Asilamiento de S. aureus

Se analizaron 30 aislados de S. aureus procedentes de casos de mastitis subclínica de vacas localizadas en granjas lecheras ubicadas en localidades de los estados de Guanajuato y Michoacán, México, las cuales utilizan sistemas de producción semi-intensivo y de traspatio. El muestreo, aislamiento y caracterización de los aislados ya fue reportado por Varela et al en 2018¹².

Perfil de multirresistencia a antibióticos

Se realizó un antibiograma por el método de difusión en disco Kirbi Bauer¹³, utilizando sensidiscos de la marca Biorad^® con los siguientes antibióticos y concentraciones: penicilina (PE) 6 µg, oxacilina (Oxa) 6 µg, dicloxacilina (DC) 30 µg, pefloxacina (PEF) 5 µg, cefuroxima (CXM) 30 µg, gentamicina (GE) 120 µg, cefotaxima (CTX) 30 µg, sulfametoxazol + trimetoprima (SXT) 1.25 y 23,75 µg, tetraciclina (TE) 30 µg, ampicilina (AM) 10 µg, eritromicina (E) 15 µg, ceftazidima (CAZ) 30 µg y cefalotina (CF) 30 µg. Los resultados se reportan como sensible, intermedio y resistente con base en los parámetros establecidos en Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 2019¹⁴. Una vez establecido el perfil de resistencia, los 30 aislados se clasificaron como se describe a continuación: Grupo 1: Resistencia alta (resistentes a 11-13 antibióticos), Grupo 2: Resistencia media (9-10 antibióticos), Grupo 3: Resistencia baja (4-8 antibióticos).

Formación de biofilm

Para medir la capacidad formadora de biofilm de los aislados de S. aureus, se utilizó el protocolo de tinción con cristal violeta¹¹, como se describe a continuación: se cultivó el aislado bacteriano en medio LB y se incubó 24 h a 37 ⁰C. Los ensayos se realizaron en placas estériles de 96 pozos y se colocaron ≈ 1 x 10⁶ UFC en un volumen final de 100 µl en cada pozo. Los aislados se incubaron 48 horas a 37°C.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se descartó el sobrenadante, se lavaron los pozos con 100 µl de solución PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ y 2 mM KH₂PO₄) y se secaron los pozos. Posteriormente, a cada pozo se adicionaron 100 µl de solución de cristal violeta (0.5% peso/volumen) y se dejó reposar 15 min. Después se eliminó el colorante y se lavó dos veces con 100 µl de PBS. Después se adicionaron 125 µl de etanol al 95% (volumen/volumen) y se resuspendió vigorosamente para disolver el colorante. Se tomó la lectura de la absorbancia a 495 nm en un analizador de microelisa ELIREAD (Kontrolab^®, Guidonia, Italia). Una vez obtenidos los datos, se graficó el porcentaje de formación de biofilm utilizando como 100 % la absorbancia registrada de la cepa certificada de S. aureus (ATCC 27543). Se realizaron tres experimentos independientes con tres repeticiones.

Análisis de los genes de resistencia y formación de biofilm

La presencia de genes relacionados con la resistencia a antibióticos y formación de biofilm se realizó a partir del ADN genómico, el cual se obtuvo picando una colonia bacteriana de una placa de cultivo fresco, para posteriormente colocarla en la mezcla de reacción de PCR. Los oligonucleótidos utilizados en este estudio se muestran en el Cuadro 1. La reacción se realizó en un volumen final de 20 µl que contenía oligonucleótidos 0.4 µM, desoxinucleótidos trifosfatos 200 µM (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos), cloruro de magnesio 2 mM (Invitrogen, Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) y 1 U de Taq polimerasa (Invitrogen, Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: temperatura de desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min, seguida de 30 ciclos de amplificación de desnaturalización durante 10 min a 94 °C, alineamiento durante 1 min a la temperatura específica de los oligonucleótidos (Cuadro 1), polimerización durante 30 seg a 72 °C, y un ciclo de extensión final durante 7 min a 72 °C. Los amplicones (5 µl) se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% (peso/volumen) y se tiñeron con bromuro de etidio. Se consideró positivo para el gen, la presencia de una banda de amplificación correspondiente al tamaño del producto esperado.

Para analizar el fundamento genético de los mecanismos de resistencia bacteriana, se analizó la presencia de los genes blaZ y mecA para los antibióticos betalactámicos^15,16; tetK y , tetM para tetraciclinas¹⁶ y gyrA y gyrB para quinolonas¹⁷.

