Biotecnología

 

Trampas génicas como herramienta para identificar genes en plantas que responden a la infección por virus

 

Gene traps as a tool for identification of plant genes involved in viral infection response

 

Diana L. Trejo-Saavedra¹, Edgar A. Rodríguez-Negrete¹, Jean P. Vielle-Calzada², Rafael F. Rivera-Bustamante^1*

 

¹ Departamento de Ingeniería Genética. Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN (CINVESTAV), Unidad Irapuato. 36821. Km. 9.6 Libramiento Norte, Irapuato, Guanajuato, México.

² Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad. Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN (CINVESTAV), Unidad Irapuato. 36821. Km. 9.6 Libramiento Norte, Irapuato, Guanajuato, México. * Autor responsable (rrivera@ira.cinvestav.mx).

 

Recibido: octubre, 2014.
Aprobado: abril, 2015.

 

Resumen

Los elementos transponibles se usan como herramienta de mutagénesis insercional en plantas, por ejemplo, el sistema de transposones de maíz Ac (Activator) y Ds (Dissociation). Estos elementos se modificaron para facilitar la transposición en Arabidopsis thaliana con lo cual es posible el etiquetamiento y la clonación de genes. Esta herramienta se usa principalmente en la biología del desarrollo de plantas, generando marcadores específicos de tejidos y células, y su potencial se amplía en estudios de estrés biótico, como la infección por fitopatógenos como los geminivirus. El objetivo de este estudio fue usar trampas génicas como metodología para identificar genes que responden a la infección del virus de la hoja enrollada de la col (Cabbage leaf curl virus, CaLCuV) en plantas de A. thaliana. Para realizar el estudio se usaron 273 líneas transposantes Mexican Gene Trap (MGT) y 233 Mexican Enhacer Trap (MET). Las plántulas se bombardearon con el clon infeccioso de CaLCuV, y después fueron teñidas histoquímicamente para la detección de la expresión del gen reportero uidA (GUS) a 1, 3, 5 y 7 d después de la infección. Uno de los genes identificados fue PGM que codifica para una fosfoglicerato/bifosfoglicerato mutasa y tiene una respuesta temprana y específica de tejido en la infección de A. thaliana con CaLCuV. Para evaluar la función del gen PGM durante la infección, se generó una línea sobreexpresante. Los resultados sugieren que la sobreexpresión de PGM favorece la velocidad de aparición de síntomas; sin embargo el porcentaje de infección es muy bajo. El empleo de trampas génicas permite un escrutinio masivo, tejido-específico y en tiempo real durante la infección, por lo cual es una alternativa para la identificación inicial de genes del hospedero que responden a la infección por geminivirus.

Palabras clave: Geminivirus, trampas génicas, interacción planta-virus, Cabbage leaf curl virus, virus de la hoja enrollada de la col.

 

Abstract

Transposable elements are used as insertional mutagenesis tools in plants, for example, the transposons of maize Ac (Activator) and Ds (Dissociation). These elements were modified to facilitate transposition in Arabidopsis thaliana with which gene tagging and cloning became possible. This tool is used mainly in biology of plant development, generating specific markers for tissues and cells. Its potential is broadening in studies of biotic stress caused by infection with phytopathogens such as geminivirus. The objective of this study was to use gene traps as a method to identify genes that respond to the infection of the geminivirus Cabbage leaf curl virus, CaLCuV, in A. thaliana plants. To carry out the study, 273 Mexican Gene Trap (MGT) and 233 Mexican Enhacer Trap (MET) transposant lines were used. Seedlings were bombarded with an infectious CaLCuV clone and then stained histochemically to detect expression of the reporter gene UidA (GUS) 1, 3, 5 and 7 d post infection (dpi). One of the genes identified was PGM, which codes for phosphoglycerate/biphosphoglycerate mutase and has an early tissue-specific response to the infection of A. thaliana by CaLCuV. To evaluate the function of the PGM gene during infection, an over-expressing line was generated. The results suggest that over-expression of PGM favors the rate of symptom appearance. However, the percentage of infection is very low. The use of gene traps enables massive, tissue-specific screening in real time during the infection, making it an alternative for initial identification of host genes involved in the response to geminivirus infection.

