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Introducción
El alimento comercial seco (ACS) para perro es una ración integral completamente mezclada y troquelada mediante calor y presión en forma de croqueta; está compuesto por diversos productos y subproductos agroindustriales de origen agrícola y pecuario, por lo que son importantes como una salida frecuente de las cadenas de suministro agroindustrial1. En México se ha popularizado el uso de ACS para lograr la integración de los perros al estilo de vida urbano; también, diversas marcas de ACS han proliferado para satisfacer la variedad de necesidades nutricionales de estas mascotas, según su actividad, raza, edad y algunas condiciones especiales2. En México, el Consejo Nacional de Fabricantes de Alimentos Balanceados y de la Nutrición Animal registra 22 fábricas que elaboran anualmente 1.3 miles de toneladas de ACS3) lo cual se ve complementado con una oferta abundante de marcas internacionales4.
En la fabricación del ACS se incorporan productos y subproductos agroindustriales de diversa composición bromatológica para cumplir su diseño nutricional5. La calidad nutrimental y sanitaria de estos ingredientes se traslada a la formulación final, por lo que se ha señalado que el ACS presenta riesgos de contaminación por diversos agentes patógenos como los hongos micotoxigénicos6-8. La contaminación fúngica ocurre en varias etapas de la producción de los ingredientes vegetales, como la floración, cosecha, procesamiento o almacenamiento de cereales; además de la permanencia de los residuos metabólicos de las micotoxinas en la carne, los productos lácteos y huevos9-11.
Los géneros fúngicos toxigénicos encontrados en los ingredientes para formular de ACS son Aspergillus spp., Penicillium spp. y Fusarium spp.12-14. Así mismo, las micotoxinas frecuentes encontradas en los ingredientes alimenticios son las aflatoxinas (AFs)12-13. La presencia de AFs representa un factor de riesgo para la salud de los animales y pérdidas económicas para la agroindustria, porque reduce el valor nutricional del producto alimenticio15.
La intoxicación de los perros por AFs ocasiona alteraciones hemodinámicas, digestivas y nerviosas, así como cambios en la bioquímica y capacidad de coagulación de la sangre; los cuales son especialmente sensibles a las AFs porque tienen una actividad reducida de la enzima glutatión S transferasa (GST), primordial para la ruta de detoxificación de xenobióticos16. Aunque no existen límites máximos permisibles (LMP) específicos para AFs en el ACS para perro4, los LMP establecidos para los alimentos destinados a otros animales domésticos se han sugerido emplear17, especialmente los lineamientos señalados por el Codex Alimentarius o por la Comunidad Europea (20.0 ó 5.0 µg/kg, respectivamente)17,18.
Los informes de brotes de formas clínicas por intoxicación de AFs en perros son escasos, pero su distribución geográfica es muy diversa: América del Norte, América Latina, Asia y África19-21. Esto coincide con una distribución mundial de los hongos toxigénicos tanto en el ACS como en los ingredientes con que se elaboran22,23. Además, la forma de expender el ACS en bolsas o sacos usualmente grandes permite potenciar la concentración de AFs, debido a que el perro debe ingerir todo el contenido que se encuentra en cada bolsa, pero las esporas y toxinas fúngicas son resistentes al proceso de fabricación2. En síntesis, la presencia de hongos toxigénicos y sus toxinas puede considerarse un grave problema para que el perro pueda desarrollar adecuadamente su función zootécnica como animal de compañía, guardián o deportivo. Además, la agroindustria nacional e internacional deben de llevar a cabo mejores estrategias para la disminuir la contaminación fúngica y sus micotoxinas en los ACS. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la presencia de microbiota fúngica y la contaminación por AFs en el ACS para perro.
Material y métodos
Diseño del estudio
El estudio se realizó en Aguascalientes, México (22°27'35- 21°37'20" N; 101°50'07" - 102°52'27" O). El clima es semiseco con temperatura media anual de 18 °C; con una precipitación pluvial media de 526 mm y el periodo principal de lluvias en verano24. Se obtuvo una relación de centros comerciales, tiendas de mascotas, veterinarias y tiendas de abarrotes que registraban el expendio de ACS y una visita se realizó para obtener información de las marcas y tipos en los establecimientos. Un total de 145 tipos de ACS (Cuadro 1) se encontraron, los que fueron considerados como un marco de muestreo. El tamaño de la muestra se calculó en 58 tipos de ACS mediante la fórmula siguiente para estimar proporciones en una población finita25:
Donde: n = tamaño de muestra (58); N= tamaño de la población (145 tipos de ACS); Z = valor distribución normal estándar (1.96); p = prevalencia o proporción esperada de la contaminación con Aspergillus spp. o con AFs en el ACS, se utilizó un valor de proporción P= 0.5, q= 1-p; d= precisión deseada (máximo error= 0.10).
