El Huanglongbing (HLB), o Dragón Amarillo de los Cítricos, es considerada la enfermedad más devastadora de los cítricos a nivel mundial (^{Ding et al., 2015}). El agente etiológico es una α-proteobacteria gram negativa y actualmente se conocen tres especies que infectan cítricos: Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Candidatus Liberibacter africanus (CLaf) y Candidatus Liberibacter americanus (CLam) (^{Achor et al., 2020}; ^{Andrade et al., 2020}). En México, los daños más severos de esta enfermedad se presentan en limón mexicano (Citrus aurantifolia) y limón persa (Citrus latifolia), mientras que en otras regiones de Asia y África y en países como Brasil, EE. UU y Cuba los daños se reportan principalmente en naranja dulce (Citrus sinensis) (^{McCollum et al., 2016}).

La confirmación oficial de la bacteria en las plantas se realiza por PCR-tiempo real, ya que es un método muy sensible y se le considera la herramienta más confiable para su detección. Sin embargo, este método resulta costoso; por lo tanto, se requiere una prueba rápida y confiable para corroborar su presencia en campo. Los métodos inmunoenzimáticos o inmunoensayos como la técnica de enzyme-linked-immuno sorbent assays (Elisa), están basados en la reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), son económicos, rápidos y específicos para detectar bajas concentraciones de Ag o Ac y pueden ser empleados por su sensibilidad para detectar fitopatógenos (^{Fundora et al., 2013}). Los resultados de su aplicación han permitido la elaboración de estrategias de manejo integrado de enfermedades, mejorando la calidad y sanidad de los cultivos, así como su competitividad y rentabilidad (^{Zherdev et al., 2018}).

Se tienen reportes de la presencia de proteínas que pueden ser inmunogénicas y se encuentran localizadas en la membrana externa de los patógenos (^{Bastianel et al., 2005}; ^{Lu et al., 2013}). También son identificadas como antigénicos determinantes o sitios discretos que son reconocidos por los linfocitos B o T a través de sus propios receptores específicos (^{Carrizo et al., 2009}). Estas proteínas pueden usarse para la generación de anticuerpos en animales de sangre caliente, por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue identificar proteínas localizadas en la membrana externa de Candidatus Liberibacter asiaticus, con capacidad antigénica que sirvan de base para el desarrollo de un método inmunoenzimático eficiente y de bajo costo para la detección de esta bacteria en cítricos.

Para el análisis bioinformático de proteínas de membrana externa se utilizó el genoma completo de CLas cepa GX-1 (Acceso Genbank PRJNA158395), reportada por ^{Lin et al. (2013}), en el NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) posteriormente fue analizada en las base de datos del UniprotKB (http://www.uniprot.org) y se obtuvieron las secuencias de aminoácidos de las proteínas de membrana externa codificadas en el genoma de CLas.

La predicción de la función de las proteínas de membrana externa se realizó utilizando el servidor web Predict Protein (www.predictprotein.org/) y el programa Blast2go (Run Blast, Mapping, Annotation, Inter ProScan) (^{Conesa et al., 2005}). Se realizó un alineamiento Muscle de las proteínas seleccionadas basado en codones y se generó un dendograma para determinar su similitud mediante Neighbor Joining, utilizando el software MEGA X. Para la predicción de epítopos se seleccionó a la proteína B8Y674 en virtud de que es repetitiva en el genoma de CLas y se utilizó la base de datos immune epitope and analysis resource (Iedb) (http://tools.immuneepitope.org/tols/bcell/iedb-input), mediante el método Escala de antigenicidad de Kolaskar y Tongaonkar (Eakt).

Se realizó la detección de CLas mediante PCR-punto final a partir del ADN genómico extraído de hojas de limón mexicano (Citrus aurantifolia) con síntomas de HLB. La extracción del ADN se realizó por el método del CTAB optimizado por ^{Rodríguez et al. (2010}) y en las reacciones de PCR se utilizaron los iniciadores diseñados sobre la secuencia del gen Omp que codifica para la proteína B8Y674 (Rodríguez et al., 2018). Los fragmentos amplificados (dos por cada par de primer utilizado), fueron purificados, clonados y secuenciados para su análisis en línea mediante la base de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) en el apartado de Blast.

