Genotipificación

Los genotipos fueron proporcionados por la Asociación Nacional de Criadores de Frisona de Italia (ANAFI) para un total de 44 cabezas de ganado Holstein-Friesian de entre 12 y 15 meses de edad, provenientes todas de un solo hato, de la estación experimental de la Universidad. Todos los individuos tenían un índice de imputación de marcadores de más del 98 %. Los animales utilizados en este estudio fueron parte de una población experimental criada en la granja experimental de la Universidad de Milán, Azienda Agraria Didattico Sperimentale Angelo Menozzi. Los animales fueron genotipificados utilizando la versión 4 del arreglo GGP LD (GeneSeek®) para bovinos. Después de excluir los SNP que no estaban asignados a un cromosoma bovino BTA o que estaban asignados a BTA X o al ADN mitocondrial, quedaron 27,365 SNP.

Análisis de componentes principales (ACP)

La información adicional disponible para cada individuo incluía su pedigrí, su productividad genética, su funcionalidad, su índice de selección genética de tipo (GPFT), y su grupo de genotipificación. El ACP se llevó a cabo dentro de los SNP con el paquete informático SVS & Variation (Golden Helix®), versión 8.4 (SVS) (Golden Helix Inc., Bozeman, MT). El procedimiento utilizado en SVS tomó en cuenta 20 componentes principales, calculando para cada uno de ellos un valor de Eigen relativo: el primer componente principal (valor de Eigen = 1.188) fue graficado contra el segundo (valor de Eigen = 0.983).

Coeficientes de consanguinidad

Utilizando SVS se calculó el coeficiente de consanguinidad de F _IS (o ƒ), definido como 1-(HET_OBS/HET_EXP). Este coeficiente es equivalente al índice de fijación dentro de las subpoblaciones de Wright con valores de entre -1 y +1. Todos los coeficientes de consanguinidad genética (F _ROH) se calcularon según⁹:

Donde L _ROH= es la longitud total de todos los ROH del genoma de un individuo, mientras que L _AUTO se refiere a la longitud especificada del genoma autosómico cubierto por SNP (2,505,649,802 bp en el presente estudio).

Los coeficientes de consanguinidad basados en el pedigrí (F _PED) se derivaron del programa Pedigree Viewer¹⁰. El pedigrí incluía registros de 2,760 individuos hasta 19 generaciones calculados por Pedigree Viewer, que ordena la información genealógica en las distintas generaciones. F _PED y F _ROH fueron comparados mediante la regresión lineal y el coeficiente de correlación de Pearson para probar su similitud y resaltar las diferencias entre los dos métodos de cálculo en un grupo de animales del mismo hato.

Tramos de homocigosidad

Se calculó el número de tramos de homocigosidad para cada individuo utilizando SVS, versión 8.4. Este programa no se basa en ventanas deslizables para identificar los ROH, sino que el algoritmo funciona de manera continua en todo un cromosoma, examinando todos los tramos posibles en busca de una correspondencia con los criterios especificados¹¹. Se emplearon los siguientes criterios para definir ROH: 1) se permitía la ausencia de dos SNP; 2) se permitía un genotipo heterocigoto; 3) se estableció un número mínimo de 30 SNP como un tramo de homocigosidad entero, 4) una longitud mínima de 1 Mb y 5) un intervalo máximo de 1 Mb al siguiente SNP. Los tramos de homocigosidad se dividieron en cinco clases (<2, 2 a 4, 4 a 8, 8 a 16, y >16 Mb), utilizando la misma nomenclatura reportada por otros autores^4,5. Se hizo un diagrama de la incidencia de tramos comunes por SNP empleando la herramienta Genome Browse de Golden Helix, y después se alinearon al ensamblaje bovino BTA U 5.0.1 para identificar los genes consistentes con el SNP en el primer 1% y el primer 5% de los tramos. La base de datos en línea STRING clasificó la red entre estos genes¹², mientras se realizó la ontología de los genes (OG) mediante el sistema de clasificación Análisis de Proteínas mediante Relaciones Evolutivas (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships, PANTHER) (Publicación 13.1), (http://www.pantherdb.org/pathway/).

