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Introducción
El cuajo es una quimosina o renina, la cual es una aspartato-proteasa, producida en el abomaso de becerros, cabritos y corderos lactantes (Addis et al., 2008). Esta enzima se usa como coagulante de leche, porque hidroliza la κ-caseína y coagula las micelas desestabilizadas de las caseínas, forma un gel, a modo de matriz, que atrapa o retiene grasa, agua y algunos componentes solubles de la leche; el proceso es la gelificación o cuajado (Ordiales et al., 2012). Además de la quimosina, en los abomasos de rumiantes lactantes, hay enzimas lipolíticas que hidrolizan las grasas en la leche; esto confiere notas características de sabor a los quesos madurados (Moatsou et al., 2004; Florez et al., 2006).
La calidad del cuajo se asocia principalmente con la potencia de cuajado que es la capacidad de coagular la leche en un periodo de tiempo, ésta capacidad disminuye durante el almacenamiento ya que las enzimas, principalmente la quimosina, se autolisan y afectan la potencia. En tres meses, la potencia de cuajado se reduce 16 %, y puede ser 26 % a los seis meses de almacenamiento (Kozelkova et al., 2012).
Según Kumar et al. (2006), la fuerza de cuajado disminuye proporcionalmente con el aumento de la temperatura de la leche, la actividad máxima coagulante es cuando la leche está a 30 °C, y a 65 °C se inhibe totalmente. La quimosina presenta actividad máxima cuando el pH de la leche es 5.5, a 5.8 la actividad declina y a 8.0 no hay actividad (Kumar et al., 2006).
Los cuajos naturales se industrializan o preparan artesanalmente y se comercializan en presentación líquida (Moschopoulou et al., 2007) o en pasta (Addis et al., 2008). Una desventaja de los cuajos artesanales es el control microbiológico limitado durante su preparación, que afecta su inocuidad; por esto, se aplican aditivos que no afecten la capacidad coagulante, como el ácido bórico (Florez et al., 2006), NaCl (Moschopoulou, 2011) o etanol (O’Connell et al., 2006), en otros casos disminuyen el pH (Tripaldi et al., 2012).
Para desarrollar un coagulante lácteo parecido al cuajo de becerro se estudian las proteasas de los coagulantes lácteos de origen microbiano, vegetal y de especies no rumiantes (Jacob et al., 2011). Aunque proteasas diversas coagulan la leche, la mayoría tiene especificidad por otros substratos, por lo que el rendimiento de queso es bajo o los quesos tienen sabores indeseables (Kozelkova et al., 2012).
El coagulante de origen microbiano contiene solo un tipo de quimosina (A o B) y otros tipos que no existen en el cuajo natural. Los de origen vegetal presentan potencia coagulante baja, contienen principalmente enzimas con actividad proteolítica alta y generan pastas débiles y quesos de consistencia baja (Ordiales et al., 2012). Entre los coagulantes de las especies no rumiantes están las enzimas gástricas del pollo (Rolet et al., 2013) y cerdo (Wahba y El-Abbassy, 1981), con potencia baja de cuajado comparada con las comerciales, por lo que no se permite su inserción en el mercado.
Una especie animal de abasto que tiene estómagos con enzimas coagulantes es el conejo (Oryctolagus cuniculus). La leche de la coneja tiene 12.3 % de proteína, 70 % de la cual es caseína (Szendrő y Luzi, 2006). Las conejas alimentan solo una vez al día a sus crías y esto sugiere producción alta de proteasas. De ser así, la fuerza del cuajado podría ser similar a la de los rumiantes. Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue evaluar en leche de vaca la fuerza de cuajado y actividad proteolítica del estómago de conejo adicionado con NaCl y etanol.
Materiales y Métodos
Material biológico
Cien estómagos de conejos se usaron en la investigación. Estor eran de razas productoras de carne (California, Nueva Zelanda, Chinchilla y cruzas de ellas), de 8 a 9 semanas de edad, de ambos sexos y peso de 2 a 2.3 kg. Los conejos se sacrificaron mediante la técnica de insensibilización por desnucamiento y desangrado por corte yugular, de acuerdo con la norma NOM033-ZOO-1995 (Sacrificio humanitario de los animales domésticos y silvestres), en el taller de carnes de la FES-Cuautitlán de la Universidad Nacional Autónoma de México.
La grasa peri visceral, el bazo, el remanente de esófago y la porción pilórica con el resto del duodeno se extrajeron y el contenido estomacal se eliminó. Los estómagos se invirtieron para exponer la mucosa gástrica, se enjuagaron con agua potable y escurrieron por 30 min. Los estómagos se separaron en tres lotes: 1) 20 estómagos se sumergieron en solución saturada de NaCl (37 g en 100 g de agua a 20 °C), por 5 min; 2) 20 estómagos se cubrieron en la superficie con NaCl (2 g NaCl g-1 estómago); 3) 60 estómagos se mantuvieron sin NaCl. Los estómagos se insuflaron para secarlos, en estufa, con aire forzado y humedad relativa de 45 %, a 35 °C, se consideraron secos cuando alcanzaron peso contante (48 h aproximadamente), y se molieron a un tamaño de partícula de 25 𝛍m.
