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Introducción
Desde que Köhler y Milstein desarrollaron los anticuerpos monoclonales (Köhler & Milstein, 1975), su aplicación ha sido ampliamente _I explorada en la identificación directa y/o indirecta de moléculas blanco, desarrollo biotecnológico, diagnóstico clínico e inmunoterapia, lo que manifiesta el impacto revolucionario de su descubrimiento para la humanidad. Sin embargo, a pesar de existir anticuerpos monoclonales aprobados para su uso en humanos (Singh et al., 2018), algunas características inherentes a su estructura como el tamaño, ha dificultado su aplicación terapéutica en áreas como el cáncer, debido a su baja diseminación en el tejido tumoral, el desarrollo de anticuerpos tipo HAMA (por el inglés Human Anti-Mouse Antibodies), baja estabilidad estructural en condiciones adversas y alto costo en su producción, han incentivado la búsqueda y desarrollo de nuevas alternativas.
El descubrimiento realizado por el grupo de Hamers-Casterman en 1993, en el que por serendipia encontraron anticuerpos compuestos únicamente por cadenas pesadas, presentes en el suero de Camelus dromedarius, seguido por la identificación de anticuerpos similares en el suero de Ginglymostoma cirratum más conocidos como tiburón nodriza (Greenberg et al, 1995), abrió la puerta a un panorama no explorado, puesto que la región de reconocimiento antigénica de estos anticuerpos, está formada por un dominio variable perteneciente a cada cadena pesada.
El porcentaje de este tipo de anticuerpos varía en función de las especies que los desarrollan de manera natural, en camellos se ha reportado que representan entre el 50 y el 80% y en tiburones de 0.1 a 1% del total de los anticuerpos. Las funciones que se les han atribuido son el reconocimiento de algunos virus y el reclutamiento celular (Muyldermans, 2013). Sus dominios variables son definidos como el formato de reconocimiento natural más pequeño que existe. Estos dominios comparten y difieren en algunas características estructurales en función de su origen, por esta razón, se han establecido nomenclaturas para su identificación. Los dominios variables de la cadena pesada de anticuerpos convencionales (humanos y de ratón tipo IgG), son reconocidos como VH (del inglés Variable Heavy), por otro lado, a los derivados de anticuerpos de cadena pesada, presentes en tiburones, se les conoce como V-NAR (del inglés Variable New Antigen Receptor) y a los presentes en camélidos, como VHH (del inglés Variable Heavy from Heavy Chain Antibodies) (Muyldermans, 2013). Estos últimos son más conocidos como Nanobodies (Nanoanticuerpos, Nac), nombre adjudicado por Ablynx, una bio-farmacéutica de SANOFI dedicada al desarrollo de este formato de anticuerpo ablynx.com/our-company/overview/ (Jovčevska & Muyldermans, 2020).
Los Nac se caracterizan por su tamaño reducido, solubilidad, estabilidad y especificidad, lo que los convierte en una atractiva opción para su desarrollo y aplicación en diversas áreas, desde investigación básica hasta la evaluación de su potencial terapéutico. Esto representa una alternativa o complemento para los anticuerpos convencionales.
Nanoanticuerpos: estructura y propiedades
Estructura
A diferencia de la estructura heterodimérica de la inmunoglobulina tipo IgG convencional, que consiste en 2 cadenas pesadas idénticas con 4 dominios y 2 cadenas ligeras idénticas con dos dominios y un peso de ~150 kDa (Padlan, 1994); los anticuerpos de cadena pesada tienen una estructura homodimérica en ausencia de cadenas ligeras, con dos dominios constantes (CH2-CH3) en ausencia del dominio CH1 en camélidos y cinco dominios constantes en tiburones, con un peso de ~90 kDa (Muyldermans, 2013; Nuttal et al., 2001) (Figura 1).
Figura 1 Esquema de anticuerpos convencionales y anticuerpos de cadena pesada. A) Anticuerpos tipo IgG heterodímero compuesto por dos cadenas pesadas (CH1, 2, 3 y un VH) y dos cadenas ligeras (CL1 y VL) y la región de reconocimiento antigénico (VH y VL). B) Anticuerpos de cadenas pesadas-homodímero (CH2,3) y la región de reconocimiento antigénico (VHH). C) Nuevo receptor antigénico de Inmunoglobulinas NRA-Ig-homodímero de dos cadenas pesadas (CH1-5) y la región de reconocimiento antigénico (V-NAR). D) fragmento de reconocimiento antigénico (CH1-CL1 y VH-VL) y fragmento variable de cadena sencilla (VH-VL). E) Dominios variables de reconocimiento. Abreviaturas: CH: Domino constante de cadena pesada, CL: Dominio constante de cadena ligera, V H/L: Dominio variable, VHH: Dominio variable de anticuerpo de cadena pesada, V-NRA: Dominio variable del nuevo receptor antigénico. Elaboración personal ("Creado con Biorender.com").
