Introducción

El estrés facilita, deteriora o no influye en las etapas de la memoria en ratas¹-³ y humanos⁴, su efecto interviene en los circuitos cerebrales involucrados⁵,⁶. La respuesta depende de las características del estresor⁷, la duración y naturaleza de la tarea⁸-¹⁰, y factores fisiológicos del sujeto que influyen en las respuestas neuroendocrinas y conductuales¹¹.

El estrés provoca liberación de corticosterona (C) por las glándulas suprarrenales¹²,¹³. Niveles de estrés alto o bajo deterioran la memoria y un nivel moderado la mejora¹⁴. La administración de C puede mejorar¹⁵ o deteriorar la memoria¹⁴,¹⁶,¹⁷, lo que depende de la dosis, la experiencia emocional o la fase de la memoria estudiada¹⁸,¹⁹.

La naturaleza de la tarea es importante. En el estudio de la memoria de procedimiento hemos utilizado dos tareas: la de evitación inhibitoria (EI) y el laberinto elevado en T (LET). En la EI, la administración del choque provoca que los animales aprendan a evitar el estímulo aversivo durante el entrenamiento. Con esta tarea se han estudiado diferentes estructuras cerebrales y la participación de sistemas de neurotransmisión como el colinérgico²⁰,²¹. Anticolinérgicos como la escopolamina administrada intraperitonealmente²² o intraestriatal indujeron amnesia²³. La escopolamina posentrenamiento no produjo amnesia en intensidades de 1 y 1.5 mA; con intensidades de 2 y 2.5 mA produjo amnesia²² y altas intensidades, 2.8 y 3.0 mA, no deterioraron la memoria. Se ha propuesto que con altas intensidades de choque, la actividad colinérgica no es necesaria para la consolidación²⁴. Estudios realizados con agonistas GABAérgicos demostraron quela administración de muscimol indujo amnesia²⁵ y potenció la amnesia inducida por escopolamina, con intensidades bajas²⁶.

Los componentes aversivos de la tarea con el LET fueron comparados con estresores como la restricción de movimiento (R)²⁷, estresor traumático para los roedores²⁸ que activa el eje hipotálamo pituitario adrenal (HPA)²⁷. La exposición pre entrenamiento a 60²⁹ o 15 min de R³⁰ deterioraron la memoria pero no la exposición posentrenamiento³¹. Estas dos tareas son consideradas aversivas por la presencia de los espacios abiertos y el choque, componentes considerados estresores intrínsecos³². La exposición al entrenamiento en LET activa el eje HPA³³ y el choque en EI aumenta la concentración de C³⁰, por lo que los resultados podrían interpretarse como la suma de los estresores intrínsecos más el estresor extrínseco con efecto en el entrenamiento.

La tarea de reconocimiento de objetos (RO) evalúa la memoria declarativa mediante la preferencia por la novedad³⁴,³⁵. Tiene la ventaja de que los ensayos pueden ser modificados para examinar diferentes componentes de la memoria, el efecto del estrés y la liberación de hormonas. Se ha propuesto que carece de estímulos aversivos por no requerir de privación de agua y comida³⁶,³⁷. El objetivo de este trabajo fue evaluar en una tarea de memoria de reconocimiento de objetos, el efecto del estrés por R (15 min) sobre la adquisición y consolidación de la memoria y estudiar la posible activación del eje HPA como consecuencia del entrenamiento de la tarea.

Método

Aparatos

• – Restrictores. Se emplearon contenedores de acrílico cilíndricos (Plas-Labs, Inc™) con hoyos ajustables a la talla del sujeto experimental. Los sujetos fueron restringidos en un cuarto con luz natural durante 15 min.

• – Lector de placas. Para medir la concentración de C se utilizó un lector de placas (H Reader 1 de HLAB), con filtro de 405 a 630 nm y una resolución de 0.0001 de absorbancia.

• – Cámara de reconocimiento de objetos. Se empleó una cámara construida de PVC blanco (100 x 100 x 50 cm), con el piso cuadriculado (10 cm) que permitió colocar los objetos siempre a la misma distancia. Una cámara de circuito cerrado (AVTECH de 4 canales AVTECH AVC792DBKIT) grabó los ensayos de los sujetos con el fin de visualizar y hacer mediciones mediante un software para colección y análisis de datos Observer³⁸.

