Recolección de sangre fetal bovino y separación del suero

Se recibió un lote de suero de una empresa cárnica (Frigorífico y Empacadora de Aguascalientes S.A. de C.V. - FREASA) lo cual se recolectó por personal capacitado. Se trasladó al laboratorio en condiciones de congelación (-20 °C) para su posterior procesamiento. La sangre se obtuvo mediante la técnica de punción cardíaca¹⁸. Se recolectó en tubos Falcon^® estériles de 30 ml y una bolsa de contención de sangre de 500 ml con anticoagulante (bolsa ACD BLORECEP de 500 ml con 2.20 g de citrato trisódico, 0.80 g de ácido cítrico, 2.45 g de dextrosa y H₂O libre de pirógenos). Se centrifugó la sangre a 3,000 rpm durante 5 min^19,20, se extrajo el suero y se colocó en tubos Falcon^® de 30 ml. Se tomaron alícuotas del suero en tubos y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Al realizar el proceso de la separación de hemocomponentes se obtuvieron dos muestras: el suero (centrifugación de muestra de sangre sin anticoagulante) y el plasma (centrifugación de muestra de sangre con anticoagulante). La diferencia entre las muestras es la presencia/ausencia de las proteínas responsables de los procesos de coagulación^21,22. Con base en las muestras recolectadas, se definieron tres grupos experimentales: el grupo control, FBS comercial (C-FBS); un grupo experimental del suero obtenido de la industria cárnica (E-FBS); y uno del plasma obtenido de la industria cárnica (E-Plasma).

Filtración del FBS para la eliminación de los componentes celulares

Se eliminaron los componentes celulares del suero por medio de la microfiltración con el uso de filtros de jeringas de 0.2 µm. Se aplicó el mismo proceso de filtración a todos los grupos [C-FBS (F1), E-FBS (F1), and E-Plasma (F1)], y se guardaron las muestras procesadas en nuevos tubos de 2 ml.

Evaluación de la esterilidad por medio de pruebas microbiológicas

Se utilizó caldo de soya (BD Bioxon^®, Becton Dickinson de México) en el ensayo de esterilidad, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se prepararon seis tubos con caldo de soya a los que se añadieron 200 µl de C-FBS, E-FBS o E-Plasma sin filtrar, además de un tubo de control positivo (saliva humana). Se colocaron los tubos en una estufa bacteriológica a 37 °C durante 24 h.

Presencia/ausencia de Mycoplasma sp.

Se realizó una prueba de la presencia/ausencia de Mycoplasma sp. sobre medio de crecimiento selectivo con Mycoplasma sp. agar (MO660-500G de SIGMA). Se prepararon 100 ml del medio para 15 cajas de Petri pequeñas. Según las instrucciones del fabricante, se sembraron siete cajas con hisopos estériles, y luego se sembró un control positivo (un raspado de la epidermis facial) y las muestras. Una vez preparadas las cajas, se colocaron en una estufa bacteriológica a 37 °C durante 24 h.

Evaluación del pH

Se cuantificó el pH por medio de tiras reactivas (Hydrion^® 9400, Plastic pH Indicator Strips, pH rango 5.0-9.0) y basado en una escala colorimétrica. Se evaluaron los mismos grupos descritos anteriormente; los grupos de FBS se evaluaron con la dilución del medio de cultivo.

Preparación de las muestras de dilución para la medición de la concentración de proteína total y la concentración de ADN

Para llevar a cabo la medición de la concentración de proteína total y la concentración de ADN, se diluyeron las muestras hasta una concentración final de 1,030 µg/ml; esto es un factor de dilución (FD) de 32, es decir, se diluyó 32 veces la concentración del FBS. Se calculó el FD con la formula siguiente: FD= C_I / C_F, donde: FD= factor de dilución; C_I= concentración inicial; C_F= concentración final.

Concentración total de proteína

Se hizo la medición de las proteínas totales basado en el método colorimétrico de Pierce y usando un kit comercial de proteínas (Pierce^TM BCA Protein Assay Kit, ref. 23227, Thermoscientific^®). Siguiendo el protocolo propuesto por el fabricante, se prepararon el reactivo de trabajo, las muestras y la curva de calibración. Brevemente, se pipetearon 25 µl de cada estándar o desconocido por réplica (tres réplicas) en cada pocillo de la placa. Se agregaron 200 µl del reactivo de trabajo y se incubó a 37 °C por 2 h. Las lecturas se realizaron a 620 nm, en un lector de placas de 96 pozos (Multiskan FC, SN 357-914771, Thermoscientific^®).

Concentración de ADN

La cuantificación de la concentración de ADN se hizo con un equipo Nanodrop siguiendo el método de extracción Fenol-Cloroformo, el cual se divide en tres pasos:

1. Lisis celular. La muestra se centrifugó durante 5 min a 270 xg, y se descartó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 100 µl de PBS. La muestra se incubó a -80 °C durante 30 min, se transfirió a un sonicador y se aplicó a 20 kilohertzio en dos tiempos de 10 s para romper las células. Después de la lisis, se centrifugaron las muestras a 10,000 xg durante 20 min, y se trasladó el sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf^® estéril para continuar con la segunda fase.

2. Separación de fases. Al sobrenadante se añadieron 250 µl de fenol-cloroformo y se pasó por un proceso de vórtice continuo. Se centrifugó esta mezcla a 10,000 xg durante 5 min hasta observar una separación de dos fases. La fase superior se usó en el siguiente paso.