Análisis de componentes principales (ACP)

Los individuos se agruparon con base en su lote o grupo de genotipificación (No. 6), progenitor (n= 18), país de origen (n= 6) y caso de GPFT (n= 5). Los diversos lotes de genotipificación no se agruparon en absoluto, lo que indica que el tiempo de genotipificación no afectó a los genotipos individuales (no se muestran datos). Por el contrario, se ve una fuerte agrupación cuando se identifica a los individuos por su progenitor y por el país de origen de éste (Figura 1). Los progenitores 1 y 5 están particularmente distanciados de los demás, mientras que se tiende a agrupar a los originarios de Canadá, Italia y Estados Unidos, aunque por separado según su origen. Posteriormente se clasificó a los individuos por su valor de GPFT en incrementos de 500, y no se observó ninguna agrupación con base en esas categorías asignadas.

Figura 1 Diagrama de dispersión de los valores del análisis de componentes principales (ACP) basados en los genotipos SNP individuales. A) Valores del ACP agrupados por progenitor. B) Valores del ACP agrupados por origen del progenitor. C) Valores del ACP agrupados por Productividad, Funcionalidad, Clases de índice de selección genética de tipo (GPFT) 

Coeficientes de consanguinidad

Se calculó la estimación desarrollada por Wright del coeficiente de consanguinidad F _IS para cada individuo. La mayoría de los animales (n= 31) exhibieron un F _IS negativo, mientras que la minoría (n= 13) tuvo coeficientes positivos (Figura 2). Los valores más altos y más bajos del F _IS fueron 0.057 y -0.077, respectivamente. El F _IS promedio se dio en -0.018, lo que provocó un aumento de la heterocigosidad debido a un esquema de exogamia utilizado por el ganadero. La mayoría de los individuos tuvieron coeficientes F _PED de entre 0.050 y 0.070 (n= 31); los valores oscilaron entre 0.044 y 0.116. En su totalidad, la estimación del coeficiente de consanguinidad genética F _ROH fue más alta que los coeficientes de consanguinidad calculados con base en el pedigrí. El F _PED promedio fue de 0.064, mientras que el F _ROH medio >1 Mb fue igual a 0.083.

Figura 2 Regresión del coeficiente de consanguinidad individual. A) Regresión del coeficiente de consanguinidad calculado por pedigrí (F _PED) sobre el coeficiente de consanguinidad calculado sobre el tramo de homocigosidad (F _ROH). R²= 0.205; la línea roja indica la línea de regresión (F _ROH = 0.042 + 0.621 * F _PED ). B) Regresión del F _PED sobre el F _IS. R²= 0.214; la línea roja indica la línea de regresión. (F _is= -0.077 + 0.913*F _PED ) 

Tramos de homocigosidad

Habiéndose establecido el criterio de los ROH como de 1 Mb y un mínimo de 30 SNP, el software SVS identificó un total de 1,950 tramos dentro de la población, con una longitud de entre 1 y 22 Mb (Figura 3). Los 44 animales exhibieron ROH, con un número promedio de ROH por animal de 44. El número máximo de ROH para un individuo fue 64, mientras que el mínimo fue 25. La longitud promedio de los ROH fue 4.66 Mb, y la mayoría de los ROH se dieron en el rango de 4-8 Mb (Cuadro 1). BTA 10 tuvo el número máximo de ROH por cromosoma (122 tramos), y BTA 27, el mínimo (24 tramos). El ROH más largo se dio en BTA 10, con una longitud de 22 Mb, a diferencia de otros resultados que identificaron el ROH más largo en BTA 8^13-15. El número promedio de SNP que cayeron en una ROH fue consistente entre las categorías de longitud del ROH, pues osciló entre 42 SNP (<2 Mb) y 153 (>16 Mb). Al parecer, la longitud de los ROH fue relativamente proporcional al tamaño de los cromosomas, pues los tramos más largos se presentaron en los cromosomas más largos.

Figura 3 Número de Tramos de Homocigosidad (ROH) por clase de longitud  

Se identificaron las regiones genéticas más comúnmente asociadas a los ROH seleccionando los primeros 1 y 5 % de los SNP más frecuentemente observados (Figura 4, Cuadro 2). La incidencia de los tramos comunes por SNP indicó que la distribución genética de los ROH no fue uniforme en todos los cromosomas. Se identificaron los loci de caracteres cuantitativos (QTL) correspondientes con las regiones de homocigosidad que alberga el primer 5% de los SNP utilizando la Base de datos de loci de caracteres cuantitativos (QTL) de animales (AnimalQTLdb) (Cuadro 2)¹⁶.