Análisis estadístico

Se realizaron tres experimentos independientes en los cuales se midió la absorbancia producida por la tinción del biofilm formado. Los experimentos fueron hechos por triplicado. Se obtuvo la diferencia entre la mayor absorbancia, menos la mayor cantidad de biofilm, dicha diferencia definida en este estudio como absorbancia.

Los 30 aislados de S. aureus se clasificaron en tres grupos de acuerdo con el nivel de resistencia a antibióticos: alta, media y baja, de 10 aislados en cada uno y posteriormente fueron evaluados de acuerdo con su absorbancia. En los análisis se incluyeron los resultados de los controles positivos para cada nivel de resistencia de cada experimento.

Se evaluó la normalidad de la variable dependiente absorbancia, utilizando la prueba de bondad de ajuste de Ji cuadrada resultando normal (P>0.05). Los datos fueron analizados con un análisis de varianza (ANDEVA) con un diseño factorial con arreglo completamente al azar. El modelo utilizado se muestra a continuación:

Yijk=µ + EXi + GRj + EXixGRj + eijk, en donde:

Yijk= es la k-ésima observación de absorbancia, del i-ésimo experimento y el j-ésimo grado de resistencia,

µ= media general como parámetro constante,

EXi= i-ésimo experimento, j=1, 2 y 3,

GRj= j-ésimo grado de resistencia, i=1, 2 y 3,

GRixEXj= interacción entre el i-ésimo grado de resistencia y el j-ésimo experimento,

eijk= error experimental.

Adicionalmente, se estimó la correlación de rango de Spearman entre grado de resistencia y la absorbancia.

Perfil de resistencia a antibióticos de los aislados de S. aureus provenientes de mastitis bovina

Los resultados muestran que el 100 % de los aislados son resistentes a la penicilina y dicloxacilina, además el 86.6, 83.3 y 80.0 % muestran resistencia a la ampicilina, cefalotina y ceftazidima, respectivamente; se observó también que un 36.6 % de los aislados son resistencia a la oxacilina. En general, todos los aislados analizados fueron resistentes al menos al 33.3 % de los antibióticos probados (Cuadro 2).

La resistencia a antibióticos es un fenómeno que sigue en aumento y que afecta de manera importante al sector salud, tanto en la medicina humana como en la medicina veterinaria, ya que dificulta el manejo adecuado de las enfermedades infecciosas. Tal es el caso de la mastitis bovina; S. aureus, como una de las principales bacterias aisladas de mastitis bovina presenta altos índices de resistencia. En los últimos años, a nivel mundial, continúa en aumento la selección de mecanismos de resistencia bacteriana¹⁸. En este sentido, en diversos países donde se analizó el perfil de resistencia de S. aureus proveniente de mastitis bovina, se encontraron porcentajes de resistencia a penicilina cercanos al 100 %^19-23, lo que coincide con los resultados aquí reportados. Con relación a la resistencia presentada a la oxacilina, se encontraron resultados contrastantes, ya que estudios realizados en países como la India y en China se presentaron niveles de resistencia del 48 al 84 %^(21,24,); sin embargo, en Alemania, Japón y Colombia los niveles de resistencia a oxacilina son mínimos (2-7 %)^21,23,25, mientras que estos resultados muestran niveles intermedios de resistencia (33.3 %). En México, estudios revelan elevados niveles de resistencia bacteriana a penicilina, amoxicilina y dicloxacilina (100 %)^26,27, lo que es congruente con lo reportado en este trabajo. Asimismo, existe un incremento importante en la resistencia a la cefalotina, por ejemplo, en el 2008 se reportó que el 30 % de las cepas de S. aureus estudiadas presentaban resistencia²⁷; sin embargo, en este trabajo se encontró resistencia de hasta 83 %. Estas variaciones pueden deberse a la posible variabilidad genética de los aislados, a las diferencias climatológicas, así como discrepancias geográficas entre otros factores²⁸. Con base en estas diferencias, se resalta la necesidad de realizar trabajos como el que aquí se expone, para definir las características de virulencia de los S. aureus aislados de regiones particulares; para generar la información necesaria que permita la implementación de tratamientos más eficientes para la mastitis bovina subclínica.