Cuadro 1 Características del alimento comercial seco para perro comercializados en el centro de México
| Tipo de alimento | Oferta | Muestreo | Proteína | Humedad | Fibra | Precio | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (N) | (n) | (n/N%) | (mín. %) | (máx. %) | (máx. %) | *US$/kg±(EE) | |
| Origen | |||||||
| Nacional | 120 | 64 | 53.3 | 24.0 | 11.0 | 4.0 | 3.9b ±0.24 |
| Internacional | 25 | 13 | 52.0 | 26.0 | 11.0 | 4.0 | 5.9a ± 0.92 |
| Clasificación comercial | |||||||
| Estándar | 87 | 52 | 59.8 | 22.0 | 12.0 | 5.0 | 2.6b ± 0.17 |
| Premium | 58 | 25 | 43.1 | 27.0 | 11.0 | 4.0 | 7.7a ± 0.37 |
| Prescripción (Edad) | |||||||
| Cachorro | 55 | 27 | 49.1 | 27.0 | 11.0 | 4.0 | 5.1a ± 0.45 |
| Adulto | 90 | 50 | 55.6 | 22.0 | 11.0 | 4.0 | 3.7b ± 0.30 |
| Prescripción (Talla) | |||||||
| General | 72 | 43 | 59.7 | 22.0 | 12.0 | 5.0 | 2.2a ± 0.10 |
| Específica | 73 | 34 | 46.6 | 26.0 | 11.0 | 4.0 | 6.8a ± 0.39 |
| Total | 145 | 77 | 53.1 | ||||
*Precio en dólares americanos de referencia (www.banxico.org.mx: enero 2020).
ab Medias con diferente literal muestran diferencias significativas (P<0.05).
La selección de las muestras se realizó mediante la técnica de muestreo bola de nieve26; para lo cual se visitaron sucesivamente los establecimientos en orden alfabético y muestras expendidas de ACS se adquirieron. La adquisición del ACS se suspendió cuando en tres comercios sucesivos se encontraron los mismos tipos que habían sido adquiridos previamente. Finalmente, 77 tipos diferentes de ACS fueron adquiridos (Cuadro 1).
El tipo de ACS se clasificó de acuerdo con la prescripción (edad y talla) e identificación comercial (estándar y premium) declarada por el fabricante. La composición de los ACS fue registrada a partir de la información nutricional informada por el fabricante para identificar los ingredientes empleados. Se clasificaron los ACS por la presencia o ausencia de cereales, oleaginosas, aceite vegetal, leguminosas, tubérculos, subproductos de origen animal, fungicidas e ingredientes con capacidad secuestrante y tipo de ACS.
Manejo de las muestras
Las muestras se secaron en una estufa con circulación forzada de aire y se pulverizaron (500-800 μm) en un molino universal de funcionamiento continuo y fueron almacenadas dentro de bolsas selladas en refrigeración (4-5 °C) hasta su procesamiento (<2 semanas).
El aislamiento fúngico se realizó mediante la técnica de siembra directa en placa con dilución en serie para el recuento de colonias fúngicas en el ACS. Las muestras se diluyeron (10-1, 10-2, 10-3 y 10-4) y las siembras se realizaron en agar rosa de bengala + cloranfenicol y Czapeck. El periodo de incubación en la oscuridad fue entre 27-30 °C durante siete días27. Preparaciones de las colonias fúngicas se hicieron con tinción azul de algodón usando lactofenol para la observación de las características microscópicas28. La identificación de los aislamientos se hizo con las características morfológicas macroscópicas y microscópicas29,30.