Figura 4 Incidencia de SNP en ROH identificados con SVS. las líneas rojas y azules indican el límite adoptado para el 1% y 5% máximos, respectivamente  

Análisis de componentes principales

El ACP es una herramienta útil que permite a los ganaderos identificar a los individuos genéticamente diferentes dentro de su hato con base en los genotipos. De hecho, la representación gráfica de los individuos es una herramienta inmediata fácil de interpretar que no requiere de ninguna destreza específica por parte de los ganaderos, salvo el concepto de que los puntos cercanos son más similares, y los distantes, diferentes. Es posible identificar a las hembras bien diferenciadas en este hato, sobre todo por su progenitor, si bien existe un grupo que parece ser genéticamente similar pero que procede de progenitores diversos. Los sementales progenitores 1 y 5 son responsables de los grupos marginales que vemos, y sus derivaciones son Canadá e Italia. Por lo tanto, como lo propuso el ganadero que participó en este estudio, esta ilustración es benéfica para determinar el análisis a posteriori de sus estrategias de apareamiento y si los sementales que eligió están contribuyendo a sus intentos de limitar la reducción de la variabilidad genética del hato. El ACP también es útil para la selección de los sementales, puesto que el ganadero puede verificar si los sementales provenientes de determinados países influyen o no en la distribución genética en la población. Asimismo, es posible visualizar cómo los valores genómicos, en este caso de GPFT, coinciden con diferentes individuos. Los GPFT de valor similar no se agruparon, lo que indica que ni el progenitor ni su origen influyeron en los GPFT de las hembras de este hato. Por ejemplo, el semental 1 aportó a los animales valores de valores de GPFT de entre 1,500 y 3,000, y el semental 5, valores de entre 1,000 y 2,500.

Coeficientes de consanguinidad

El resultado obtenido aquí concuerda con otro estudio realizado en ganado Holstein italiano, donde el F _PED fue de 0.044 y el F _ROH fue significativamente diferente de 0, con un r igual a 0.453 (P<0.01). La práctica de una selección artificial intensa y precisa a lo largo de muchos años ha dado como resultado índices elevados de ganancia genética; sin embargo, las altas tasas de ganancia se han visto acompañadas de un gran aumento de la endogamia¹⁷. Además, a medida que se reducen los tamaños de la población, la probabilidad de aparearse entre parientes consanguíneos aumenta, sobre todo en hatos pequeños o razas locales¹³. Los productores han dependido en gran medida de los pedigríes para calcular el coeficiente de consanguinidad dentro del hato, pero esta cifra sólo puede crecer con cada generación. La interconexión entre pedigríes da una proporción esperada, no real, de la identidad genómica por ascendencia entre individuos, y se anticipa que las estimaciones basadas en genotipos proporcionan una mayor exactitud respecto a dicha interconexión¹⁸. En la práctica, la información del pedigrí es difícil de obtener, puede no ser confiable, y rara vez es evaluada en cuanto a la consanguinidad surgida de antepasados comunes¹⁹. Cuando examinamos los coeficientes basados en pedigrí de este hato, consideramos que los individuos procedían de hasta diez retrocruzamientos. Sin embargo, en ausencia de datos del pedigrí, se puede utilizar la extensión de un genoma bajo ROH para inferir aspectos de la historia reciente de la población, incluso a partir de relativamente pocas muestras^3,9. McQuillan et al⁹ revelaron que el F _ROH esa fuertemente correlacionado con el coeficiente de consanguinidad estimado a partir del pedigrí (e= 0.86), y se ha visto que los valores del F _ROH son preferibles al F _PED, puesto que se los considera un reflejo más realista del nivel de consanguinidad^15,19. Sin embargo, es importante señalar que el establecimiento de los parámetros utilizados para derivar los ROH es esencial para explicar correctamente los efectos de la densidad de los SNP²⁰. En este conjunto de datos percibimos una relación lineal entre el F _ROH y el F _PED. El coeficiente de correlación de Pearson proporciona una correlación positiva con un r= 0.453. Nuestra correlación concuerda con la de otros estudios que utilizan ganado genotipificado con una densidad similar^15,20 pero más baja que la de otros ganados genotipificados a una densidad media o alta^3,5. Es posible, entonces, que el coeficiente de correlación se vea parcialmente afectado por el pequeño número de animales en este estudio, así como por el uso de un chip SNP de baja densidad. Además, el F _ROH fue mayor que el F _PED promedio en 35 animales, lo que implica que los coeficientes de consanguinidad pasados en pedigrí podrían ser subestimados.