La presencia del gen blaZ fue observada en el 100 % de los aislados analizados, mientras que sólo el 36.6 % resultó positivo para el gen mecA (Cuadro 3). Estos resultados concuerdan con lo reportado con anterioridad, donde se mostró la presencia de estos genes en la totalidad de los aislados analizados^19,29. La presencia de los genes tetK, tetM, gyrA y gyrB fue expresada de manera descendiente en función de los grupos analizados, lo cual es congruente con el fenotipo encontrado en los antibiogramas. Esta coherencia entre el fenotipo y el genotipo de resistencia bacteriana ya ha sido demostrada con anterioridad^29,30, por lo que la resistencia observada se puede atribuir a la presencia y eventual expresión de los genes analizados³¹.

Formación de biofilm de S. aureus aislado de mastitis bovina

El análisis de la formación de biofilm mostró que la totalidad de los aislados presentaron la capacidad de formar biofilm con un rango del 20 a 98 %. Diversos estudios alrededor del mundo reportan que las cepas de S. aureus analizadas presentan la capacidad de formación de biofilm (90 a 99 %)^32,33, lo que coincide con el presente estudio.

Debido a que S. aureus presenta altos niveles de resistencia a antibióticos; es necesario analizar los factores y características de virulencia que posee esta bacteria para poder diseñar estrategias de control más eficientes. En este sentido, ya se ha reportado que S. aureus tiene la capacidad de formar biofilm³⁴, lo cual puede estar relacionado con la baja efectividad que presentan los fármacos utilizados convencionalmente³⁵.

Para establecer la posible relación entre la resistencia y la formación de biofilm en los 30 aislados provenientes de mastitis bovina, se siguió la siguiente estrategia. Primeramente, los resultados de formación de biofilm se analizaron en función del nivel de resistencia de los aislados (Figura 1); para lo cual, estos fueron ordenados en tres grupos como se describe en la sección de materiales y métodos. En el análisis de varianza de este estudio, solo el efecto de grado de resistencia resultó significativo (P<0.01), encontrando que los niveles promedio de absorbancia de los aislados fueron de 1.34 (63.17 %), 0.77 (38.78 %) y 0.66 (26.28 %) para los grupos 1, 2 y 3, respectivamente. En la comparación de medias, los grupos 1-3 fueron diferentes (P<0.05) (Figura 1B). La correlación estimada entre el grado de resistencia y la formación de biofilm fue positiva (0.50) y significativa (P<0.01) (Figura 2); además, estas diferencias fueron analizadas microscópicamente, donde la formación de biofilm en los aislados del grupo 1 se observaron incrementadas de manera importante en comparación con los otros dos grupos (Figura 1A). Debido a que la formación de biofilm por S. aureus induce al desarrollo de infecciones crónicas y recalcitrantes³², resalta la necesidad de analizar cómo es que esta característica de virulencia se relaciona con otros mecanismos como la resistencia a antibióticos. Con referencia a lo anterior, esta relación ha sido estudiada tanto en bacterias Gramnegativas^36-39 como Grampositivas^(40,41,); sin embargo, existen discrepancias al definir si la correlación que se presenta es positiva^42,43,44) o negativa⁴¹. En este estudio, se observó que los aislados con una multirresistencia elevada presentan una mayor formación de biofilm; estableciéndose una correlación positiva, la cual es consistente con la mayoría de los trabajos reportados al respecto^42,43,44. Finalmente, se analizó la presencia de los genes icaA, icaD, los cuales se encuentran directamente relacionados con la formación de biofilm⁴⁵. Interesantemente, se encontró que existe una alta frecuencia de ambos genes en los aislados (86.6 %), sin importar el grado de resistencia que presentan (Cuadro 3). Diversos autores coinciden con este resultado, ya que reportan una frecuencia cercana al 100 % de uno o ambos genes en las cepas de S. aureus formadoras de biofilm^46,47,48.

A) Imágenes representativas de la tinción del biofilm en los tres grupos (Grupo 1: Resistencia alta, de 11 a 13 antibióticos; Grupo 2: Resistencia media, de 9 a 10 antibióticos y Grupo 3: Resistencia baja de 4-8 antibióticos), visualizadas con microscopia de campo claro.

B) El gráfico representa el porcentaje de formación de biofilm de los tres grupos de aislados. Se utilizó la cepa certificada de S. aureus ATCC 27543 como control positivo, cuyo valor de absorbancia se estandarizó como el 100 %. Se presenta el promedio de tres experimentos independientes por triplicado ± su desviación estándar. (*) representa diferencia estadísticamente significativa entre grupos (P≤0.001).

Figura 1 Formación de biofilm por los aislados de S. aureus. Para medir la formación de biofilm se utilizó el protocolo de tinción con cristal violeta. 

Figura 2 Relación entre el porcentaje de resistencia y formación de biofilm (%) de los aislados de S. aureus