Análisis molecular
El ADN genómico se extrajo de aislamientos monospóricos congruentes con la morfología de A. flavus mediante métodos estandarizados previamente31. La técnica de electroforesis en gel de agarosa (1%) se usó para verificar la calidad del ADN obtenido. Las muestras de ADN se depositaron en el gel con buffer de carga (Platinum II Green PCR Buffer 5X Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) para colocarlas en la cámara electroforética con buffer de carga (TAE 1X, 95 voltios, 40 min). Las bandas resultantes se observaron en un foto documentador de imágenes (GEL DOC XR, BIO-RAD Molecular Imagen CA, EE.UU.) con el software Quantity One (versión 4.6.7.).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para amplificar los fragmentos de ADN genómico en la región de los espaciadores internos de la transcripción (ITS1-5.8S-ITS2- RNAr), el gen de la calmodulina (CaM) y el gen iniciador de la vía biosintética de la aflatoxina (aflR) siguiendo los protocolos descritos previamente32,33. Los siguientes iniciadores se emplearon para ITS1: 5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´; ITS4: 5´-TCCTCCGCTTATTGATATG -3´; CMDA7-F: 5´-GCCAAAATCTTCATCCGTAG-3´; CMDA8-R: 5´-ATTTCGTTCAGAATGCCAGG-3´; aflR-F: 5´-GGGATAGCTGTACGAGTTGTGCCAG-3´; aflR-R: 5´-TGGKGCCGACTCGAGGAAYGGGT-3´ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
La enzima Taq-polimerasa (Platinum Green Hot Start PCR 2X Máster Mix, Thermo Fisher Scientific) se utilizó para la amplificación y las reacciones de amplificación se realizaron en un termociclador (Labnet, Multigene, EE.UU.). El protocolo de amplificación se introdujo para la región ITS1-5.8S-ITS2 RNAr utilizando un periodo de desnaturalización de 3 min a 94 °C, seguido de 35 ciclos (desnaturalización a 94 °C/1 min, alineación a 54 °C/1 min y extensión a 72 °C/1min) y con una extensión final de 9 min a 72 °C. Las condiciones para la amplificación del gen de CaM fueron con un periodo de desnaturalización un ciclo de 1min/94 °C seguido de 30 ciclos (1min/94 °C, para el alineamiento 1 min/53 °C y para la extensión 1min/72 °C) y se agregó un período de extensión final de 10 min a 72 °C. Así mismo para la amplificación del gen aflR se utilizó un periodo de pre-desnaturalización de 1 min a 94 °C seguido de 35 ciclos (desnaturalización a 94 °C/1 min, alineamiento 63 °C/1 min y extensión 72 °C/1 min) y con una extensión final de extensión final 10 min a 72 °C. La calidad de los productos de PCR (ITS, CaM y aflR) se verificó mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa al 1 %. En el primer carril del gel se incluyó una escalera con marcador de peso molecular (1.0 μl, escalera de ADN de 100 pb, 0.5 µg/μl. No. 15628019/15628050. Invitrogen ADN Ladder) junto con 1.0 µl del buffer (BlueJuice Gel Loading Buffer 10X). El tamaño en pares de bases (pb) del amplicon para la identificación molecular fue: ITS, 600-800; Calm, 468 y aflR, 796. Las bandas se visualizaron en el foto documentador de imágenes con el software Quantity One (versión 4.6.7.). Los productos de PCR se purificaron con el reactivo de limpieza ExoSAP-IT PCR Product Cleanup (Afflymetrix, Thermo Fisher Scientific Inc. Santa Clara, California, EUA).
Cuantificación de micotoxinas
La cuantificación de la concentración de AFs se realizó por duplicado de acuerdo con el método oficial AOAC 990.3334. El contenido de las AFs se extrajo utilizando tubos de fase sólida (SPE; SupelcleanTM LC-18 SPE tube, Sigma-Aldrich, USA), metanol:agua, ácido acético, tetrahidrofurano (THF) y hexano. Los extractos derivatizados con ácido trifluoroacético fueron inyectados en un sistema de HPLC con detector de fluorescencia (Varian Pro Star binary pump; FP detector 2020, Varian Associates Inc., Victoria, Australia), columna C18 y protector de columna (LC- 18 and LC-18; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Las estimaciones de AFs se obtuvieron con ayuda de un software (Galaxie Ver. 1.9.302.530) y las concentraciones se calcularon utilizando curvas estándar de AFs purificadas (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA).
En el ACS también se cuantificaron las micotoxinas siguientes: zearalenona (ZEA), ocratoxina (OTA), fumonisinas (FUM) y deoxinivalenol (DON) mediante análisis de ELISA indirecta4 (Ridascreen Fast: Zearalenon R5502, Fumonisin R5602, Ochratoxin A R5402, Deoxynivalenol R5902, R-Biopharm, Alemania).