Key words: Geminivirus, gene traps, plant-virus interaction, Cabbage leaf curl virus.

 

INTRODUCCIÓN

Las trampas génicas son una tecnología de mutagénesis insercional basada en el uso de construcciones que se integran al azar en el genoma de un organismo etiquetando genes con elementos reporteros (Bellen, 1999). Sus ventajas con respecto a las técnicas clásicas de mutagénesis son: 1) la identificación de genes se basa en la expresión de un gen reportero, la cual se puede observar en tejidos y células específicas o en diferentes estados de desarrollo; 2) no se necesita un fenotipo mutante para la identificación del gen; 3) permite la identificación de genes que tienen funciones redundantes; 4) si la trampa génica interrumpe un gen, el patrón de expresión y el fenotipo observado (si lo presenta) podrían sugerir la función de dicho gen.

Los elementos transponibles se emplean para inducir la mutagénesis insercional en plantas, por ejemplo, el sistema de transposones de maíz Ac (Activator) y Ds (Dissociation) (Fedoroff y Smith, 1993; Lawson et al., 1994; Altmann et al., 1995; Klimyuk et al., 1995; Sundaresan et al., 1995). Estos elementos se modificaron para que puedan hacerse transponer a frecuencias suficientemente altas en Arabidopsis thaliana como para permitir el etiquetamiento y la clonación de genes (Dean et al., 1992; Long et al., 1993; Aarts et al., 1993; Lawson et al., 1994). Los elementos enhancer trap (ET) y gene trap (GT) se caracterizaron como sistema de mutagénesis. El sistema ET tiene un gen reportero fusionado a un promotor mínimo derivado del promotor 35S del Virus del mosaico de la coliflor (Cauliflower mosaic virus, CaMV) cuya expresión no se detecta por sí sola. Cuando el elemento se inserta en la proximidad de un gen, es posible que el gen reportero se exprese debido a la interacción del promotor mínimo con los potenciadores vecinos cercanos (Figura 1A) (Sundaresan et al., 1995). En el elemento gene trap (GT), el gen reportero no tiene promotor, por ello su transcripción depende del promotor del gen cromosomal en el sitio de inserción. Río arriba del codón de inicio del reportero se fusionaron secuencias intrónicas (aceptores de splicing) para facilitar la producción de proteínas de fusión mediante la integración del gen reportero en un intrón del gen vegetal, de forma tal que existan aceptores de procesamiento en cada uno de los marcos de lectura génica (Figura 1B). En este tipo de elementos el marco de lectura del gen reportero tendrá que estar en la misma orientación que el marco de lectura del gen en el cual ocurrió el evento de inserción (Sundaresan et al., 1995).

La metodología de las trampas génicas no se considera exhaustiva ya que generar una colección que incluya todos los genes de un organismo sería un proceso muy tardado y costoso. Además, es posible que el etiquetado de algunos genes genere una mutación deletérea o letal y no se pueda recuperar progenie de tal línea. Sin embargo, en algunos estudios, esta metodología tiene probabilidades de detectar genes que pasan desapercibidos con otros métodos; por ejemplo, las trampas génicas se usaron como herramienta importante en la biología del desarrollo de plantas (Campisi et al., 1999; He et al., 2001; Acosta-García y Vielle-Calzada, 2004). Su contribución fue importante en la generación de marcadores específicos de tejidos y células. Hasta ahora hay poca investigación con esta herramienta acerca de los genes que responden a patógenos y menos aún a geminivirus.

Los geminivirus son una familia de patógenos de plantas que causan grandes pérdidas en cultivos importantes en México (Méndez-Lozano et al., 2001; Morales y Anderson, 2001; Méndez-Lozano et al., 2003; Rentería-Canett et al., 2011). Los geminivirus, aunque no codifican para una ADN polimerasa (Stenger et al., 1991), pueden infectar y replicarse en el tejido diferenciado, donde la maquinaria de replicación ya no está activa. Estos virus dependen de los factores celulares para iniciar su ciclo infectivo y la expresión de algunos de los genes del hospedero se altera de manera temporal o espacial (Nagar et al., 1995; Lucy et al., 1996; Bass et al., 2000; Fondong, 2013).

