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Introducción
La transferencia de embriones (TE), es considerada actualmente como una herramienta biotecnológica con gran importancia para multiplicar y obtener individuos con potencialidades productivas y alto mérito genético, que sean capaces de mejorar el rendimiento en los sistemas de producción bovina1. Diversos estudios evidencian el impacto de los factores que influyen en la efectividad de la técnica, los factores intrínsecos los cuales son propios del animal y están directamente relacionados a la fisiología del mismo, así también, factores relacionados con el embrión (tamaño del cuerpo lúteo (CL), estadio del desarrollo del embrión, toros usados para la fertilización, entre otros); y los factores extrínsecos que se relacionan al medio que rodea a los animales y que afecta de alguna manera la fisiología del animal (ambiente, nutrición, manejo, entre otros)2.
Las condiciones climáticas en niveles fuera del estado de reposo del animal, enmarcan la productividad del individuo desestabilizando las condiciones de confort y sometiéndolo a alteraciones de funcionamiento fisiológico que lo lleva a un medio de estrés calórico (EC)3. A lo largo de los años muchas investigaciones han establecido que el índice de temperatura y humedad (ITH), puede especificar en función de la combinación de las variables temperatura y humedad relativa, el grado de EC que sufren los animales4. El valor del ITH varía entre autores, pero se encuentra similitud al concretar que los valores > 72 presenta un EC en los animales. En este sentido, se consideran diferentes umbrales para caracterizar el estado de confort animal, según el valor del ITH, se caracteriza el EC como: confort (<68), malestar leve (68 - 72), malestar (72 - 75), alerta (75 - 79), peligro (79 - 84) y emergencia (> 84)5. No obstante, la mejora en la técnica y los resultados de las tasas de preñez siguen siendo tema de investigación teniendo en cuenta la cantidad de factores que influyen en el éxito de la biotecnología6.
El objetivo de este estudio fue determinar la influencia de factores como ITH, tamaño del CL, estado de desarrollo del embrión y peso sobre la tasa de preñez mediante transferencia de embriones por fertilización in vitro en novillas multirraciales.
Material y métodos
El estudio se realizó en Colombia, en el municipio de Puerto Boyacá ubicado geográficamente a 5°58´34´´ N y 74°35´15´´ O, perteneciente al departamento de Boyacá. Se hizo un experimento observacional con el fin de medir las variables ITH, tamaño del CL, estado de desarrollo del embrión y peso, así mismo se estimó como pueden afectar la tasa de preñez obtenida mediante TE por fertilización in vitro. Se seleccionaron novillas multirraciales (n= 840) receptoras con una edad promedio de 3 años, con un peso promedio de 346.5 kg; se realizó el manejo sanitario previo a los trabajos reproductivos, vitaminización, vermifugación, vacunación contra enfermedades reproductivas, antibioterapia y baño para parásitos externos. En el mismo sentido, se hizo un pesaje de control cada mes observando así la ganancia de pesos de los animales. La alimentación se implementó mediante pastoreo extensivo predominando las especies de guineas (Megathyrsus maximum), braquiaria dulce (Brachiaria humidicola), braquipará (Brachiaria mutica), agua a voluntad y sal mineralizada al 8 % de fósforo, de esta manera se brindó un manejo homogéneo para todos los animales. Las variables como la raza no fueron evaluadas, dada las condiciones de alta variabilidad en el componente racial de las hembras receptoras.
Los trabajos reproductivos se iniciaron en el mes de marzo en continuas actividades hasta el mes de diciembre del año 2020; previo a iniciar los trabajos las receptoras fueron examinadas por vía rectal y ecográfica, seleccionando animales que no tuvieran problemas anatómicos de útero, cuello uterino y ovarios que limitaran la respuesta a la transferencia. El protocolo de sincronización para las receptoras que se implementó fue de combinación de progesterona con benzoato de estradiol de la siguiente manera: el día 0 un dispositivo intravaginal bovino de liberación de progesterona (0.6 g de progesterona P4) más benzoato de estradiol (2 mg). El dispositivo fue retirado el día 8 y se aplicaron 300 UI de eCG (gonadotropina corionica equina), 150 µg de D-cloprostenol (análogo sintético de la prostaglandina F2α) y 1 mg de cipionato de estradiol7.