Análisis estadístico
Los datos se analizaron aplicando una prueba de normalidad con el método de Kolmogórov-Smirnov a un nivel de confianza del 95%. La comparación de las medias muestrales para cada variable se realizó mediante la prueba de Tukey (HSD) con un software estadístico (Statgraphics Centurion, versión 16.1.03). Para identificar el riesgo de superar el LMP establecido para la concentración de AFs se realizó la prueba de Ji-cuadrada (χ2) de la razón de probabilidades o razón de momios (RM), calculando la porción de ACS que excedió el LMP para la concentración de AFs y que estuvo expuesta a un factor específico (formulación con la inclusión de cereales, oleaginosas, aceite vegetal, leguminosas, tubérculos, subproductos de origen animal, fungicidas e ingredientes con capacidad secuestrante y tipo de ACS) dividida entre la porción de ACS que excedió el LMP para la concentración de AFs pero que no estuvo expuesto a ese factor específico. En todos los análisis se consideró un nivel de probabilidad de P<0.05.
Resultados
La mayoría de los ACS adquiridos (82.8 %) fueron elaborados por fabricantes nacionales, mientras que el 17.2 % fueron ACS elaborados por marcas comerciales internacionales (Cuadro 1). Más de la mitad de las muestras de ACS (41/77 = 53.2 %) presentó contaminación fúngica, mientras que el 7.8 % (6/77) contenían una concentración de hongos superior a los niveles máximos recomendados (106 UFC/g). Un total de 85 aislamientos fúngicos purificados se obtuvieron, los cuales mostraron características morfológicas correspondientes con los principales géneros toxigénicos siguientes (Figura 1): Aspergillus spp. (69.4 %), Fusarium spp. (1.1 %) y Penicillium spp. (12.9 %). También se identificaron aislados con morfología correspondiente a los géneros Cladosporium spp., Mucor spp. y Alternaria spp (9.4, 4.7 y 1.7 %, respectivamente). De los aislados Aspergillus spp., el 40.7 % (24/59) correspondieron a la morfología de A. flavus30; en el 75.0 % (18/24) de los aislamientos de A. flavus demostró in vitro la capacidad de producción de aflatoxinas (9.8 ± 0.64 µg/kg en 7 días) y también expresaron los genes CaM y aflR y la región ITS (Figura 2) mediante el análisis de PCR.
Figura 1 Estructura morfológica macroscópica y microscópica (40x) de los aislados monospóricos. Páneles: A) Aspergillus spp., B) Fusarium spp., C) Penicillium spp., D) Aspergillus spp., E) Fusarium spp. y F) Penicillium spp.
Panel A: amplificación de la región de espaciadores internos de la transcripción (ITS). Panel B: amplificación de Calmodulina (Calm). Panel C amplificación del gen iniciador de la vía biosintética de la aflatoxina (aflR). Primer carril: marcador de peso molecular 100-2000 pares de bases; C1-C18: aislados de Aspergillus flavus.
Figura 2 Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR
Todas las muestras de ACS presentaron concentraciones detectables de AFs (Figura 3). La frecuencia de la concentración de AFs presentó una aproximación normal (P=0.14); la concentración mínima fue de 8.6 µg/kg y concentración máxima de 22.2 µg/kg; una concentración media de 14.8 ± 0.3 µg/kg se estimó, con intervalo de confianza al 95.0% de 14.2-15.4 µg/kg. También se detectó que aproximadamente uno de cada diez (11.8 %) de los ACS analizados sobrepasó el LMP de AFs recomendado por la mayoría de las legislaciones de países de América para el uso de cereales (20.0 µg/kg)35, mientras que todos los ACS rebasaron las recomendaciones europeas (5.0 µg/kg)18. Las concentraciones de OTA, FUM y DON estuvieron por debajo de los límites de detección; mientras que las concentraciones estimadas de ZEA (228 ± 13.8 µg/kg) en ningún caso sobrepasaron el LMP (400 μg/kg) que se sugiere para regular esta micotoxina35.
LMP= límite máximo permisible: América (20 µg/kg); Unión Europea (5.0 µg/kg).
Figura 3 Frecuencia de la concentración de aflatoxinas (AFs) en alimento comercial seco para perro en el centro de México
En este estudio no se observó diferencia significativa (P>0.05) entre la concentración de AFs y las características generales del ACS, como el origen, la clasificación comercial (estándar o premium) ni la prescripción por edad o talla del perro; tampoco se detectó alguna asociación estadística que permitiera identificar estas características como factores de riesgo que generen concentraciones por arriba del LMP (Cuadro 2).