Su región de reconocimiento antigénico, consiste únicamente en un dominio variable por cada cadena con un peso ~15 kDa. Tienen cualidades estructurales únicas en función de su origen, por ejemplo, la presencia de 9 cadenas tipo Beta en camélidos y 7 en tiburones. Su capacidad de reconocimiento a pesar de tener un tamaño casi 10 veces menor a un anticuerpo convencional, ocurre gracias a la presencia de regiones determinantes de complementariedad, más conocidas como CDRs (del inglés Complementarity Determining Regions), donde también se han evidenciado diferencias, siendo 3 para camélidos y 2 para tiburones por cada dominio, pero en ambos casos CDR1 y 3 tienen mayor longitud y variabilidad. El CDR3 de los nanoanticuerpos tiene 6 y 4 residuos de aminoácidos adicionales con respecto a los dominios de cadena pesada de los ratones y humanos respectivamente. Debido a estas condiciones, un puente disulfuro adicional entre CDR1 y CDR3 está presente y brinda estabilidad a la estructura. Esta interacción se encuentra ausente en los anticuerpos convencionales (Govaert et al., 2012; Stanfield, Dooley, Verdino, Flajnik & Wilson, 2007).
Estas características les brindan una superficie suficiente para reconocer antígenos de forma similar a los fragmentos de reconocimiento de cadena sencilla compuestos por los dominios variables de cadena pesada y ligera (Siontorou et al., 2013).
En análisis de secuenciación, se ha identificado la sustitución de los residuos de aminoácidos hidrofóbicos conservados en los dominios variables de los anticuerpos convencionales, por residuos de aminoácidos de naturaleza hidrofílica. Estos cambios son adjudicados a la ausencia de la cadena variable ligera (Muyldermans, 2013), las sustituciones y posiciones de mayor importancia son: valina (42) por fenilalanina/tirosina, glicina (49) por ácido glutámico, leucina (50) por arginina y triptófano (52) por glicina (Muyldermans, 2013; Atarhouch, Saldanha, Barbosa & Hamers, 1994; Harmsen et al., 2000).
Todos estos cambios de plegamiento y de secuencia, les brindan mayor solubilidad, además, dan lugar a una estructura alargada o esferoide relacionada con una mayor exposición del lugar específico de unión del anticuerpo con el antígeno, que aunado a su reducido tamaño, facilitan el reconocimiento de epítopos antigénicos que son de difícil acceso para los anticuerpos convencionales.
Propiedades de los Nanoanticuerpos
A pesar de su tamaño, tienen capacidad de unión a una amplia variedad de epítopos con afinidades reportadas en rangos de nanomolar (Sockolosky et al., 2016; Valdez-Cruz et al., 2021), se caracterizan por tener estabilidad conformacional, tolerancia térmica y a diferentes valores de pH (Cortez-Retamozo et al., 2004; Wang et al., 2014). Cuentan con la capacidad de replegarse después de estar expuestos a condiciones extremas como presión y agentes caotrópicos, conservando su solubilidad y capacidad de reconocimiento (Dumoulin et al., 2002).
Se ha evaluado su aplicación en especies diferentes a la de su origen, por ejemplo: en modelo murino de cáncer e infección parasitaria, con resultados prometedores (Cortez-Retamozo et al, 2004; Baral et al, 2006).
Su homología con los dominios variables de la cadena pesada de origen humano es alrededor del 95% (Klarenbeek et al., 2015), además, la construcción de anticuerpos humanizados es otra estrategia que busca incrementar la posibilidad para una aplicación terapéutica (Vincke et al., 2009). La cristalización de estas moléculas ha permitido dilucidar el tipo de unión entre la molécula blanco y los Nac, y concluir que además de tener la capacidad de reconocimiento, tienen el potencial para ser usados como herramientas de estabilización estructural y capacidad neutralizante (Korotkov, Pardon, Steyaert & Hol, 2009; Wrapp et al, 2020).
Su estructura monomérica les permite reconocer a los antígenos; sin embargo, es posible obtener estructuras multiméricas mediante técnicas de biología molecular aumentando su avidez y tiempo de vida media, por ejemplo, el formato bivalente permite incrementar el área de reconocimiento para antígenos multiméricos (Zhu et al, 2010) y el formato bi-específico para reconocer a dos secuencias antigénicas diferentes de manera simultánea (Els Conrath, Lauwereys, Wyns & Muyldermans, 2001). También, es posible su conjugación con moléculas como fluorocromos, enzima peroxidasa de rábano, radionúclidos como el galio 68 y nanopartículas entre otros, lo que permite su aplicación hacia propósitos específicos (Cortez-Retamozo et al., 2004).