Los valores bajos generales indican un nivel bajo de consanguinidad en la población y un número relativamente alto de individuos en un estado heterocigoto. Esto puede estar relacionado con el resultado de la estrategia de apareamiento específica implementada por el responsable del hato de la Universidad, coautor de este trabajo, puesto que él señaló que su meta era incrementar la variabilidad genética y mantener un nivel de endogamia bajo. Por ello, esta información genética está proveyendo una retroalimentación única sobre los esfuerzos exitosos para mantener el nivel de endogamia dentro de esta población. Las razas lecheras en particular han sido objeto de una selección más intensiva y pueden estar relacionadas con el reciente aumento de apareamientos endogámicos que resulta del uso de un número pequeño de sementales con altos méritos genéticos para la inseminación artificial⁵. Por este motivo es importante entender la consanguinidad que se da al nivel genético, así como determinar si la variabilidad genética dentro del propio hato está siendo bien mantenida o no.

Tramos de homocigosidad y genes asociados

Los QTL más comúnmente observados dentro de estas regiones reportadas en la Tabla 2 incluyeron el porcentaje de proteína en la leche, el porcentaje de grasa de la leche, la facilidad para parir, el tipo de PTA y la estatura. Después de alinear los SNP con la referencia BTA U 5.0.1 se identificaron 260 genes anotados como consistentes con el primer 5% de los SNP, mientras que 37 genes permanecieron en el primer 1%. Los genes del primer 1% residían en los cromosomas 5 y 10; no se identificaron genes anotados con SNP en BTA 16. Posteriormente, STRING identificó redes entre estos genes, de los cuales 142 formaban parte de alguna especie de red (Figura 5). A éstas se les practicó también una ontología de genes en PANTHER. A los genes dentro del primer 5% correspondieron a 12 procesos biológicos (Figura 6) y a 70 vías (no se muestran datos). La vía que incluyó el mayor número de genes (n= 12) fue la vía del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina, mientras que otras vías que compartían genes eran la vía de señalización mediada por el receptor tipo 5HT2, la vía de señalización de endotelina, la vía de señalización de inflamación mediada por quimoquina y citoquina, la vía de señalización de integrina y la vía de señalización del sitio de integración de tipo sin alas (WNT). Los procesos biológicos respectivo que más comúnmente se compartieron entre genes (n= 16) fueron “procesos celulares”, específicamente la comunicación entre células, mientras que otra porción grande (n= 79) desempeña un papel en los procesos metabólicos (Figura 6).

Figura 5 Red de genes que corresponden con SNP en el primer 5% de incidencia de tramos comunes obtenida de la base de datos en línea STRING 

Figura 6 Proceso biológico de genes correspondiente al 5% del top de incidencia de corridas comunes con SNP 

Las prácticas de selección intensa de sementales, de la inseminación artificial y de la transferencia de embriones han ocupado un lugar muy destacado en algunas razas, reduciendo los tamaños efectivos de las poblaciones y la diversidad genética y afectando los niveles de homocigosidad³. Los efectos nocivos asociados con el incremento de la homocigosidad que surge de la consanguinidad tienen una predisposición a reducir las ganancias genéticas, lo que implica una clara pérdida de la variabilidad genética¹⁵. Los ROH permiten comprender mejor esta variabilidad, y son segmentos homocigotos continuos que resultan comunes tanto en los individuos como en las poblaciones. La capacidad de estos segmentos de darnos un atisbo de los eventos genéticos de una población los convierte en una herramienta útil que proporciona información sobre la evolución de la población a través del tiempo, permitiendo a los productores mantener la diversidad y la idoneidad en su raza de ganado²¹.

Además, los ROH brindan información útil sobre las relaciones genéticas entre individuos, ayudando a minimizar el índice de consanguinidad y a exponer las variables nocivas presentes en el genoma²¹. Los ROH largas surgen como resultado de una endogamia reciente, mientras que los ROH más cortos pueden indicar efectos ancestrales más distantes, tales como los efectos fundadores de la raza³. De hecho, la presencia de segmentos de más de 10 Mb de longitud es trazable a la consanguinidad con antepasados comunes recientes de hace sólo cinco generaciones²², y el 66 % de los animales comprendidos en este estudio presentaron por lo menos un ROH de más de 10 Mb. Esto significa que la mayoría de los individuos de esta población se derivaron de antepasados comunes recientes y son el producto de una endogamia reciente, en conformidad con lo que vemos por sus coeficientes de consanguinidad.