Cuadro 2 Asociación entre las características del alimento comercial seco para perro y la concentración de aflatoxinas
| Tipo de alimento | (n) | Media | ±EE | >LMP | Valor P | RM |
|---|---|---|---|---|---|---|
| (µg/kg) | % | (χ2) | ||||
| Origen | ||||||
| Nacional | 64 | 15.0a | ±0.32 | 12.5 | 0.49 | 1.71 |
| Internacional | 13 | 13.9a | ±0.61 | 7.7 | ||
| Clasificación comercial | ||||||
| Estándar | 52 | 15.1a | ±0.34 | 11.5 | 0.93 | 0.95 |
| Premium | 25 | 14.2a | ±0.50 | 12.0 | ||
| Prescripción (edad) | ||||||
| Cachorro | 27 | 15.0a | ±0.48 | 18.5 | 0.05 | 2.6 |
| Adulto | 50 | 14.7a | ±0.35 | 8.2 | ||
| Prescripción (talla) | ||||||
| General | 43 | 15.3a | ±0.38 | 14.0 | 0.32 | 1.7 |
| Específica | 34 | 14.2a | ±0.42 | 8.8 | ||
EE= error estándar; LMP= límite máximo permisible (20 µg/kg); P(χ2)= Ji cuadrada; RM= razón de momios.
ab Medias con diferente literal muestran diferencias significativas (P<0.05).
La concentración promedio de AFs en los ACS presentó diferencias significativas asociadas con características del ACS y con los ingredientes empleados. El ACS con humedad mayor a 10 % mostró una concentración estimada de AFs significativamente mayor (P<0.05) en comparación a la en los ACS que contenían humedad menor. También se detectó un riesgo significativo (RM χ2 P<0.05) tres veces mayor de encontrar concentraciones por arriba del LMP en aquellos ACS que registraron humedad mayor a 10 % (Cuadro 3) en relación con los ACS que tenían humedad menor 10 %. Aunque se detectó un mayor riesgo también para los ACS que en su formulación contenían una mayor concentración de proteína, grasa y cenizas (>22, >12 y >7 %, respectivamente), la asociación estadística no fue significativa (P>0.05).
Cuadro 3: Asociación entre el análisis bromatológico del alimento comercial seco para perro y la concentración de aflatoxinas
| Característica | (n) | Media | ±EE | >LMP | Valor P | RM |
|---|---|---|---|---|---|---|
| (µg/kg) | (%) | (χ2) | ||||
| Humedad relativa | ||||||
| >10% | 31 | 17.4a | ± 0.36 | 19.4 | 0.01 | 3.4 |
| ≤10% | 46 | 13.0b | ± 0.29 | 6.5 | ||
| Proteína | ||||||
| >22% | 47 | 14.9a | ± 0.36 | 14.9 | 0.12 | 2.5 |
| ≤22% | 30 | 14.7a | ± 0.46 | 6.7 | ||
| Grasa | ||||||
| >12% | 22 | 14.9a | ± 0.53 | 18.2 | 0.11 | 2.2 |
| ≤12% | 55 | 14.8a | ± 0.34 | 9.1 | ||
| ELN | ||||||
| Presente | 47 | 14.4a | ± 0.52 | 12.8 | 0.78 | 1.1 |
| Ausente | 107 | 15.0a | ± 0.34 | 11.2 | ||
| Fibra | ||||||
| >4% | 30 | 15.2a | ± 0.46 | 13.3 | 0.61 | 1.3 |
| ≤4% | 47 | 14.5a | ± 0.36 | 10.6 | ||
| Ceniza | ||||||
| >7% | 38 | 15.5a | ± 0.40 | 15.8 | 0.11 | 2.3 |
| ≤7% | 39 | 15.1a | ± 0.39 | 7.7 | ||
EE= error estándar; LMP= límite máximo permisible (20 µg/kg); P(χ2)= Ji cuadrada; RM= razón de momios; ELN= extracto libre de nitrógeno.
ab Medias con diferente literal muestran diferencias significativas (P<0.05).
La concentración promedio de AFs en los ACS que contenían trigo fue significativamente mayor (P<0.05) en comparación a la concentración estimada de AFs en los ACS que no utilizaron este ingrediente (Cuadro 4). Sin embargo, al calcular el riesgo de exceder el LMP no hubo una asociación significativa (P>0.05) entre la proporción de los ACS que contenían trigo y los que no lo incluyeron en su formulación. No se observó diferencia significativa (P>0.05) entre las medias de concentración de AFs en presencia o ausencia de algún subproducto de origen animal en los ACS. Sin embargo, si se detectó una asociación significativa (P<0.05, χ2) en la proporción de ACS que excedieron el LMP entre los ACS que presentaron en su formulación harina y aceite de pescado, en comparación con los que no los incluyeron; por lo cual el riesgo (RM) de encontrar concentraciones por arriba del LMP fue más tres veces que en los ACS que registraron ausencia de los ingredientes. La totalidad de las muestras adquiridas emplearon harina de carne y hueso en la formulación del ACS, por lo que no se pudo establecer ninguna asociación con estos ingredientes.