Desarrollo biotecnológico en su producción
Bibliotecas
Con el fin de obtener Nac con estabilidad y afinidad idóneas para su aplicación, la construcción de bibliotecas o bancos con anticuerpos de diferente naturaleza ha sido ampliamente utilizada (Liu et al., 2018).
El desarrollo y selección de los Nac a partir de bibliotecas inmunes (Figura 2), implica la inmunización con el antígeno o molécula de interés a animales que desarrollen de manera natural anticuerpos de cadena pesada. Los pertenecientes a la familia Camelidae como llamas, alpacas y camellos, son ampliamente usados en la construcción de este tipo de bibliotecas.
Figura 2 Esquema de la construcción de una biblioteca de Nanoanticuerpos usando partículas fágicas. La extracción de sangre puede ser de camélidos previamente inmunizados o no. Se separan los linfocitos B, se extrae el RNAm, y mediante RT-PCR se sintetiza DNAc, el cual se expone a oligos que permiten amplificar al Nac específicamente mediante PCR. Estas secuencias amplificadas son insertadas en vectores de clonación que son utilizados para transformar a E. coli TG1, dando lugar a la biblioteca de Nac. Finalmente esta es transfectada con una partícula fágica que permite el despliegue de Nac unidos a proteínas de la superficie fágica, representando una plataforma idónea para interaccionar con la molécula blanco. Abreviaturas: RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RNAm: RNA mensajero, DNAc: DNA complementario. Elaboración personal ("Creado con Biorender.com").
Una vez que se completa el esquema de inmunización, el RNA mensajero (RNAm) extraído de los linfocitos de la sangre periférica, se transforma en DNA complementario (DNAc), que se usa como molde para amplificar específicamente la región variable de los anticuerpos. Estos fragmentos variables, tienen una longitud aproximada de 120 residuos de aminoácidos y están codificados por una secuencia génica de ~360 pares de bases (pb). Posteriormente, estos fragmentos son ensamblados en vectores de clonación, por ejemplo, fagémidos, que se caracterizan por tener un origen de replicación para el plásmido y el fago, lo que permite el despliegue de los Nac en una superficie fágica al exponerse a un fago adyuvante.
La resistencia a los antibióticos presentes en los vectores de clonación y la presencia de secuencias como las poli-histidinas o c-Myc presente en los Nac, son estrategias de diseño que permiten seleccionar a las clonas transformadas por los fagos e identificar a los Nac solubles respectivamente. Estos vectores de clonación, al actuar como vehículos de las secuencias altamente variables, se utilizan para transformar a bacterias como Escherichia coli TG1 (E. coli TG1), en una biblioteca o banco de Nanoanticuerpos.
Finalmente, mediante la interacción de una partícula fágica adyuvante y la biblioteca presente en bacterias, se induce el despliegue de los Nac en la superficie del fago, dando lugar a una plataforma idónea para la interacción con la molécula blanco (Salvador, Vilaplana & Marco, 2019; Wang et al., 2016). El desarrollo de los Nac a partir de las bibliotecas inmunes, ofrece ventajas como la maduración de la afinidad inmune desarrollada in vivo y un mayor grado de conservación en las secuencias de los fragmentos variables, en comparación con otros formatos, donde se requiere el acoplamiento entre las secuencias génicas de cadenas variables pesadas y ligeras mediante un péptido adicional (Muyldermans, 2013). Sin embargo, las limitantes son: por cada molécula blanco se requiere repetir todo el proceso y la naturaleza no inmunogénica o tóxica de algunas moléculas impide la inmunización.
La construcción de bibliotecas naïve, no inmunes, toma ventaja de la diversidad inmunológica natural del animal sin inmunización; sin embargo, una desventaja es que para obtener una mayor variedad de secuencias en los Nac, es necesario un mayor número de linfocitos, que en cantidad de sangre representa hasta un litro recolectado de diferentes individuos.
Otra alternativa, es la construcción de bibliotecas sintéticas y semisintéticas, construidas a partir de un menor volumen de sangre o de secuencias de anticuerpos (in silico). Mediante el uso de oligos aleatorios en PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction) se modifican las secuencias de los CDRs, en especial la número tres, conservando los marcos de lectura canónicos de los dominios variables de la cadena pesada. Estas bibliotecas o bancos, cuentan con las características estructurales de los Nac y un alto número de secuencias diferentes de CDRs (Goldman et al., 2006). Representando así, una fuente de anticuerpos de un solo dominio y Nac que pueden ser dirigidos contra una amplia gama de antígenos, incluyendo aquellos con los que no es posible realizar una inmunización. Una ventaja es que no se requiere de todo el proceso de construcción para cada molécula blanco. Algunos autores nombran a los anticuerpos derivados de estas bibliotecas "Sybodies" en referencia a que son de origen 100% sintético.
