que se considera que podría implementarse el uso de un filtro que ayuda en la separación de las células con los sedimentos celulares, ya que con ello se obtendría un cultivo más limpio, sin sedimentos en el fondo de la placa de cultivo.
Los lavados después de la disección de los órganos es un paso importante para evitar alguna contaminación en el cultivo; aunque estos se realizaron de manera estricta y siempre en condiciones estériles, los cultivos de intestino presentaron contaminación por levaduras no identificadas, es importante resaltar que el antimicótico estaba al doble de concentración en el medio utilizado. La contaminación de los cultivos del intestino podría atribuirse a la flora intestinal de la larva; lo cual se evitaría con la separación por filtración de las células, con ello se impediría que los organismos responsables de la contaminación se cultiven junto con las células epiteliales intestinales. El medio utilizado se emplea para cultivo de artrópodos (Cossio-Bayugar y Miranda-Miranda, 2007).
A pesar de que no se presentan resultados sobre el funcionamiento de los cultivos obtenidos de glándulas salivales y de la red intersticial celular, no se descarta que pudiesen utilizarse en investigaciones posteriores para entender cuestiones biológicas de las larvas de la familia Diprionidae. Estos cultivos son más fáciles de manejar que los de intestino, ya que tienen menor probabilidad de contaminación. Sin embargo, en comparación con la fijación estos tejidos permanecen flotando en el medio; por ello, se propone reducir el volumen del medio de cultivo MEM, o bien disminuir el área de la placa de cultivo.
Conclusiones
El establecimiento de un cultivo celular de células epiteliales intestinales es posible siguiendo el protocolo descrito en este trabajo. Cada género de larva podría tener células con diferencias morfológicas, por lo que se propone el estudio de los tres géneros de mosca cierra registrados para la república mexicana (Monoctenus, Neodiprion y Zadiprion). Las condiciones de incubación de las células son adecuadas para el mantenimiento de los cultivos: 28 °C de temperatura y atmosfera de 5 % de CO2. El medio de cultivo MEM- Leibovitz L-15 (1:1) suplementado al 20 % con SFB y 10 % caldo soya tripiticaseina es adecuado para el mantenimiento y nutrición de las células; el cambio o agregación de las células se requiere para prolongar la vida de los cultivos celulares. Los cultivos primarios establecidos son candidatos para la identificación, caracterización, proliferación y mantenimientos de un Gammabaculovirus debido a las características morfológicas de las células.