El objetivo de este estudio fue usar trampas génicas como herramienta para identificar genes que responden a la infección del geminivirus de la hoja enrollada de la col (Cabbage leaf curl virus, CaL-CuV) en plantas de Arabidopsis thaliana. Con esta metodología identificamos algunos genes con respuesta específica a virus. Uno de ellos fue el gen PGM que codifica para una fosfoglicerato/bifosfo-glicerato mutasa y manifiesta una respuesta temprana y específica de tejido en la infección con el virus CaLCuV en A. thaliana. Para identificar más genes con respuesta específica a geminivirus es necesario continuar con el escrutinio exhaustivo de las líneas MET y MGT.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal y condiciones de crecimiento

Para este estudio se usaron líneas transposantes de A. thaliana generadas en el Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis del Cinvestav Irapuato (Dr. Vielle-Calzada) y para la generación de estas líneas se usaron dos tipos de trampas génicas. El primer tipo se denomina "Mexican enhancer trap" (MET) y la expresión del gen reportero de la β-glucuronidasa, UidA, se dirige por el promotor mínimo 35S del virus CaMV. El segundo tipo se denomina "Mexican gene trap" (MGT), el gen reportero UidA no tiene promotor y su expresión puede observarse como una coloración azul mediante tinción histoquímica para la β-glucuronidasa (GUS) (Ranjan et al., 2012). Ambos tipos de trampas génicas cuentan además con el gen de selección que confiere resistencia a la kanamicina (Km^R). Las semillas transposantes germinaron en medio Murashige y Skoog (MS) más 50 μg mL^-1 de kanamicina (Km). Las semillas se estratificaron por 3 d a 4 °C y se incubaron en una cámara de crecimiento (Percival Perry, Iowa) a 22 °C con un fotoperiodo de 8 h luz y 16 h obscuridad por dos semanas. Las plántulas resistentes a Km se trasplantaron a un substrato de Mix3-Sunshine (SunGro, Bellevue, WA, EUA), vermiculita y perlita (3:1:1 v/v/v) conteniendo 1.84 kg m^-3 de fertilizante Osmocote 14-14-14 (N-P-K) y se incubaron en las mismas condiciones mencionadas.

Para seleccionar las plantas transformantes con las construcciones de sobreexpresión las semillas T0 se sembraron en el substrato mencionado, se estratificaron 3 d a 4 °C e incubaron en una cámara en las condiciones mencionadas. Las plántulas en un estadio de 4 hojas verdaderas se asperjaron con una solución del herbicida BASTA (AgrRvo, Montvale, NJ, EUA) en una concentración 0.05 % (v/v); el compuesto activo del herbicida es el glufosinato de amonio. Las plántulas transgénicas seleccionadas con el tratamiento con herbicida se trasplantaron a suelo nuevo para obtener las semillas T1, las cuales se seleccionaron en medio MS conteniendo glufosinato de amonio 10 mg mL^-1 y se trasplantaron al substrato bajo las mismas condiciones anteriores. Como testigo se usaron semillas silvestres (wt) de A. thaliana germinadas en medio MS sin glufosinato de amonio.

Germinación de semillas en medio MS

Las semillas de Arabidopsis transgénicas se desinfectaron 2 min con una solución de etanol 70 %, después con una solución de cloro al 10 % por 10 min, se enjuagaron con agua estéril y se colocaron en medio MS con 50 mg mL^-1 de Kanamicina. Las semillas se estratificaron 4 d a 4 °C y se colocaron en una cámara de crecimiento a 22 °C con un fotoperiodo de 16 h luz/8 h obscuridad para medir la germinación.