Extractos enzimáticos
Cien mL de extracto se elaboraron con 1 g de estómago en agua acidificada (con ácido acético, pH de 4.0). La capacidad coagulante se evaluó en dos etapas. Primero se evaluó el efecto del NaCl en salmuera, saturación superficial y sin NaCl, y se realizó 2 y 10 d para determinar el efecto del almacenamiento en la fuerza de cuajado y la actividad proteolítica. En la segunda etapa se determinó el efecto combinado del NaCl (0, 1, 2, 3, 4 y 5 %) y el etanol (0, 1, 2, 3, 4 y 5 %) en la fuerza de cuajado y en la actividad proteolítica y los extractos se evaluaron después de 4, 8, 12 y 16 d del inicio del almacenamiento. Todos los tratamientos de ambas etapas se realizaron por triplicado.
Fuerza de cuajado
La fuerza de cuajo se cuantificó en 10 mL del extracto enzimático adicionado a 100 mL de leche, se definió como volumen de leche (L) coagulado por gramo de estómago en 40 min, a 35 °C (Chazarra et al., 2007) y se calculó con la fórmula propuesta por Spreer et al. (1998):
donde Fc es la fuerza del cuajo, Vl es el volumen de leche, 100 es la dilución de 1 g de estómago en agua acidificada, aforada a 100 mL, 2400 s son 40 min, Vc es la cantidad de cuajo y t es el tiempo de cuajado.
El tiempo de cuajado fue entre la aplicación del extracto enzimático y el momento en que la cuajada pudo sostener verticalmente una pajilla (Chazarra et al., 2007). El extracto no tuvo efecto cuando la leche no coaguló a los 40 min. Para estas pruebas se usó leche pasteurizada a 63 °C, por 30 min, y acidez 20 °Dornic con (CaCl) al 50 % (2 mL 10 L-1 leche).
Determinación de proteínas
La concentración de proteína se determinó por el método colorimétrico de Bradford (1976) a 595 nm en espectrofotómetro (Génesis 10 UV-VIS, THERMO®), curva estándar de ovoalbúmina (2 mg mL-1 en NaCl al 0.9 %) y concentración de 0 a 30 𝛍g mL-1. Los resultados se expresaron en 𝛍g proteína mL-1 extracto de estómago.
Actividad proteolítica
La actividad enzimática se determinó con la metodología de Corzo et al. (2012): 500 𝛍L de sustrato (caseína al 1 % en solución amortiguadora de fosfato de sodio monobásico y dibásico 0.1 M a pH 6) con 50 𝛍L de extracto enzimático se agitaron 30 s, se mantuvieron a 35 °C por 30 min y después de 20 min se adicionó 1 mL de ácido tricloroacético al 5 %, para detener la reacción. La actividad proteolítica se cuantificó por espectrofotometría a 280 nm en el sobrenadante obtenido después de centrifugar (30 min a 3000 rpm a 4 °C). La actividad se expresó como Unidades de Actividad Enzimática (UAE) (aumento en la absorbancia de 0.001 por mg de proteína por min). Este análisis se realizó en triplicado.
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental fue de bloques completamente al azar, y los datos de efecto del NaCl en la fuerza de cuajado y la actividad proteolítica se analizaron con ANDEVA. Los tratamientos fueron: condición sin sal, con salmuera saturada, y la saturación superficial; el efecto de bloqueo fueron los días de almacenamiento. Para las diferencias se usó la prueba de Tukey, p≤0.05 (Steel et al., 1997), con SAS 9.0.
Para el efecto combinado de NaCl y etanol el diseño experimental fue completamente al azar, con arreglo factorial 6×6×4, seis niveles de NaCl (0, 1, 2, 3, 4 y 5 %), seis niveles de etanol (0, 1, 2, 3, 4 y 5 %) y cuatro tiempos de almacenamiento (4, 8, 12 y 16 d). Para las diferencias significativas se usó la prueba de Tukey, p≤0.05 (Steel et al., 1997).
Resultados y Discusión
Etapa 1. Efecto del NaCl sobre la fuerza de cuajado y actividad proteolítica
Hubo diferencias significativas entre los extractos de los estómagos con y sin NaCl, en la fuerza de cuajado. El extracto sin NaCl, no coaguló en ninguno de los tiempos de almacenamiento. El extracto de los estómagos sumergidos en salmuera coaguló como el de los estómagos saturados con NaCl (Cuadro 1). Ese resultado permite sugerir que el NaCl afectó la actividad coagulante, como indica Whitaker (1994), quien menciona que concentraciones superiores a 6 % de NaCl puede afectar la actividad enzimática, provocando en algunos casos una inhibición parcial o total. Sánchez y Burgos (1997) reportaron que concentraciones menores de 2 % de NaCl, aumentan la solubilidad y el desdoblamiento de las proteínas incrementando la actividad de las enzimas.