Extrapolando estas estrategias metodológicas, es posible la construcción de bibliotecas de origen humano, aumentando la posibilidad de su aplicación terapéutica (Lee, Iorno, Sierro & Christ, 2007; Li et al, 2020). En la Tabla I se encuentran las principales características de las bibliotecas.
Tabla I Bibliotecas de Nanoanticuerpos.
| Características | Bibliotecas | ||
|---|---|---|---|
| Inmune | Naïve | Semi/Sintéticas | |
| Variabilidad | ~106 | ~109 | ~1012 |
| Inmunización | Sí | No | No |
| Volumen de sangre | 0.05L | >1L | <0.01L |
| Origen humano | No | No | sí |
| Afinidad KD | Rango Nano/pico Molar |
Rango Micro/Nano Molar |
Rango Micro/pico Molar |
| Tipo de antígenos | Limitada | No limitada | No limitada |
L: litro; KD: constante de disociación.
Un factor a tener en cuenta en la construcción de las bibliotecas, es la plataforma seleccionada para permitir la interacción Nac-molécula blanco. Algunas de las opciones más exploradas son las partículas fágicas, las levaduras y los ribosomas como se describe a continuación.
Técnicas de despliegue de Nanoanticuerpos en fagos, ribosomas y levaduras
Existen varias técnicas de selección como: despliegue en fagos (phage display), en levaduras (yeast display), en ribosomas (ribosome display), en bacterias (bacterial display) y la técnica de CIS display, two hybrid, deep sequencing entre otros (Muyldermans, 2021).
La técnica de despliegue en fagos tiene como principio la asociación del genotipo de los bacteriófagos con su fenotipo, es decir, relaciona a la proteína expresada en la cápside viral con el gen que la codifica (Wu, Liu, Lu & Wu, 2016). Es la técnica de selección más utilizada. Descrita en 1985 por el Dr. George P. Smith (Smith, 1985), acreedor en 2018 al premio Nobel de Química por su aporte a la biotecnología. El despliegue de los Nac en las partículas fágicas, se logra mediante su unión a proteínas de superficie, siendo la proteína III (plII) la más utilizada, puesto que se encuentra ubicada en un extremo del fago, lo que permite una óptima interacción entre la molécula blanco y los Nac; su selección es llevada a cabo mediante múltiples rondas de exposición al antígeno (biopanning), y mediante la aplicación de estrategias metodológicas, es posible seleccionar a aquellos Nac-fagos con mayor afinidad. Finalizadas las rondas, se evalúa el reconocimiento de clonas individuales hacia la molécula de interés, con una selección individual para su posterior obtención como Nac soluble (Figura 3A).
Figura 3 Despliegue en fago, levadura y ribosoma. A) Representación del proceso de selección del Nac (biopanning), evaluación, expresión, purificación y caracterización. B) Esquema de despliegue del Nac en el receptor Aga2 de la levadura. C) Complejo del ribosoma-RNAm-VHH. Elaboración personal ("Creado con Biorender.com").
Entre las ventajas del despliegue en fago se encuentran la tolerancia de los fagos a las altas temperaturas y ambientes ácidos, permitiendo seleccionar Nac con resistencia a estas condiciones (Muyldermans, 2013). Sin embargo, una desventaja es que al estar el Nac unido a la proteína III, existe la posibilidad de que ocurra un impedimento estérico (Silva et al., 2011).
Por otro lado, el despliegue en levadura es un sistema que utiliza el receptor de adhesión de α-aglutinina de la superficie de la levadura para desplegar al Nac. Este sistema, usa el par de proteínas Aga1 y Aga2 unidas a la pared celular; la primera se une mediante los β-glucanos, mientras que la Aga2 se une a Aga1 a través de puentes disulfuro. El anticuerpo de un solo dominio se encuentra fusionado a la proteína Aga2. La fusión sigue la vía secretora de las levaduras desde el retículo hasta la membrana plasmática (Salema & Fernández, 2017). Para cuantificar el nivel de expresión del Nac, se utilizan epítopos de hemaglutinina (HA) y de c-Myc que son detectados por anticuerpos (Orcutt & Wittrup, 2010) (Figura 3B). Una ventaja clara de esta técnica, es la posibilidad de caracterizar la constante de disociación (KD) del anticuerpo expresado en su superficie sin necesidad de expresarlo y purificarlo en su forma soluble (Gai & Wittrup, 2007; Salema & Fernández, 2017). Una desventaja es el tamaño relativamente pequeño de sus bibliotecas, comparado con otras técnicas de despliegue, debido a su limitada eficiencia durante la transformación (Orcutt & Wittrup, 2010).