Inoculación por biobalística de plantas de A. thaliana

Para las pruebas de biobalística se usó el protocolo de Carrillo-Tripp et al. (2007). Plantas de A. thaliana en estadio de ocho hojas verdaderas se inocularon con una pistola manual de baja presión diseñada y construida en el Cinvestav Irapuato y descrita por Carrillo-Tripp et al. (2007). El bombardeo se hizo con partículas de oro (0.5 micrones, BioRad) cubiertas con ambos componentes del genoma viral. El ADN viral (clonado en el plásmido pBluescript) para el bombardeo se preparó mezclando 0.2 mg de cada componente viral para inocular seis plantas (seis disparos). Con un filtro acoplado a la pistola, el disparo se dirigió hacia toda la roseta, a una distancia de 2 cm y a una presión de 50 psi. Para los disparos en hojas individuales se usó la pistola de punta para dirigir el disparo a hojas específicas (Carrillo-Tripp et al., 2007). Las construcciones hemidiméricas de los componentes virales las donó la Dra. Dominique Robertson de la Universidad Estatal de Carolina del Norte (NCSU). La construcción del componente A (pCPCbLCVA.007) contiene una deleción en el gen de la CP y tiene repetida la secuencia de la región intergénica (RI) y una parte del gen Rep. La construcción del componente B (pCPCbLCVB.002) tiene repetida su RI correspondiente y el marco de lectura completo del gen MP (Movement protein). Para seleccionar líneas con expresión del gen reportero GUS en respuesta al virus se bombardearon 10 plántulas por línea. Para el análisis de expresión del gen PGM se inocularon 10 plantas para cada tiempo (1, 3, 5 y 7 dpi).

Aislamiento de ADN y análisis de TAIL-PCR

Para identificar los genes etiquetados por las trampas génicas se usó la técnica de TAIL-PCR (Liu et al., 1995). Para obtener el ADN total las rosetas completas de cinco plantas se congelaron y se trituraron con nitrógeno líquido. El ADN se obtuvo con el método CTAB (Murray y Thompson, 1980). Para cada análisis se usaron 5 ng de ADN por cada muestra. Los productos de PCR seleccionados se clonaron en el vector pGEM-Teasy (Promega) o en el vector pCRII-TOPO (Invitrogen), se secuenciaron y compararon contra el genoma de Arabidopsis.

Construcciones CaMV35S::Rep, CaMV35S::TrAP y CaMV35S::REn

Para generar las construcciones de sobreexpresión de los genes virales Rep (CaMV35S::Rep), TrAP (CaMV35S::TrAp) y REn (CaMV35S::REn), los respectivos marcos de lectura abierta (MLA) se amplificaron por PCR a partir del componente A de CaLCuV clonado en el vector pBluescript. Los fragmentos amplificados se clonaron inicialmente en el vector pCRII-TOPO (Invitrogen) según las especificaciones del fabricante y después se subclonaron por separado en un vector conteniendo el promotor 35S CaMV (cortesía de QBP Rosa María Rangel Cano, Cinvestav Irapuato). Las secuencias de los iniciadores usados para las amplificaciones son las siguientes: Rep (1075 pb), sentido 5'-ATTATTTACAAAAATGCCACGG-3^/, antisentido 5'-CAGCTCTCCTTTTAGCAATC-3'; TrAP (410 pb), sentido 5^/-ACTACCAAAAATGCAAAATT-3^/, antisentido 5'-GG-CATTTGAATCTACTTAA-3'; REn (417 pb), sentido 5'-TT-GAGCTACTAATGGATTC-3', antisentido 5'-CGATTCGA-TA ACAAATTAATAA-3'.

Construcciones CaMV35S-PGM

Para generar la construcción de sobreexpresión del gen fosfoglicerato mutasa (PGM) (CaMV35S-PGM), el marco de lectura del gen se amplificó por RT-PCR. Para sintetizar la primera cadena de cADN se usó 1 μg de ARN total proveniente de rosetas de plantas silvestres y la enzima transcriptasa reversa Superscript II (Invitrogen). Para la reacción de PCR se usó 1 μL de la síntesis de la primera cadena de cADN. El producto de PCR se clonó en el vector pCRII-TOPO (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los iniciadores fueron: PGM-sentido 5'-CGTCTAGAGGCGCGCCATG-GATTGCAAGATTCTTG-3' al cual se adicionaron los sitios de restricción XbaI y AscI; PGM-antisentido 5'-CGGGATC-CATTTAAATTCAATTCTCCGTAG ATGA-3' con los sitios BamHI-SwaI. El fragmento amplificado tiene un tamaño de 694 pb.