• – Objetos familiares y novedosos. Se utilizaron legos infantiles de plástico de color azul para los objetos familiares (Fig. 1A) variando el color y la forma para el objeto novedoso (Fig. 1B). La parte interna de los legos se saturaron de acrílico dental con el fin de que pesaran y la rata no los moviera.

• – Tarea de RO. Las sesiones experimentales se realizaron entre las 8:00 y 11:00 h. En los ensayos de entrenamiento se colocó al sujeto en la cámara con dos objetos idénticos (F1 y F2) y se les permitió explorarlos en una prueba de familiarización durante 5 min. La exploración se definió como el acercamiento de los sujetos dirigiendo la nariz hacia los objetos en un rango de 2 cm o cuando olfateaban. Dar la vuelta a/o sentarse sobre el objeto no se consideraron una conducta de exploración³⁹,⁴⁰. El criterio de inclusión en el grupo fue que los sujetos exploraran por lo menos 10 s durante los ensayos de entrenamiento solo en los grupos que no hubieran sido expuestos a tratamiento antes del entrenamiento. En los grupos con tratamiento previo al entrenamiento, se respetaron los tiempos de exploración como efecto de este.

Figura 1 Objetos utilizados en la tarea de reconocimiento de objetos. A: objeto familiar (OF). B: objeto novedoso (ON). 

En el ensayo de prueba después de un periodo de retardo de 24 h posteriores al entrenamiento se expuso a los sujetos a un objeto familiar (OF) y a un objeto novedoso (ON) durante 5 min.

Se registró el tiempo de exploración al objeto novedoso (TN) y al objeto familiar (TF) y se calculó un índice de discriminación para cada sujeto que se expresó como ID = 100 * (TN – TF)/(TN + TF), donde TF = tiempo dedicado a explorar al objeto familiar y TN = tiempo dedicado a explorar al objeto novedoso. El índice de discriminación (ID) mayor a cero, muestra que los animales exploraron más al ON que al OF, por lo que se considera buena memoria, mientras que una proporción cercana a cero indica que los animales exploraron el mismo tiempo a los dos objetos, lo que se considera deterioro de la memoria³⁵,³⁶.

Resultados

En la figura 2A se muestra el tiempo de exploración al objeto novedoso de los diferentes tratamientos. Se observaron diferencias significativas (F [3, 28] = 7.60; p < 0.001) entre los grupos. Los sujetos de los grupos R+RO y RO+R permanecieron menos tiempo explorando el ON (p < 0.01) respecto al que ejecutó la tarea sin R. La administración de C antes del entrenamiento no tuvo efecto. En la figura 2B se muestra el ID, se encontraron diferencias significativas entre los grupos (F [3, 28] = 5.37; p < 0.01); el grupo R+RO difirió de todos los grupos (p < 0.05), mostrando una menor discriminación al ON. Los grupos de RO+R y de C+RO no presentaron diferencias respecto a RO.

Figura 2 Gráficas que muestran a sujetos expuestos a restricción (R) antes o después del entrenamiento (R+RO, RO+R) o de la administración de corticosterona (5 mg/kg) (C+RO). A: media (± EEM) del tiempo de exploración al objeto novedoso (TN). B: media (± EEM) del índice de discriminación (ID) en la tarea de RO.*p < 0.01.†p < 0.05. 

La prueba t de Student mostró que el grupo que ejecutó la tarea de RO sin ningún tratamiento exploró más el ON (t [7] = 3.53; p < 0.01). Hubo menor exploración de los objetos en los grupos que fueron sometidos a R o que recibieron C. No obstante, se observó que en el grupo de R+RO el TN y el TF fueron similares (t [7] = 0.2; p = 0.843). La exploración al ON fue mayor en los grupos que recibieron R después del entrenamiento o C (t [7 = 2.93; p < 0.05) (Fig. 3).