En la técnica de despliegue en ribosoma, el DNAde la biblioteca de interés es transcrito, produciendo RNAm utilizados para una traducción in vitro. Los ribosomas traducen a los RNAm (no tienen un codón de terminación) y sintetizan la secuencia polipeptídica codificada, para formar complejos de RNAm-ribosoma-proteína (Figura 3C) utilizados para una selección por exposición al antígeno de interés. Posteriormente, el RNAm de los complejos seleccionados es liberado y utilizado en una prueba de PCR con transcripción reversa, RT-PCR (del inglés Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), donde se amplifica y prepara para subsecuentes rondas de selección. Finalmente es posible la producción de anticuerpos de un solo dominio altamente específicos capaces de detectar al antígeno de interés (Galán et al., 2016). Al ser un ensayo sin células (cell-free), posee varias ventajas como la posibilidad de evaluar grandes bibliotecas (1012-1014) en pocas reacciones de PCR y llevar a cabo la transcripción y la traducción acopladas o por separado, mientras que las desventajas de la técnica residen en la labilidad del RNAm y la necesidad de controlar variables como la presencia de enzimas RNAsas (Galán et al., 2016).
Por último, la técnica de CIS display, es un sistema de selección de bibliotecas in vitro que aprovecha la capacidad de la proteína repA de unirse exclusivamente al DNA a partir del cual se ha expresado (propiedad llamada cis). Inicialmente se crea una biblioteca de péptidos muy diversa mediante la unión de fragmentos de DNA con secuencia aleatoria a fragmentos de DNA codificantes para la proteína repA. Posteriormente, se realiza una transcripción y traducción in vitro donde se obtienen un conjunto de complejos de DNA-repA-Nac, que pasan a través de rondas de selección por afinidad a ligandos de interés inmovilizados. A continuación, el DNA retenido es eluido y amplificado mediante PCR para formar una biblioteca de DNA lista para rondas de selección subsecuentes (tres a cinco rondas). Así, el DNA recuperado es clonado en un vector de expresión apropiado para la identificación de las secuencias peptídicas individuales (Odegrip et al., 2004; Mathonet, Ioannou, Betley & Ullman, 2011).
Sistemas de expresión de Nanoanticuerpos
Los Nac se expresan en microorganismos, líneas celulares eucariotas y plantas (Muyldermans, 2013), por mencionar algunos ejemplos: las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris (Salema & Fernández, 2017), la bacteria Corynebacterium glutamicum (Yim et al., 2015), el hongo Ustilago maydis (Terfrüchte et al., 2017), células de Spodoptera frugiperda (línea celular Sf9) infectadas con baculovirus (Shokrollahi, Habibi Anbouhi, Jahanian-Najafabadi, AliRahimi & Behdani, 2021), u otros novedosos sistemas de expresión. Sin embargo, debido a sus altos rendimientos ~2 mg/ 200 mL (Ortega et al., 2020), simplicidad y bajo costo, E. coli es uno de los sistemas más utilizados, además, mediante herramientas de biología molecular es posible obtener a los Nac como proteínas solubles a partir del ambiente periplásmico bacteriano, optimizando la formación de los puentes disulfuro. Su purificación se lleva a cabo utilizando columnas cromatográficas con afinidad a los metales y de filtración en gel para obtener altos niveles de pureza. En caso de no utilizar algún marcaje presente en la secuencia de los Nac, también se purifican mediante la unión a la proteína A (Muyldermans, 2013; Ortega et al., 2020).
Aplicación de los nanoanticuerpos
Su tamaño, estabilidad, capacidad para replegarse, afinidad, especificidad y bajo costo de producción, convierte a los Nac en moléculas altamente versátiles (De Meyer, Muyldermans & Depicker, 2014). Abordaremos su aplicación en tres áreas principalmente: cáncer, identificación de microorganismos y en la industria alimentaria.
Nanoanticuerpos en cáncer
Los Nac se han propuesto como candidatos alternativos para el diagnóstico del cáncer, gracias a sus propiedades y como consecuencia de que las técnicas utilizadas para su diagnóstico, como rayos X, tomografías, resonancia magnética o ultrasonido, cuentan con baja resolución, visualización y altos costos (Yang & Shah, 2020).
Actualmente las proyecciones de imágenes moleculares a través de las técnicas nucleares como PET (del inglés Positron Emission Tomography) y SPECT (del inglés Single-Photon Emission Computed Tomography), son ampliamente utilizadas en la detección de tumores, puesto que proporcionan una información completa del tejido tumoral y son no invasivas. Estas técnicas representan un escenario ideal para la aplicación de los Nac por su versatilidad, y por el extenso desarrollo de estos dirigidos hacia proteínas o receptores sobre-expresados en las células tumorales (Liu, Li, Jin & Liu, 2021). Además, su tamaño y la facilidad para ser conjugados o acoplados a diferentes moléculas, optimizan la identificación y visualización del tejido de interés (Jovčevska & Muyldermans, 2020).