Cuadro 4 Asociación entre la concentración de aflatoxinas y la inclusión de alimentos y subproductos agroindustriales en alimento comercial seco para perro
| Ingrediente | (n) | Media | ± EE | >LMP | Valor P | RM |
|---|---|---|---|---|---|---|
| (µg/kg) | (%) | (χ2) | ||||
| Trigo | ||||||
| Presente | 47 | 15.5a | ± 0.35 | 12.8 | 0.60 | 1.3 |
| Ausente | 30 | 13.8b | ± 0.44 | 10.0 | ||
| Cebada | ||||||
| Presente | 22 | 15.5a | ± 0.53 | 18.2 | 0.11 | 2.2 |
| Ausente | 55 | 14.5a | ± 0.33 | 9.1 | ||
| Maíz | ||||||
| Presente | 55 | 15.0a | ± 0.34 | 9.1 | 0.11 | 0.45 |
| Ausente | 22 | 14.3a | ± 0.53 | 18.2 | ||
| Arroz | ||||||
| Presente | 38 | 15.2a | ± 0.40 | 13.2 | 0.57 | 1.4 |
| Ausente | 39 | 14.4a | ± 0.40 | 10.3 | ||
| Oleaginosas | ||||||
| Presente | 27 | 15.1a | ±0.48 | 14.8 | 0.37 | 1.6 |
| Ausente | 50 | 14.6a | ±0.35 | 10.0 | ||
| Aceite vegetal | ||||||
| Presente | 38 | 14.8a | ±0.41 | 13.2 | 0.57 | 1.3 |
| Ausente | 39 | 14.8a | ±0.40 | 10.3 | ||
| Leguminosas | ||||||
| Presente | 49 | 14.8a | ±0.36 | 12.2 | 0.77 | 1.1 |
| Ausente | 28 | 14.8a | ±0.47 | 10.7 | ||
| Tubérculos | ||||||
| Presente | 45 | 14.9a | ±0.37 | 13.3 | 0.45 | 1.5 |
| Ausente | 32 | 14.7a | ±0.44 | 9.4 | ||
| Huevo y leche | ||||||
| Presente | 27 | 15.1a | ±0.48 | 18.5 | 0.05 | 2.6 |
| Ausente | 50 | 14.7a | ±0.35 | 8.0 | ||
| Harina y aceite de pescado | ||||||
| Presente | 31 | 15.3a | ±0.45 | 19.4 | 0.01 | 3.4 |
| Ausente | 46 | 14.5a | ±0.37 | 6.5 | ||
EE= error estándar; LMP= límite máximo permisible (20 µg/kg); P(χ2)= JI cuadrada; RM= razón de momios.
ab Medias con diferente literal muestran diferencias significativas (P<0.05).
Los ACS que contenían fungicidas o agentes secuestrantes minerales de micotoxinas mostraron concentración media de AFs significativamente menor (P<0.05) en comparación a la concentración estimada de AFs en los ACS donde no fueron incluidos estos aditivos (Cuadro 5). Además, se detectó una asociación protectora significativa (P<0.05, χ2) al comparar la proporción de ACS que excedieron el LMP pero que no incluyeron estos componentes y aquellos que sí los agregaron a su formulación, por lo cual el riesgo (RM) de presentar concentraciones por arriba del LMP fue menor que en los ACS que incluyeron fungicidas o agentes secuestrantes.
Cuadro 5 Asociación entre la inclusión de fungicidas y agentes secuestrantes con la concentración de aflatoxinas en el alimento comercial seco para perro
| Ingrediente | (n) | Media | ± EE | >LMP | Valor de P | RM |
|---|---|---|---|---|---|---|
| (µg/kg) | (%) | (χ2) | ||||
| Fungicidas | ||||||
| Presente | 46 | 13.5a | ± 0.33 | 6.5 | 0.01 | 0.29 |
| Ausente | 31 | 16.7b | ± 0.40 | 19.4 | ||
| Adsorbentes orgánicos | ||||||
| Presente | 43 | 14.7a | ± 0.38 | 9.3 | 0.30 | 0.59 |
| Ausente | 34 | 14.9a | ± 0.43 | 14.7 | ||
| Secuestrantes minerales | ||||||
| Presente | 43 | 13.9a | ± 0.36 | 7.0 | 0.04 | 0.35 |
| Ausente | 34 | 15.9b | ± 0.41 | 17.7 | ||
EE= error estándar; LMP= límite máximo permisible; P(χ2)= Ji cuadrada; RM= razón de momios.
ab Medias con diferente literal muestran diferencias significativas (P<0.05).