3. Purificación del ADN. Se añadieron 200 µl de cloroformo a las muestras y se centrifugaron a 10,000 xg durante 10 min. Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. A los sobrenadantes se añadió 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M y dos volúmenes de etanol al 100 %. Se dejaron precipitar durante la noche a -80 °C. Una vez finalizadas, se centrifugaron las muestras a 10,000 xg durante 30 min a 4 °C, y se extrajo el sobrenadante. Al resto del contenido del tubo se añadieron 100 µl de etanol al 70% y se centrifugó durante 10 min a 10,000 xg. Para limpiar el material genético se repitieron los pasos de la adición de etanol al 70 % y el centrifugado de 2 a 3 veces. Se eliminó la mayor cantidad de sobrenadante posible y se dejó evaporar el etanol restante. Se resuspendió el material genético en 100 µl de agua de grado Milli-Q y se realizaron lecturas de ácido nucleico en un espectrofotómetro (Nanodrop 2000, Thermoscientific).

Osmolaridad

La osmolaridad se midió con un osmómetro (Modelo 5004 Automatic Osmometer, Precision Systems). Después de calibrar el equipo y seleccionar el rango, se midió 100 µl de muestra en un tubo Eppendorf^®.

Proliferación celular

Se medió la proliferación celular utilizando un medio de cultivo DMEM bajo en glucosa con L-glutamina y piruvato de sodio (Biowest^®). Se añadió a este medio una solución antibiótica/antifúngica (A5955, Sigma^®) así como FBS comercial (el suero de control; F2442, Sigma^®). Se prepararon tres tipos de medios: suero comercial (C-FBS), suero de la industria cárnica (E-FBS), y plasma de la industria cárnica (E-Plasma).

La prueba de viabilidad celular se llevó a cabo con un kit comercial (MTT Assay Kit, Abcam^®) y placas de 96 pocillos. Se utilizó la línea hFOB 1.19 ATCC de osteoblastos con una siembra inicial de 1,000 células. Los osteoblastos son un tipo de célula sin requerimientos específicos para el crecimiento y proliferación, aunque para los fines del presente estudio se aplicaron las condiciones estándar para el cultivo celular: 37 °C, atmósfera de 5 % CO₂, 95 % aire⁹. Se realizaron mediciones a los 3, 7, 14 y 21 días para cuantificar el crecimiento celular. Se leyeron las placas en un lector de placas de 96 pocillos (Multiskan FC, SN 357-914771, Thermoscientific^®) a 620 nm.

Análisis estadísticos

Se calcularon las medias, medianas y la desviación estándar de los resultados. La distribución de normalidad de los datos se evaluó con una gráfica Q-Q, y la homogeneidad de la varianza con la prueba de Levene. Si los datos cumplieron con el supuesto estadístico, se aplicó una prueba ANOVA de dos colas o de una vía. Para evaluar la cinética de proliferación celular se utilizó una prueba de razón de verosimilitud (RV) para comparar las curvas cinéticas. Se llevaron a cabo los análisis estadísticos con el programa estadístico R versión 4.0.3, considerando un nivel de confianza del 95%.

Evaluación de la esterilidad por pruebas microbiológicas

Se hicieron dos pruebas microbiológicas para confirmar la esterilidad de las muestras, una en el momento de la colecta de las muestras y otra después de un mes de almacenamiento a - 20 °C. En la primera, no se observó crecimiento microbiológico en las muestras después de una incubación a 37 °C por 24 h (Figure 1A). Tampoco a un mes las muestras evidenciaron crecimiento, aunque, como es de esperar, la muestra de saliva mostró la turbidez característica del crecimiento microbiológico. Ninguna de los sueros o el plasma mostraron la presencia de Mycoplasma sp. en el agar (Figuras 1B, C y D). Este coincide con las pruebas microbiológicas, pero la muestra de la piel si mostró el crecimiento de este microorganismo (Figura 1E).

No se detectó el crecimiento microbiológico en las muestras (A), y el Mycoplasma sp. estuvo ausente en las muestras (B, C y D), pero presente en la muestra de piel (E).

Figura 1 Pruebas microbiológicas 

Concentración de ADN

Hubo diferencias en la concentración de ADN entre los grupos y entre las muestras filtradas y no filtradas (P<0.05, Cuadro 2). De las muestras no filtradas, no hubo diferencia entre la E-Plasma and el C-FBS, pero si hubo entre el E-Plasma y el E-FBS y entre el E-FBS y el C-FBS.

Concentración de proteína total

En este parámetro se observaron diferencias entre los C-FBS y E-FBS y entre el E-Plasma y el C-FBS, todos filtrados (P<0.05). No hubo diferencias entre el E-Plasma y el E-FBS no filtrados, pero si hubo diferencias entre los no filtrados del E-Plasma y el C-FBS y entre los E-FBS y C-FBS (Cuadro 2).

pH

Antes de la filtración, el C-FBS y el E-FBS tuvieron un pH de 7.0, pero la muestra de E-Plasma tuvo un pH de 6.0. Después de la filtración, los tres tuvieron un valor de pH de 7.0.

Osmolaridad

La osmolaridad no difirió entre grupos experimentales ni antes ni después de la filtración (P>0.05, Cuadro 2).

Viabilidad celular

Se evaluó el crecimiento celular entre los grupos experimentales por medio de la viabilidad celular a través del tiempo (Figura 2). Se hizo la comparación usando una prueba de la razón de verisimilitud con un valor de RV= 0.031124 y un P= 0.999. No se observaron diferencias entre los grupos.

La viabilidad celular fue positiva durante los 21 días del ensayo y el porcentaje de viabilidad a los 3, 7 y 14 días no difirió entre los tres grupos.

Figura 2 Curva de la viabilidad celular