Un gran número de Nac se encuentran en etapas preclínicas y ensayos clínicos para ser utilizados como herramientas de diagnóstico, su acoplamiento con las técnicas PET y SPECT, van de la mano con el reconocimiento hacia marcadores moleculares como HER2 para cáncer de mama (Keyaerts et al., 2016; Xavier et al., 2016); el ligando PD-L1 como inhibidor de proliferación de linfocitos T (Xing et al, 2019; Gao et al, 2020), un dominio específico a fibronectina que detecta tumores primarios y sitios metastásicos (Jailkhani et al., 2019); o dirigido a VCAM como molécula de adhesión celular vascular (Zhang et al., 2018; Bridoux et al, 2020); por mencionar algunos.
La facilidad para ser conjugados con otros componentes, ha permitido explorar el potencial de los Nac como agentes terapéuticos contra el cáncer. Por ejemplo, en combinación con PDT (del inglés Photodynamic Therapy) la cual se basa en las propiedades foto-sensibilizantes de un compuesto químico para generar especies reactivas de oxígeno (ROS), produciendo la muerte celular de las células cancerígenas por las vías de la apoptosis y la necrosis (Deken, et al., 2020).
La adaptación de los Nac a células CAR-T (del inglés Chimeric Antigen Receptor-T Cells), se han evaluado siendo parte de su receptor de reconocimiento, o como moléculas de secreción con propiedades inmunomoduladoras para optimizar su efecto antitumoral (Xie et al., 2020). De igual manera, se ha explorado su aplicación al conjugarlos con diferentes fármacos, enzimas y toxinas (Kang et al., 2021). En la Tabla II, se muestran algunos ejemplos de estos Nac.
Tabla II Potencial de Aplicación Nanoanticuerpos.
| Anticuerpos de un solo dominio y Nanoanticuerpos |
Antígeno | Metodología de Selección-Despliegue en fago |
Potencial de aplicación | Referencias |
|---|---|---|---|---|
| Cáncer | ||||
| Nb4 | Moléculas de adhesión de células epiteliales |
Biblioteca inmune- camello |
Agente terapéutico | Roshan et al., 2021 |
| VHH-28z | RFCVE | Biblioteca inmune- camello |
Receptor de células T terapéuticas |
Hajari et al., 2019 |
| Nb@IC-NPs | EGFR | Biblioteca inmune- camello |
Agente terapéutico dirigido hacia cáncer de pulmón, inhibe metástasis y destruye tumor primario |
Zhang et al., 2020 |
| Viral GPCR US28 | GPCR | Biblioteca inmune-llama | Agente terapéutico contra glioblastoma |
De Groof et al., 2019 |
| anti-VEGF | VEGF | Biblioteca inmune-llama | Agente terapéutico contra cáncer metastásico |
Sadeghi et al., 2020 |
| NBPII-CAR | IL-2 y CD25 | Biblioteca inmune-llama | Agente terapéutico contra cáncer de próstata |
Hassani et al., 2020 |
| Nanoanticuerpo- (PS) | HER2 | Biblioteca inmune-llama | Agente terapéutico contra cáncer de mama HER2+ |
Deken et al., 2020 |
| Enfermedades de origen infeccioso | ||||
| VHHA6 | Proteína Env de VIH-1 | Biblioteca inmune- camello |
Tratamiento profiláctico en mucosas |
Kalusche et al., 2020 |
| VH ab8 | RBD-SARS-CoV-2 | Biblioteca de origen humano |
Neutralización de infección por SARS- Cov-2 |
Li et al., 2020 |
| Nb21 Nb20 |
RBD-SARS- CoV-2 | Biblioteca inmune- llama |
Neutralización de infección por SARS- Cov-2 |
Xiang et al., 2020 |
| 2TCE39 1TC39 |
Antígenos secreción Toxocara canis (ASTC) |
Biblioteca inmune-llama | Identificación específica de ASTC |
Morales et al., 2019 |
| 10 Nanoanticuerpos |
Pf12p, proteína de Plasmodium falciparum |
Biblioteca inmune-alpaca | Identificación funcional | Dietrich et al., 2021 |
| 2R215 | Adhesina, factor de colonización de E. coli. |
Biblioteca inmune llama | Tratamiento profiláctico | Amcheslavsky et al., 2021 |
| VHHS: D12/11B5 H11/20/G12 |
BoNT/A1 BoNT/B1 |
Biblioteca inmune-alpaca | Neutralización efecto tóxico |
Lam et al., 2020 |
| 2C | HLA-A*0201 /Ag85Bp299-207 de Mycobacterium tuberculosis |
Biblioteca de origen humano |
Identificación de células infectadas con M. tb |
Ortega et al., 2020 |
| Industria | ||||
| Nb16 | Ara h 3** | Biblioteca sintética VHH*** |
Identificación de alérgeno en alimentos |
Chen et al., 2019 |
| V2-5 desplegado en fago |
Aspergillus flavus/ parasiticus |
Biblioteca Inmune-alpaca |
Identificación de A. flavus/parasiticus, en los alimentos |