También se identificaron los ROH como un medio de facilitar la comprensión de las regiones genéticas conservadas en el seno del hato. Los ROH de menos de 5 Mb se caracterizaron recientemente como cortos²³. Estos ROH cortos se pueden relacionar con un efecto de selección positiva ancestral más distante debido a eventos de recombinación generados por la ruptura de los cromosomas largos en segmentos por meiosis repetidas que, por ende, reduce su tamaño^13,24. La menor densidad de los SNP, como la que se utilizó en este estudio, tiende a inflar los ROH³. Dado que vemos principalmente ROH cortos en este hato (ROH promedio=4.66 Mb), incluso con la inflación potencial, podemos decir con confianza que dentro de esta población se ha mantenido bien el nivel de consanguinidad, el cual es bajo y reciente, a juzgar por la presencia de ROH largos en la mayoría de los individuos y, a la vez, de ROH cortos en general en el hato. Este resultado se identifica con otro estudio que estableció que el ganado Holstein italiano muestra un número elevado de segmentos de ROH relacionados con una consanguinidad antigua¹³.

Se encontró que los genes que se localizan en las regiones homocigotas extendidas correspondientes a los SNP en el primer 5% de los tramos comunes intervienen en gran medida en los procesos de supervivencia. Esto indica que en los esfuerzos de selección se han mantenido los procesos biológicos básicos, como la comunicación y el metabolismo celulares. Sin embargo, los QTL dentro de estas regiones genéticas demuestran que éstas coinciden con facetas benéficas de la producción tales como el porcentaje de proteína en la leche, el porcentaje de grasa de la leche y la facilidad para parir, aunque es posible que éstas sean específicas de la raza Holstein-Friesian debido a rigurosos esfuerzos de selección a lo largo del tiempo. Además, los genes del primer 1% (BTA 5, 10 y 16) también se correlacionaron con los procesos de supervivencia y de desarrollo. Entre estos procesos se incluían la proliferación de las células (GNG2, ADAM10, ALDH1A2), la función metabólica (SCG5, PTGDR, RORA, MYO1E, LIPC, ALDH1A2, MYO5A, GALK2), el desarrollo de los órganos (ANKS1B, MYO1E, CCNB2, ALDH1A2, PRTG, MAPK6) y la inmunidad (NEDD4). No se identificaron genes en BTA 16 debido a una mala anotación; pero varios genes en los cromosomas BTA 5 y 10 han sido bien caracterizados en diferentes fenotipos en el ganado. La proteína de unión al ADN PARP1 (también conocida como PARPBP) en los BTA 5 y 10 ha sido asociada con el porcentaje de grasa en la tercera etapa de la lactancia en el ganado Jersey, mientras que la repetición de anquirina y el dominio con motivo alfa estéril 1B (ANKS1B), también en BTA5, ha sido asociado con la incidencia de encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en familias de ganado^25,26. En tanto que se ha visto que los genes en el cromosoma BTA 10 intervienen en gran medida en el metabolismo de la grasa y la ingesta de pienso. Por ejemplo, se ha vinculado la secretogranina V y la subunidad gamma 2 de la proteína G (GNG2) con la regulación de los procesos del metabolismo hormonal que intervienen en la ingesta de pienso en el ganado Holstein^27,28, mientras que se encontró que el factor de transcripción 12 (TCF12) está asociado a los rasgos lípidos y organolépticos en las razas europeas Bos taurus²⁹. También se encontró la subunidad GNG2 en una región asociada con la susceptibilidad a la infección por Mycobacterium avium subespecie Paratuberculosis (Map)³⁰. Por último, se identificó que el protema 6 que contiene dominio FERM 6 (FRMD6) se ubica en una región de selección positiva en la raza N’Dama³¹. Las regiones en los cromosomas BTA 10 y 16 que albergan el principal 1% de los SNP también coincidieron con otros estudios. Los estudios de ganado Holstein fueron particularmente similares, con una selección positiva al nivel de los cromosomas BTA 10 en 50-560 Mb y un QTL putativo identificado en 34.7-56.9 en el cromosoma BTA 10 para la cuenta de células somáticas y la tasa de no retorno a 90 días (efecto paterno)^20,32,33. Otro estudio identificó una elevada proporción de ROH en BTA 16, mientras que otro más encontró selección en las regiones 24.7-26.7 y 26.5-28.5 en BTA 16^3,20.