Figura 3 Medias (± EEM) del tiempo de exploración al objeto novedoso (TN) o al objeto familiar (TF) en sujetos sin restricción (RO), expuestos a restricción preentrenamiento o posentrenamiento (R+RO, RO+R) o 5 mg/kg de corticosterona (C) preentrenamiento (C+RO) que realizaron la tarea de RO.*p < 0.01 frente a TN de su grupo.†p < 0.05 frente a TN de su grupo. 

La concentración de C en plasma presentó diferencias significativas entre los grupos (H [3, n = 31] = 15.727; p < 0.001). Los sujetos que fueron sometidos a R o a la administración de C antes del entrenamiento mostraron mayor concentración de C plasmática (p < 0.05), mientras que en el grupo expuesto a R posentrenamiento la concentración fue parecida al grupo RO (Fig. 4).

Figura 4 Medianas de la concentración de corticosterona (C) en plasma de sujetos que realizaron la tarea de reconocimiento de objetos sin restricción (RO), expuestos a restricción preentrenamiento o posentrenamiento (R+RO, RO+R) o 5 mg/kg de C preentrenamiento (C+RO).*p < 0.05 frente al grupo de RO. 

Finalmente, la figura 5 muestra la concentración de C en plasma de los grupos expuestos al entrenamiento en RO o a la R 15 min; se observaron diferencias (H [4, n = 30] = 13.21; p < 0.05). Los grupos que recibieron R o el entrenamiento en RO y que fueron sacrificados inmediatamente después mostraron mayor concentración de C respecto al grupo intacto (p < 0.05), no así los que fueron sacrificados a las 24 h, lo que denota que el entrenamiento en la tarea de RO estimula al eje HPA de forma similar a la exposición a R cuando se registra inmediatamente.

Figura 5 Medianas de la concentración de corticosterona (C) en plasma de ratas sometidas a restricción (R15) o entrenamiento en reconocimiento de objetos (RO) sin restricción (I) (ERO-0 y ERO-24), sacrificadas a las 0 o 24 h.*p < 0.05 frente a I. 

Discusión

Nuestros resultados demostraron deterioro en la adquisición de la memoria de reconocimiento de los sujetos expuestos a R antes del entrenamiento, evaluados en la fase de prueba 24 h después, según el TN y el ID, parámetros empleados en esta prueba. Lo anterior es consistente con lo reportado en otros estudios⁴¹ donde demostraron que el efecto de R en RO provocó deterioro cuando se aplicó antes del entrenamiento y la fase de prueba se realizó en intervalos de 3 h, pero no cuando se realizó la prueba 5 min después. Efectos similares se encontraron en este laboratorio con la exposición a 15 min de R preentrenamiento y una demora de fase de prueba de dos horas que también provocó deterioro de la memoria de RO⁴². Como puede observarse para esta tarea las demoras entre la fase de entrenamiento y la prueba son determinantes para poder evaluar el ID y el TN⁴³, ya que los intervalos largos pueden influir en la reducción del ID³⁹; sin embargo, con esta tarea se pudieron observar efectos del estrés 24 h después. La exposición a R antes del entrenamiento se ha observado en otras tareas como LET, ya que 15 o 60 min de R ocasionaron deterioro de la memoria cuando el entrenamiento se realizó inmediatamente después²⁹,³⁰.

En la consolidación de RO no se observó un efecto significativo en el ID, lo que implica que los sujetos discriminaron en forma similar al grupo que realizó la tarea sin R. Cuando se compararon TN y TF durante la prueba, los sujetos del grupo RO+R visitaron más el ON, pero exploraron menos que el grupo sin R, esto puede estar relacionado con un efecto de ansiedad inducido por la caja utilizada para desarrollar la tarea, ya que los sujetos muestran menor tiempo de exploración. El efecto de R sobre la consolidación evaluado con el ID, coincide con los resultados obtenidos en otros estudios con 60 min de R precedidos por el entrenamiento en RO en ratones².