Ren et al., 2020 |
| 3C3 | Toxina Cry1Ie de Bacillus thuringiensis |
Biblioteca de origen humano |
Detección de la toxina (bioinsecticida) en muestras agrícolas |
Xu et al., 2017 |
| dAb8E-desplegado en fago |
Péptido relacionado con la producción de anticuerpos en la enfermedad celíaca |
Biblioteca de origen humano |
Inmunoensayo para detección de gluten en alimentos |
García-García et al., 2020 |
| Nb13, Nb16, Nb22 |
Salmonella enteritidis inactivada en formalina |
Biblioteca inmune- camello |
Detección de S. enteritidis en leche |
He et al., 2020 |
| C1 | Epítopo superficial de Alexandrium minutum |
Biblioteca inmune-llama | Inmunosensor electroquímico para detección de la microalga tóxica A. minutum |
Oloketuyi et al., 2020; Mazzega et al., 2019 |
| Aprobado por FDA | ||||
| Caplacizumab | Factor Von Willebrand | Biblioteca inmune-llama | Prevención de la trombosis en púrpura trombocitopénica |
Holliefield et al., 2020 |
Abreviaturas: M. tb: Mycobacterium tuberculosis; RFCVE: Receptor del Factor de Crecimiento Vascular Endotelial; **ARAh3: Proteína Alergénica identificada en cacahuate; ***VHH: dominio variable de anticuerpo de cadena pesada de camello-humanizado; EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico; GPCR: receptor acoplado a proteínas G; HER2: receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2; IL-2: interleucina 2; VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular; PS: photosensitizer (fotosensibilizador); BoNT/A1-B1: Neurotoxina Botulínica A1/B1; FDA: Food and Drug Administration.
Nanoanticuerpos para enfermedades Infecciosas
La versatilidad de reconocimiento que tienen los Nac, permiten su aplicación en diferentes pasos durante un proceso infeccioso. La identificación del microorganismo y de los factores de virulencia como toxinas y proteínas de secreción, permiten su aplicación en las fases de diagnóstico, neutralización y tratamiento (Tabla II).
Han sido estudiados contra los patógenos de las vías respiratorias, y son candidatos gracias a su alta estabilidad para ser administrados mediante inhalación, facilitando su ingreso directamente al sitio de la infección (Respaud, Vecellio, Diot & Heuzé-Vourc'h, 2015). Su potencial como moléculas neutralizantes dirigido contra SARS-CoV-2, causante de la pandemia actual, está siendo ampliamente explorado (Valdez-Cruz et al., 2021), con resultados prometedores. Su aplicación ha mostrado inhibir la entrada del virus in vitro (Wrapp et al., 2020), y disminución de la carga viral y protección al tejido afectado en modelo in vivo (Tabla II).
Por sus características estructurales, ofrecen el reconocimiento necesario para diferenciar antígenos de secreción altamente similares entre especies de un mismo género, situación frecuente entre algunos parásitos causantes de zoonosis o infección en humanos (Morales et al., 2019).
Se han propuesto como vehículos de una toxina para inducir la muerte parasitaria (Baral et al., 2006), diagnóstico serológico y seguimiento de la infección (Pinto Torres et al, 2018; Deckers et al., 2009).
Su tamaño reducido también ha permitido evaluar estrategias para combatir microorganismos intracelulares, al dirigir su reconocimiento hacia sistemas de secreción ampliamente usados como factores de virulencia en bacterias (Zhang et al., 2021).
Diversos grupos de investigación han explorado el uso de bacterias que son parte de la microbiota como vehículos de los Nac, expresados en superficie o secretados. Su aplicación va enfocada a neutralizar el efecto de las toxinas producidas por algunas bacterias como Clostridium difficile. Con el objetivo de proponer tratamientos que puedan ser administrados vía oral (Andersen et al., 2015) o aplicados en mucosas, actuando como barrera de ingreso a la infección (Kalusche et al., 2020).
Otra estrategia recientemente explorada, es su capacidad para identificar células infectadas por microorganismos persistentes como Mycobacterium tuberculosis, mediante la identificación de péptidos plegados con las moléculas de presentación antigénica clase I (Dass, Norazmi, Acosta, Sarmiento & Tye, 2020; Ortega et al., 2020).