Discusión
El alimento comercial seco o croqueta ha representado un importante mercado para diversas industrias que elaboran alimento para perro incorporado al estilo de vida urbano3. Al igual que en otros productos de origen agrícola y animal, la contaminación por microbiota fúngica y por micotoxinas es prácticamente inevitable11. En el presente estudio se detectó la contaminación por Aspergillus flavus toxigénico en un tercio (18/77 = 31.2 %) de una muestra aleatoria de ACS, así como una concentración detectable de aflatoxinas en la totalidad de las muestras; además, el 11.8 % de los ACS rebasaron el límite máximo permisible de AFs (20.0 µg/kg) sugerido por la normatividad35. Este hallazgo no ha sido reportado previamente en México y la contaminación por AFs pone en riesgo la salud de los perros y el desarrollo adecuado de su función zootécnica (compañía, guardia, trabajo, etc.) por el que son criados36. Así mismo, afecta económicamente a las ramas agroindustriales que proveen los ingredientes, al alterar la inocuidad del producto y deteriorar su valor económico y nutricional15.
En este estudio se encontró que los ACS presentaron concentraciones bajas a moderadas de otras micotoxinas. Los niveles de OTA, FUM y DON se estimaron por debajo de los límites de detección. La concentración de ZEA alcanzó concentraciones cercanas a la mitad (57.0 %) del nivel máximo permisible empleado en los países europeos que regulan esta micotoxina (400 µg/kg)35; sin embargo, este hallazgo de ausencia de concentraciones importantes de micotoxinas diferentes a las AFs no garantiza que dichos contaminantes no pudieran estar presentes en otras circunstancias, porque las micotoxinas son contaminantes usuales en los cereales que se emplean como ingredientes comunes en la fabricación de alimento para perros37; lo anterior sugiere que la fabricación de ACS debe tener un manejo adecuado debido a la gravedad de la contaminación por micotoxinas38.
Aunque la información sobre la presencia de A. flavus y AFs en diversos ingredientes de la alimentación humana es extensa, los estudios de contaminación en el ACS son escasos, a pesar de estar formulados con ingredientes similares2. En este estudio, Aspergillus spp., fue el género detectado con mayor frecuencia (69.4 %) en el ACS, lo cual concuerda con diversos autores12,14,39 que identificaron en otros países los mismos géneros fúngicos contaminantes del ACS para perro. En el presente estudio se encontró microbiota fúngica en el 53.2 % de las muestras y el 7.8 % rebasó la concentración máxima de hongos (106 UFC/g), sugerida como máxima permisible40. La confirmación de la identidad de los aislamientos con morfología de A. flavus se logró mediante la amplificación de los genes y regiones génicas (ITS, CaM y aflR) lo cual se ha propuesto como un código de barras predeterminado para la identificación de estos hongos con la capacidad de producción de AFs41,42. Estos hallazgos sugieren que la persistencia de formas activas de los hongos con capacidad toxigénica significa un riesgo adicional, ya que si los procesos usuales de elaboración de la croqueta no son capaces de destruir la microbiota fúngica, cuando cambian las condiciones ambientales (actividad del agua y temperatura) por apertura de los sacos donde se almacena el producto terminado, las esporas y esclerocios del A. flavus pueden originar formas vegetativas nuevas con capacidad de utilizar los sustratos alimenticios, producir aflatoxinas e incrementar la concentración preexistente en el ACS43. Además, la cantidad usual de ACS contenido en el saco es suficiente para una duración de varios días o semanas en las que el perro tiene que consumir todo el material, independientemente de su calidad e inocuidad44.