Se identificaron 53 proteínas de membrana externa (datos no mostrados) y con base en su homología, motivos y dominios, se seleccionaron 12 de estas proteínas (Cuadro 1), de las cuales solamente la C6XHX5 había sido caracterizada previamente como proteína de tolerancia a disolvente orgánico. Con el HhPred/HhSearch (^{Söding et al., 2005}), se obtuvieron predicciones funcionales con probabilidades que oscilaban entre los rangos de 62.5 a 99.2% y con E-valores aceptables (3.3E^-05, 1.4E^-06, 2.5E^-13, 2.8E^-13, 3.5E^-15), obteniéndose alineamientos con resultados significativos para 10 proteínas. En las proteínas C6XGP8 y C6XGU8, se registraron probabilidades de 93.8 y 62.5% así como E-valor de 0.0027 y 1.1 respectivamente por lo que se consideraron resultados no significativos o pocos confiables en sus predicciones (Cuadro 1).

Las anotaciones de los dominios funcionales indicaron predicciones de antígeno de superficie para las proteínas B8Y674, B8Y671, B2KNJ1, J7H0I4, B8Y672, B8Y673, B8Y675, C6XGP8, C6XGU8 y C6XFB8, sugiriendo que presentan capacidad antigénica, C6XHX5, tuvo predicción de tolerancia a disolventes orgánicos y C6XF21 mantenimiento de la integridad de la envoltura celular. El alineamiento múltiple de las proteínas codificadas por el gen Omp (B8Y671, B8Y672, B8Y673, B8Y674 y B8Y675) demostró una identidad entre ellas de 97% (Figura 1).

Figura 1 Dendrograma generado mediante el alineamiento de secuencias de proteínas de membrana externa de CLas. 

La predicción de los epítopos para la proteína B8Y674 permitió obtener ocho epítopos B o T, con una especificidad de 91% (Cuadro 2). La base de datos IEDB determinó que los epítopos FSEVNISQLPANDVSDYVILRVSVKQLSAGSVGIA, RHAVQNYTLSVEDPYFLGSPISAGFD, IPSIYTTLIEHG, y FSSHSISQSIIYNY, han sido evaluados experimentalmente con identidades de 90%, 80%, 80%, y 80% respectivamente (http://www.iedb.org/). Además, reveló que el tipo de célula implicada en la mayoría de los casos fue la célula B. Algunas de las funciones de gran importancia de las células B, es la fabricación de anticuerpos contra antígenos y eventualmente transformarse en células de memoria B después de ser activadas por la interacción con un antígeno (^{Mauri y Bosma, 2012}).

Se amplificaron fragmentos de 1 121 pb y 904 pb respectivamente del gen Omp de CLas que codifica para la proteína B8Y674 a partir del ADN extraído de hojas de limón mexicano con síntomas de HLB utilizando los iniciadores reportados por ^{Rodríguez et al. (2018}). Las cuatro secuencias obtenidas a partir de los fragmentos amplificados presentaron 98% de identidad con secuencias de CLas previamente reportadas en el GenBank (CP019958.1, CP004005.1, KC473159.1, KC473156.1, JQ928886.1, JQ928883.1, JQ928882.1, JN049494.1).

Es importante señalar que las secuencias utilizadas hasta la fecha para la detección mediante ELISA han sido aisladas de cítricos dulces (^{Lu et al., 2013}) o de psílidos portadores de la bacteria (^{Yuan et al., 2016}), a diferencia de las secuencias de nuestro estudio que fueron aisladas de limón mexicano, encontrando cinco variaciones de nucleótidos, corroborando lo mencionado por ^{Tomimura et al. (2009}), quienes reportaron que el gen que codifica para la proteína de membrana externa posee variaciones de nucleótidos que permite diferenciarlas entre ellas. ^{Chen et al. (2010}) señalaron que en el locus OMP la variación se limita a unos pocos SNPs validando los resultados de esta investigación.

Estos datos resaltan el potencial de los hallazgos obtenidos en este estudio con la identificación de antígenos de superficie, a partir de los cuales se puedan obtener anticuerpos específicos que eviten reacciones cruzadas con bacterias diferentes a CLas, en un método inmunoenzimático para la detección temprana del agente causal de la enfermedad HLB de los cítricos.