La transferencia de embriones se realizó el día 17 del inicio del protocolo de sincronización, para esto se realizó primero mediante ultrasonografía transrectal la palpación con el fin de detectar la presencia de un cuerpo lúteo en el ovario. Posteriormente, para la ejecución de la técnica de transferencia, se aplicó 3.5 a 4 ml de lidocaína (anestesia epidural) a la receptora, se limpió la zona vulvar y luego el embrión fue colocado en el punto más distal del cuerno uterino ipsilateral al ovario que presenta el cuerpo lúteo8. Los embriones utilizados fueron por fertilización in vitro obtenidos y empacados por profesionales del laboratorio BIOEMBRIO FIV S.A.S. de alrededor de 7 días, los cuales determinaban el estadio del embrión al empacarlo. Los embriones usados en este estudio fueron de la raza Girolando (F1 y 3/8 Gyr X 5/8 Holstein). La técnica fue aplicada por un solo veterinario con experiencia evitando variabilidad en el procedimiento. La detección de la gestación se realizó el día 28 después de proceso de transferencia, por lo cual se utilizó un ecógrafo Chison eco2-vet con un transductor lineal L7V-A 6.5MHz, donde se determinó si había presencia de la vesícula gestacional en el útero mediante la ecografía para el diagnóstico positivo.
Datos meteorológicos
Los datos medioambientales se obtuvieron del Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales (IDEAM), mediante una estación meteorológica cerca al área de estudio. El valor del índice fue calculado con los datos de temperatura y humedad relativa proporcionados por dicha estación. El índice de temperatura-humedad relativa (ITH) se calculó mediante la ecuación 1 reportada por Habeeb5:
ITH = (1.8*Ta+32) − [(0.55−0.0055* HR) × (1.8* Ta −26)]
Donde: HR= Humedad relativa del aire (%) y Ta= Temperatura del aire (ºC).
Análisis de los datos
Los datos fueron analizados usando el programa estadístico Epi Info versión 79, se utilizó un análisis de regresión logística para revelar el modelo de la relación entre variables independientes (tamaño del CL, estadio del embrión, ITH y precipitación) sobre la variable dicotómica de respuesta (tasa de preñez) que se obtuvo usando la transferencia de embriones; este modelo estadístico recurre a la razón de probabilidades, o “Odds ratios” (OR). Medidas estandarizadas que permiten comparar el nivel de influencia o fortaleza de las variables independientes sobre la variable dependiente, para el nivel de significancia de las pruebas se aceptaron P<0.05. El GLM se describe como Y= β 0 + α + e. Donde Y es la variable respuesta 1= preñada y 0= no preñada, 𝛽 0 es el intercepto, 𝛼 es el efecto de las variables categóricas en estudio y 𝑒 es el error estadístico. Así mismo, la variable continua de peso se analizó mediante estadística descriptiva y un análisis de varianza ANOVA observando el grado de significancia que presentaba dicha variable al asociarlo con la variable de respuesta.
Resultados
Se realizaron un total de 2,259 sincronizaciones y se obtuvo una respuesta general a los protocolos de sincronización tiempo fijo del 75.6 %, lo que permitió realizar un total de 1,710 transferencias con embriones por fertilización in vitro, donde se logró una tasa de preñez general del 29 %.
Efecto del tamaño del CL sobre la tasa de preñez
La clasificación del CL de acuerdo con el tamaño permitió obtener tres categorías CL1: <15 mm, CL2: 15-25 mm; CL3: >25 mm de diámetro10. El Cuadro 1 muestra que al asociar la tasa de preñez obtenida con el tamaño del cuerpo lúteo se encuentran diferencias significativas (P<0.05) para los tamaños de CL1 y CL2. Después de la transferencia se obtuvo que la probabilidad de preñez (razón de probabilidades, OR) es de 0.46 para el CL1; 0.62 para CL2 y 0.67 para CL3. Esto evidenció que existe 0.21 y 0.16 veces más de obtener una preñez con un CL3 y CL2 respectivamente, comparado con el CL1; de esta manera se tiene mejores probabilidades de aumentar las tasas de preñez cuando se transfieren embriones con mayores tamaños de CL 3 y 2 comparados con el CL1.
Cuadro 1 Asociación de tasa de preñez con el tamaño del CL
| Variable | Preñez (%) |
Razón de probabilidades |
Intervalo de confianza 95 % |
P-valor | |
|---|---|---|---|---|---|
| Tamaño CL1 | 25 | 0.4629 | 0.2636 | 0.8128 | 0.0073 |
| Tamaño CL2 | 31 | 0.6264 | 0.4051 | 0.9688 | 0.0355 |
| Tamaño CL3 | 32 | 0.6709 | 0.4342 | 1.0367 | 0.0722 |
| Constante | * | * | * | 0.1255 | |
Los valores subrayados presentan diferencias significativas (P<0.05).