Nanoanticuerpos para la Industria
Por otro lado, la efectividad que ejercen los Nac al aplicarlos se extiende hasta la industria agrícola y de los alimentos, donde se han desarrollado como herramientas de identificación y detección de las toxinas producidas por microorganismos como las bacterias y los hongos principalmente. Por ejemplo, las micotoxinas de Aspergillus flavus (Ren et al, 2020), y la producida por Bacillus thuringiensis, que se han utilizado como un bio-insecticida efectivo para el control de plagas agrícolas (Xu et al., 2017). Para el año 2022, en Estados Unidos se espera el lanzamiento del primer biofungicida con el nombre "Biofun-1", el cual combina el reconocimiento de los Nac y antifúngicos contra Botrytis cinerea (Njeru & Kusolwa, 2021). Empresas como Biotalys www.biotalys.com y el Institute for Agricultural, Fisheries and Food Research ILVO www.ilvo.vlaanderen.be, exploran el uso de los Nac en cultivos, con el objetivo de optimizar y mejorar la calidad de los alimentos.
Los Nac también se han utilizado en inmunoensayos para detectar a patógenos transmitidos por alimentos (He et al., 2020; Hu et al., 2021), así como a los alérgenos del cacahuate (Chen et al., 2019) y de los cereales (García-García, Madrid, González, García & Martín, 2020). Además, se han creado inmunosensores para identificar a las microalgas tóxicas que afectan a la industria pesquera y turística (Oloketuyi et al., 2020; Mazzega, Beran, Cabrini & Marco, 2019).
Adicionalmente, los Nac también se han desarrollado como antivenenos, capaces de neutralizar o disminuir los efectos de las mordeduras de serpientes (Bailon et al., 2020) o de las picaduras de los arácnidos (Tabla II). En la Figura 4, se observa su potencial aplicación de forma esquemática.
Figura 4 Esquema del potencial de aplicación de los Nanoanticuerpos: Sus características fisicoquímicas les permiten actuar como herramientas de estudio en el cáncer: mediante la identificación específica de tejido tumoral y su potencial inmunoterapéutico; en las enfermedades causadas por microorganismos: con diagnóstico y potencial neutralizante tanto del agente causal como de sus factores de virulencia; en el acoplamiento y optimización de técnicas como inmunoensayo, imagenología, citometría de flujo y microscopía de fluorescencia; y en el área industrial mediante la identificación de alérgenos, microorganismos y toxinas en alimentos. Abreviaturas: HER2: Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico humano 2; IFN-γ: Interferón gamma; IL-2: interleucina 2; VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular; VHH: Nanoanticuerpos; TCR: Receptor de Células T. Elaboración personal ("Creado con Biorender.com").
Finalmente, el Nac bivalente humanizado Caplacizumab (Hollifield, Arnall & Moore, 2020), fue el primer anticuerpo con este formato en ser aprobado por la FDA (del inglés, Food and Drug Administration) y la EMA (del inglés, European Medicines Agency). Su mecanismo de acción consiste en impedir la interacción del factor von Willebrand y las plaquetas, para disminuir la formación de trombos. La administración subcutánea de Caplacizumab actúa como un tratamiento de la Púrpura Trombótica Trombocitopénica adquirida, que en combinación con la terapia actual, incrementó la resolución de la enfermedad y la disminución de los casos recurrentes (Jovčevska & Muyldermans, 2020).
Los Nac, a pesar de ofrecer ventajas con respecto a los anticuerpos convencionales, también han mostrado ciertas limitaciones para su aplicación y desarrollo. Un estudio de biodistribución en ratones identificó su acumulación a nivel renal, lo que limitaría su uso para la evaluación de blancos en órganos cercanos al riñón, por ejemplo, el páncreas; sin embargo, el hígado y el bazo no presentaron problemas de acumulación (De Vos, Devoogdt, Lahoutte & Muyldermans, 2013). Su formato monomérico es idóneo para la aplicación en estudios de imagenología; sin embargo, bajas concentraciones de su antígeno en sangre y su corto tiempo de vida, pueden ser factores que afecten de forma negativa su aplicación terapéutica (Jovčevska & Muyldermans, 2020). Otro factor a tener en cuenta, es que los Nac de origen cien por ciento de procedencia humana, si bien brindan una mayor posibilidad de aplicación, no cuentan con las mismas cualidades estructurales típicas de los derivados de anticuerpos de cadena pesada. En cuanto a su desarrollo, se ha reportado la pérdida del reconocimiento hacia la molécula blanco después de separar a los Nac de su plataforma de selección (fago, levadura etc.), o debido a mutaciones presentes en su secuencia (Ortega et al., 2020). Disminuyendo las posibilidades de encontrar un Nac con el reconocimiento esperado.
Conclusiones
El avance acelerado en el desarrollo biotecnológico de los últimos años, y la necesidad de generar alternativas a los tratamientos y métodos de diagnóstico actuales, se acopla muy bien a las propiedades fisicoquímicas de los Nanoanticuerpos.
Los anticuerpos de un solo dominio o Nanoanticuerpos, ofrecen un panorama altamente versátil que permite su exploración y evaluación como herramientas de aplicación biomédica, industrial, biofarmacéutica, diagnóstica y terapéutica para enfermedades de diferentes orígenes.