S E: Sin efecto. UAE: Unidades de Actividad Enzimática (aumento de 0.001 en la absorbancia por mg de proteína por minuto); †L de leche coagulados por g de estómago. Tratamientos con letra diferente en un renglón son diferentes estadísticamente (p≤0.05)
Cuadro 1: Efecto de NaCl en la fuerza de cuajado (103) y actividad proteolítica de estómago de conejo.
La fuerza de cuajado y UAE mostraron diferencia significativas entre tratamientos, pero la primera no se afectó por el tiempo de almacenamiento. En los extractos sin NaCl la UAE fue mayor (Cuadro 1), pero la leche no coagulo. Esto pudo deberse a que el NaCl modificó la conformación en el espacio de las proteínas y del sitio activo. Además, el efecto del NaCl en la disminución de la actividad proteolítica en los tratamientos se explica porque esta sal promueve la disociación del calcio y fosfatos de las micelas de caseína a la solución, lo cual afecta el estado coloidal de la leche y produce interacciones electrostáticas con los residuos de aminoácidos cargados. Aunque el NaCl en concentraciones menores a 5.8 % (1 M) parece estabilizar el plegamiento original de las proteínas (Chazarra et al., 2007), el método de aplicación de la sal puede afectar la actividad, porque concentraciones altas de NaCl retrasan la proteólisis (Calvo et al., 2007).
Moschopoulou et al. (2007) señalaron que los coagulantes lácteos secados al aire y salados obtenidos de estómagos de cordero, mantienen más actividad coagulante por más tiempo que los elaborados con estómagos frescos y salados. En contraste, los cuajos de cordero sin la aplicación de NaCl pierden su actividad coagulante después de cuatro meses de almacenamiento (Moschopoulou, 2011). Bustamante et al. (2000) reportaron que la cantidad de NaCl añadida en la elaboración de cuajos de cordero, no afectó la actividad coagulante o su estabilidad.
Etapa 2. Efecto de los extractos coagulantes de estómagos de conejo adicionados con NaCl y etanol sobre la fuerza de cuajado y actividad enzimática
La fuerza de cuajado no cambió con NaCl, pero hubo diferencias significativas (p≤0.05) con la combinación de etanol y NaCl (Cuadro 2). La fuerza de cuajado promedio (g estómago de conejo L-1 leche) (Cuadro 3) fue superior 4 (1:17 640), 8 (1:24 480), 12 (1:14 520) y 16 (1:31 710), a la obtenida por Florez et al. (2006) entre 4 y 16 d (alrededor de 1:1000 para cuajo de cabrito) y por Chazarra et al. (2007) con 0, 34, 51 y 102 mM de NaCl en extractos de flores de cardo (de 1:387 a 1:422 g-1 cardo). Este resultado puede atribuirse a las concentraciones bajas de NaCl empleadas para elaborar los extractos, e indica la importancia de este factor, ya que la fuerza de cuajado de pepsina y quimosina naturales, sin NaCl, se pierde hasta 26 % después de 6 meses de almacenamiento (Kozelkova et al., 2012). Según, Anifantakis y Green (1980) la actividad coagulante fue mayor con las enzimas coagulantes extraídas con 6 % NaCl.
S E: Sin efecto; EE: error estándar de la media; tratamientos con letras diferentes en una columna son diferentes estadísticamente (p≤0.05)
Cuadro 2: Efecto combinado del NaCl y el etanol sobre la fuerza de cuajado (L leche coagulados g-1 estómago) (103).
Tratamientos con letras diferentes en una columna son diferentes estadísticamente (p≤0.05)
Cuadro 3: Efecto combinado del NaCl y el etanol en la actividad proteolítica (UAE×103).
La diferencia fue significativa (p≤0.05) para UAC en el tratamiento con 0 % de NaCl y 0 % de etanol, respecto a los tratamientos con 1 a 5 % de NaCl en todos los niveles de etanol (Cuadro 3). El aumento en la actividad proteolítica causado por la adición de 2 a 5 % de NaCl puede deberse a que la fuerza ionica de las soluciones mejora la solubilidad de las enzimas, como lo reportan Ahmed et al. (2009) de que la actividad proteolítica de las enzimas se potencia al usar soluciones hasta con 5 % de NaCl. Según Irigoyen et al. (2001), la actividad proteolítica de la quimosina en el cuajo de becerro puede ser afectada por la concentración de NaCl modificando su especificidad.
Conclusiones
Los estómagos de conejo contienen enzimas coagulantes que se pueden extraer con soluciones que contengan 1 a 5 % de NaCl y pH 4. La adición de NaCl y etanol a los estómagos de conejo no afectó la actividad coagulante y fuerza de cuajado al ser probados en leche de vaca. La utilización de estómagos de conejo como fuente de enzimas coagulantes es una alternativa al cuajo convencional, con potencial para la quesería artesanal.