Efecto del estadio del embrión sobre la tasa de preñez
Estadio del embrión se refiere al tiempo y desarrollo del embrión teniendo en cuenta las pautas de clasificación establecidas por la Sociedad internacional de transferencia de embriones (IETS)11; identificado con las letras BI: blastocito inicial alrededor de 5 días de desarrollo, BL: blastocito con 6 días de desarrollo, BX: blastocisto expandido con 7 días de desarrollo y BN: blastocisto en eclosión se encuentra rompiendo la zona pelúcida.
Los análisis realizados para conocer el efecto del estadio del embrión sobre la preñez evidencian diferencias significativas (Cuadro 2) con los estadios de BL y BX con valores P de 0.0136 y 0.0000 respectivamente. Se observa también que las probabilidades OR de obtener una preñez transfiriendo embriones con estadios de desarrollo de BX y BL es de 0.9 y 0.5 veces más respectivamente comparado con BI. Esto puede inferir que, a mayor desarrollo en embriones con la zona pelúcida intacta, refleja una mayor actividad y viabilidad de estos generando mejores tasas de preñez que al transferir embriones tardíos comprometiendo la fertilidad.
Cuadro 2 Asociación de tasa de preñez con el efecto del estadio del embrión
| Variable | Razón de probabilidades |
Intervalo de confianza 95 % |
P-valor | |
|---|---|---|---|---|
| Estadio embrión BI | 0.8290 | 0.5569 | 1.2342 | 0.3557 |
| Estadio embrión BL | 1.4129 | 1.0737 | 1.8594 | 0.0136 |
| Estadio embrión BN | 0.3060 | 0.0385 | 2.4337 | 0.2630 |
| Estadio embrión BX | 1.7750 | 1.3727 | 2.2952 | 0.0000 |
| Constante | * | * | * | 0.0000 |
BI= blastocito inicial alrededor de 5 días de desarrollo; BL= blastocito con 6 días de desarrollo; BX= blastocisto expandido con 7 días de desarrollo; BN= blastocisto en eclosión.
Los valores subrayados presentan diferencias significativas (P<0.05).
Efecto del ITH sobre la tasa de preñez
Respecto a la asociación del ITH con tasas de preñez no se encontraron diferencias significativa en el porcentaje de preñez con respecto a los diferentes valores de ITH en el momento de la transferencia (P>0.05) (Cuadro 3), aunque se determinó que en la zona donde se realizó el estudio los animales se encontraban en un rango de 78 a 83 según el índice enmarcado en zona de peligro según la clasificación de Armstrong, dado a la influencia de un ambiente altamente estresante donde condiciones genéticas y de adaptación pueden tener influencia en la respuesta obtenida.
Cuadro 3 Asociación de tasa de preñez con el Índice Temperatura Humedad (ITH)
| Variable | Razón de probabilidades | Intervalo de confianza 95 % |
P-valor | |
|---|---|---|---|---|
| ITH 78 día transferencia | 1.0818 | 0.000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| ITH 79 día transferencia | 0.7575 | 0.000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| ITH 80 día transferencia | 1.0840 | 0.000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| ITH 81 día transferencia | 0.9087 | 0.000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| ITH 82 día transferencia | 0.9567 | 0.000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| ITH 83 día transferencia | 0.5751 | 0.000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| Constante | * | * | * | 1.0000 |
Efecto de la precipitación sobre la tasa de preñez
Según el régimen de lluvias presentado en la época de estudio y reflejados en los datos de la estación meteorológica, se cataloga como una época de transición del tiempo seco con la primera temporada de lluvias del año el mes de marzo, obteniendo un valor de 184 mm al mes; también se puede inferir que los meses de mayor precipitación fueron abril y septiembre con valores de 380 y 578 mm respectivamente. Así mismo los meses con época seca fueron octubre, noviembre y diciembre con valores de 1, 71 y 0 mm respectivamente, del año 2020. El Cuadro 4 muestra los análisis de asociación de la tasa de preñez con la precipitación optando por generar 4 categorías que enmarca los meses según el régimen de lluvias 1: lluvias 0 a 100 mm, 2: 101 a 200 mm, 3: 201 a 300 mm, y 4: > 301 mm. Teniendo en cuenta los análisis realizados no se encontraron diferencias significativas (P>0.05) entre la variable precipitación con la variable respuesta, pero dada las razones de probabilidad OR al ser el valor >1 los meses categorizados con mayor precipitación 3 y 4 tienen mayores probabilidades de mejorar las tasas de preñez comparado con la categoría 1 y 2 siendo los meses menos lluviosos.