Los sujetos a los que se les administró C preentrenamiento no presentaron deterioro de RO; efectos similares se han reportado en una tarea de alternación espacial¹⁸. La concentración en plasma medida 24 h después en los grupos que realizaron la tarea de RO aumentó solo en los grupos que fueron expuestos a R o C preentrenamiento. Esto implica que la sola elevación de C no es suficiente para generar cambios en la memoria de RO y aunque la concentración es similar parece que el efecto en la memoria dependió del momento de la presentación de la R.

Hay tareas que por sus características aversivas generan activación del eje HPA durante el entrenamiento³¹,³³. En diversos estudios que utilizan la tarea de RO para evaluar la memoria emplean una caja cuadrada o rectangular, esta misma tarea se ha utilizado como campo abierto para evaluar la respuesta de ansiedad⁴⁴,⁴⁵.

El efecto del estrés por R en la adquisición de la memoria en RO se puede explicar por el estado emocional del animal durante el entrenamiento⁴⁶. Existen estudios que relacionan la presentación de estresores como la restricción, cercanos a la fase de la adquisición con la expresión diferencial de receptores a glucocorticoides bajos y receptores a mineralocorticoides altos en hipocampo, que pueden generar alteración en el procesamiento de la información⁴⁷. En nuestros resultados es probable que el efecto de la R se sume al estrés producido durante el entrenamiento en RO y que ambos modifiquen la codificación de la información emocional en las estructuras cerebrales involucradas durante la adquisición⁴⁸.

Los resultados obtenidos en el ID y el TN sugieren que para que ocurra deterioro de memoria se requiere que los sujetos sean expuestos a la suma de factores estresantes; en este caso el estrés extrínseco producido por la R e intrínseco ocasionado por el entrenamiento en RO. En estas condiciones es probable que se modifique el estado emocional durante el entrenamiento en RO y sensibilice el eje HPA, de tal forma que durante la exposición en la sesión de prueba de RO se favorezca la liberación de C⁴⁹.

La cercanía entre ambos estresores es fundamental, porque en otros estudios, cuando se administraron 60 o 75 min de R antes del entrenamiento en RO, no se vio efecto en la memoria,² tampoco 60 min de R aplicados 24 h antes en la tarea de alternación espacial tuvieron efecto¹⁸.

En el presente estudio se observó mayo concentración de C en los animales evaluados inmediatamente después del entrenamiento, respecto a los evaluados 24 h después. Los resultados muestran que el entrenamiento en la tarea de RO activa la respuesta de estrés en los periodos inmediatos a la tarea y se comporta como un estresor que se restablece por retroalimentación negativa, ya que a las 24 h la concentración de C vuelve a condiciones basales.

Aunque los sujetos fueron habituados a la cámara 24 h antes del entrenamiento durante 10 min, la reexposición a la cámara de RO provocó activación del eje HPA el día del entrenamiento. El animal en el entrenamiento se enfrenta a dos objetos similares que son extraños o novedosos para él, la liberación de C es un índice importante de estrés en ratas y sugiere que el confinamiento en un ambiente nuevo es estresante⁵⁰. La respuesta del sujeto a una cámara que durante la habituación estaba vacía y durante el entrenamiento se expone a dos objetos, implica un nuevo contexto, y es probable que esta exposición le provoque activación de la atención, la ansiedad y de factores relacionados con la respuesta de estrés como la liberación de glucocorticoides⁴¹,⁴².

Ennaceur³⁹ considera que la tarea de RO se realiza en bajas condiciones de estrés y otros autores señalan que la habituación al contexto experimental reduce la respuesta de agitación⁵¹. Sin embargo, los resultados de nuestro estudio indican lo contrario, ya que la situación emocional del sujeto persiste en el entrenamiento de la tarea de RO, lo que permite disociar el estrés intrínseco, inherente a la tarea o situación de aprendizaje³², ya que la exposición solo al entrenamiento es comparable al efecto ocasionado por la R.

Conclusiones

Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que 15 min de R antes del entrenamiento en RO deterioran la memoria declarativa a las 24 h y desencadenan la liberación de C en plasma. La inyección de C pre entrenamiento en dosis de 5 mg/kg reproduce las concentraciones plasmáticas bajo estrés, pero no tiene efecto sobre la memoria. Se demostró el efecto estresor del entrenamiento de la tarea de RO.