En este estudio se encontró una asociación significativa entre algunas características del ACS y la concentración detectada de AFs, lo cual fue reforzado con la estimación del incremento en el riesgo de sobrepasar el LPM. Especialmente la humedad relativa superior al 10% mostró tres veces más el riesgo de presentar concentraciones por arriba del LMP en comparación con alimentos con una humedad relativa inferior (Cuadro 3). Este hallazgo coincide con otros estudios que informan que la actividad del agua presente en la matriz alimenticia es un factor relevante para la expresión de los genes reguladores de la ruta de biosíntesis de AFs45. Por lo que, si el sustrato contiene mayor humedad o se rehidrata durante su almacenamiento, las concentraciones de AFs pueden aumentar46. Este resultado podría atribuirse a que la materia prima extruida para la formulación de ACS presenta en la etapa inicial del proceso un exceso de contenido de humedad relativa (20-25 %) y aunque se reduce por secado hasta niveles bajos (8-12 %), solo se inhibe el crecimiento de las formas vegetativas de la microbiota fúngica, pero sus esporas y micotoxinas producidas dentro del material procesado permanecen estables45.
Los resultados de este estudio también mostraron que hubo mayor contaminación por AFs en presencia de algunos ingredientes empleados en la fabricación del alimento. Los ACS que contenían trigo o harina y aceite de pescado presentaron concentraciones mayores de AFs o un mayor riesgo de sobrepasar el LMP. En el caso de los cereales, la contaminación se ha atribuido a la exposición de los cultivos en varias etapas de la producción (floración, cosecha, transporte, procesamiento o almacenamiento)47. Estos ingredientes son ampliamente utilizados como fuente de carbohidratos, fibra, proteínas, grasas, minerales y vitaminas48; por otra parte, la harina y el aceite de pescado son productos resultantes del procesamiento de pescados enteros o subproductos (cocción, prensado, deshidratación y molienda) y constituyen una fuente de proteína rica en ácidos grasos de alto valor nutricional (ácido eicosapentaenoico, docosahexaenoico y omega-3)49. Estos ingredientes se incluyen en las fórmulas por su bajo costo y porque mantienen un valor nutricional aceptable para la fisiología del perro, además, su inclusión no afecta la palatabilidad y digestibilidad de los nutrientes38. Lo que sugiere que la contaminación por AFs puede ser común en los ACS con presencia de cereales o subproductos de pescado50,51. Por lo cual, la calidad de estos ingredientes se debiera garantizar, hacer un manejo adecuado y un manejo proceso eficaz del producto terminado para asegurar la protección contra la contaminación por AFs52.
Los resultados de este estudio mostraron que los ACS que incluyeron fungicidas o secuestrantes minerales en su formulación tuvieron tanto una menor concentración media de AFs como un menor porcentaje de AFs por encima del LMP (P<0.05) en comparación con los que no los incluyeron, lo cual sugiere una asociación protectora de estos agentes contra el riesgo de una contaminación por AFs superior al LMP. Este hallazgo sugiere que el empleo de los agentes fungicidas y secuestrantes son métodos útiles para reducir los efectos tóxicos de las AFs, ya que los fungicidas tienen un efecto inhibidor del crecimiento de los hongos por acidificación de su contenido citoplásmico53; mientras que los secuestrantes minerales ejercen su asociación protectora mediante la quimisorción β-dicarbonilo de las AFs, lo que reduce su biodisponibilidad mediante absorción gastrointestinal54,55.
De forma sorpresiva, en este estudio no se encontró asociación (P>0.05) entre la concentración de AFs o la proporción que sobrepasaban el LMP sugerido por la normatividad (Cuadro 2) contra algunas características consideradas como evidencia de calidad por los usuarios (alimentos premium, origen internacional o mayor precio). Lo anterior sugiere que la confianza del consumidor se basa en otros criterios diferentes a la inocuidad del ACS, como difusión mercadotécnica, supuesta asociación entre calidad y precio, palatabilidad o apariencia2.
Conclusiones e implicaciones
En el presente estudio, una contaminación considerable por Aspergillus flavus toxigénico se detectó, así como una concentración importante de aflatoxinas en la totalidad de las muestras recolectadas en un muestreo aleatorio y representativo de alimento comercial seco para perro. Estos hallazgos sugieren que se encuentra en riesgo la salud de los perros, el desarrollo adecuado de su función zootécnica y también pudiera afectar a las ramas agroindustriales que proveen este pienso, al alterar la inocuidad del producto y deteriorar su valor económico y nutricional. Los resultados del estudio indicaron que algunas características bromatológicas y formulación empleada en la elaboración de los ACS generaron mayor riesgo de contaminación por hongos y por micotoxinas; de lo anterior se deduce que es necesario diseñar y aplicar estrategias más efectivas para verificar la inocuidad de los ingredientes y de los procesos utilizados en la fabricación del ACS. Además, debe fomentarse el establecimiento de niveles máximos permisibles de AF específicos para el ACS y la investigación sobre la exposición prolongada del perro a bajas concentraciones de micotoxinas.