Cuadro 4 Asociación de tasa de preñez con la precipitación
| Variable | Razón de probabilidades | Intervalo de confianza 95 % |
P-valor | |
|---|---|---|---|---|
| Precipitación 1 | 0.8368 | 0.0000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| Precipitación 2 | 0.9175 | 0.0000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| Precipitación 3 | 1.1640 | 0.0000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| Precipitación 4 | 1.0937 | 0.0000 | >1.0E12 | 1.0000 |
| Constante | * | * | * | 1.0000 |
Efecto del peso de la hembra receptora sobre la tasa de preñez
El peso promedio de las hembras receptoras al momento de la transferencia presentó una media de 344 ± 107 kg para los animales que no presentaron preñez y 337 ± 42 kg para los animales que obtuvieron una preñez; el análisis de varianza no evidenció diferencias estadísticas (P>0.05) que asocien el peso con la preñez obtenida (Cuadro 5).
Discusión
Los resultados del presente estudio determinaron que el tamaño del CL tiene un efecto en las tasas de gestación después de la transferencia de embriones, se observó que la tasa de preñez era mayor a medida que el tamaño de CL era mayor. Las tasas de gestaciones fueron mayores en las receptoras con CL2 y 3 (31 y 32 % respectivamente) en comparación con las receptoras con CL1 (25 %). Resultados similares presentaron Alkan et al10 al evidenciar en su estudio que el diámetro de CL tuvo efectos significativos en la tasa de preñez durante la transferencia de embriones en vaquillas de carne. Del mismo modo, Baruselli et al7 determinaron que el efecto del tamaño de CL sobre la concentración de progesterona y la tasa de concepción en receptores de embriones está establecido, dado que los CL más grandes secretan más P4 y esto puede tener un efecto positivo en el reconocimiento de la preñez y, en consecuencia, en las tasas de efectividad en los programas de TE. En contraste, otros investigadores12 no encontraron ningún efecto significativo para los rasgos físicos de tamaño y calidad del CL de las receptoras sobre la tasa de concepción, volumen de CL (P= 0.20), lado de CL (P= 0.14) . Del mismo modo, Vieira et al13 observaron en su trabajo que no había diferencias significativas en el efecto que producía el tamaño del CL sobre el porcentaje de preñez obtenido.
En este estudio se encontraron diferencias significativas para la variable de estadío de desarrollo embrionario obteniendo mejores resultados al transferir embriones en blastocisto y blastocisto expandido. Esto puede ser explicado, ya que al transferir un embrión cuyo desarrollo ha sido más rápido, podría expresar más rápidamente los factores de reconocimiento de preñez, comparado con uno del mismo tiempo y de menor tamaño. Esto puede estar soportado por un trabajo13, en el cual observaron que el grado de desarrollo del embrión tuvieron un impacto importante en los resultados de preñez en las receptoras. En contrastes varios autores14 no identificaron diferencias significativas en las tasas de preñez según el estado de desarrollo embrionario BI, BL y BX. Bényei et al15 reportaron que el análisis estadístico no reveló diferencias significativas en la preñez obtenidas teniendo en cuenta la etapa en el desarrollo embrionario.
El análisis estadístico del presente estudio no encontró diferencias significativas en el efecto del ITH sobre la tasa de preñez. En contraste Silva et al16 observaron que a partir de un ITH de mayor a 72 las vacas Holstein comienzan a disminuir la producción de leche influenciadas por las variables climáticas. Otros estudios17) concluyen que los efectos de la baja tasa de preñez están influenciados por las prolongadas cargas de calor a la que se encuentra expuestos los animales en su medio productivo que al ITH el día del servicio; en su estudio realizado en Queensland, Australia con animales Holstein lactantes se estableció ITH 72 como el umbral para desencadenar efectos reproductivos negativos, obteniendo tasas de concepción reducidas por la prolongada exposición a estrés calórico 5 y 1 semana antes y después del servicio. Así mismo Schüller et al18) en su estudio con vacas lactantes encontraron que la tasa de concepción se reduce a medida que los animales se encuentren en un estrés calórico al momento del servicio como su prolongada exposición a esta condiciones. También determinaron que 1 hora de exposición con un ITH de 73 fue suficiente para que la tasa de concepción bajara un 5 %.
En este experimento concluyó que la constante exposición a estrés calórico con ITH 73 actúa con efectos negativos en la reproducción 42 y 31 días antes y después respectivamente del día del servicio disminuyendo las tasas de preñez ocasionado por el estrés calórico. Cordeiro et al19 en su estudio demostraron que el estrés por calor afecta negativamente las tasas de concepción de vacas cruzadas (Bos taurus × Bos indicus) transferidas al norte de Brasil, donde tuvieron una disminución en las tasas de concepción cuando ITH alcanzó 75.7; en contraste, el mes que obtuvo la tasa de concepción más alta presentó el clima más favorable durante el experimento (ITH 73.1). Se ha mencionado20 que los niveles altos de THI tienen un efecto negativo sobre la reanudación de la actividad ovárica y el comportamiento reproductivo en vacas Bos indicus mantenidas en pastoreo, especialmente si se produce un THI alto durante el último trimestre de gestación.
La variabilidad de la precipitación en los sistemas de producción animal en zonas tropicales puede tener efectos negativos sobre el crecimiento y la calidad del forraje; representando una condición económica importante al alterar el rendimiento productivo y reproductivo del animal debido a la baja disponibilidad de nutrientes21. En este estudio no se encontró un efecto significativo en la tasa de preñez por transferencia de embriones asociado al régimen de lluvias presentado en el tiempo del experimento. En este sentido, Mulliniks et al22) obtuvo resultados similares al concluir que el régimen de precipitación de la época seca y época lluviosa no influyo significativamente (P>0.46) en la actividad y desempeño reproductivo de los animales en estudio; indicando también que dada la variabilidad en la precipitación anual los animales que poseen una calificación de la condición corporal de 4 a 4.5 (calificando de 1 al 9), pueden tener un desempeño reproductivo similar a hembras con mejor puntuación en condición corporal. Anudado a esto, en el estudio realizado por Fernandes et al23 no encontró diferencias significativas (P>0.05) obteniendo tasa de gestación similar entre las épocas de lluvias y secas con valores de 42.3 vs 45.8 %, respectivamente (P>0.05). En contraste, Scasta et al24 determinaron un impacto positivo que tiene la precipitación en el rendimiento forrajero, lo cual, indicaría que las condiciones frías y húmedas ofrecen un mayor plano de nutrición para el pastoreo; así los diversos niveles de precipitación experimentados pueden ser determinantes durante los momentos clave de la gestación.
El análisis estadístico del estudio mostró que no hubo diferencia significativa (P>0.05) en la variable del peso de la hembra receptora con respecto a la tasa de preñez. Datos similares se obtuvieron23 al determinar que no hubo diferencia (P>0.05) en el peso corporal (346.5 ± 33.4 kg) de las receptoras con respecto a la tasa de gestación. También determinaron que la variación individual en el potencial para alcanzar ganancia de peso diaria (GDP) por encima de 250 g/día, fue el principal factor que afectó la tasa de preñez a medida en que aumenta la GDP hasta 350 g/día, por lo cual, obtuvo este rango en su experimento como un umbral óptimo para mejorar resultados en los promedios de las gestaciones logradas. Además, concluyeron que las tasas de preñez en receptoras de embriones criadas en pastoreo en climas tropicales podrían mejorarse mediante la selección de hembras de acuerdo con su potencial de ganancia de peso corporal. Contrario a esto, Shorten et al25 encontraron en su estudio diferencia significativa (P<0.01) al observar mejores tasas de preñez con mayor peso corporal antes del apareamiento (364 ± 77 kg) en hembras de la raza Angus.
Conclusiones e implicaciones
El estudio realizado evidencia un efecto significativo del tamaño del CL sobre la tasa de preñez, observando mayores probabilidades de una gestación cuando se transfiere el embrión en el cuerno ipsilateral a un CL3 y 2, presentando mayor probabilidad de no quedar gestante al transferirse el embrión en una receptora que presente un CL1 < 15 mm de diámetro. Anudado a esto, se presenta una mayor probabilidad de obtener una preñez transfiriendo embriones en un estado de desarrollo de blastocisto expandido BX y blastocisto BL comparado con desarrollos de blastocisto inicial BI y en eclosión BN. Las variables como el ITH, peso del animal y precipitación no presentaron diferencias estadísticas que demuestren la influencia marcada de la asociación de estas variables con la tasa de preñez obtenida. Se recomienda seguir realizando más investigación que permita obtener más información sobre los efectos de los factores como el componente racial de las receptoras y los embriones que influyen en la efectividad de la técnica de transferencia de embriones.