El fragmento conteniendo el MLA de PGM se digirió con AscI-XbaI y subclonó en el vector pFGC5941 (Kerschen et al., 2004) (GeneBank No. AY310901) (http://www.chromdb.orgi/order_vectors.html) río abajo del promotor 35S del virus CaMV, reemplazando el intrón de la Chalcona sintasa-A (ChsA).

Construcciones Promotor::uidA

Para generar las construcciones de promotor::UidA, la secuencia promotora del gen PGM (AT1G09935) se amplificó con la técnica de PCR. Para la amplificación se usaron 0.5 μg de ADN total de rosetas de plantas silvestres. El producto de PCR (1515 pb) se clonó en el vector pCRII-TOPO (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia se subclonó en el vector pBI 101.3. La cepa PGV2260 de A. tumefaciens se transformó por electroporación con las construcciones generadas. La secuencia de los iniciadores para amplificar la región promotora es la siguiente: pPGM-sentido 5'-AATAAAGCTTTGCGTTCGAAAC-3' con sitio HindIII, pPGM-antisentido 5'-CAAGTTCTAGATTTTACAGCTC 3' con sitio XbaI.

Transformación de plantas

La transformación de plantas de A. thaliana ecotipo Columbia (Col-0) se realizó mediante el método de inmersión floral (floral-dipping) descrito por Clough y Bent (1998).

Aislamiento de ARN y análisis RT-PCR cuantitativo

El ARN total se aisló de tejido de 5 rosetas completas congeladas y trituradas con nitrógeno líquido siguiendo el protocolo de Trizol (Invitrogen). Las rosetas se recolectaron a los 1, 3, 5 y 7 d después de la inoculación viral. Para el análisis RT-PCR, 1 μg de ARN total se trató con la enzima DNase I (Invitrogen) por 20 min, e inactivada con una incubación a 65 °C por 20 min. Para sintetizar la primera cadena de cADN se usó 1 μg de ARN total de rosetas de plantas silvestres, 10 U de la enzima transcriptasa reversa Superscript II (Invitrogen) y 1 μL (10 mM) del iniciador (dT₁₈). Para la reacción de PCR cuantitativo se usaron 10 μ L del reactivo Platinum SYBR Green qPCR Super Mix UDG (Invitrogen, 2X), con una concentración final de fluoresceína de 10 nM según las recomendaciones del fabricante. Se usaron 0.5 μ L de cADN (12.5 ng) para reacciones de 20 μ L de volumen final. A la mezcla se agregó 1 μL de cada iniciador (10 μ M cada uno). Se asumió una máxima eficiencia de amplificación en el umbral elegido durante la fase log de la curva para todas las muestras. Curvas de disociación se hicieron para descartar amplificaciones inespecíficas para cada par de oligos usados en cada experimento. Los datos se normalizaron con los resultados de la amplificación del gen de referencia 16S de la misma muestra. La cuantificación relativa se hizo con la fórmula T = X2^CT, donde T es el umbral en unidades de fluorescencia, X es el número de copias iniciales y CT es el número de ciclo donde la muestra cruza al umbral (Carrillo-Tripp et al., 2007). Para calcular las unidades relativas se usó la muestra con la más alta concentración como parámetro de estandarización. Para la cuantificación relativa del virus CaLCuV se usó el mismo cADN usado para calcular los mensajeros de PGM. Las secuencias de los iniciadores usados son las siguientes: PGM-sentido 5'-GTA-GCCCTCCCATTTTGGCAC-3', PGM-antisentido 5'-CT-GAGAGAAATCGATGGTGG-3'; 16S-sentido 5'-TGAGA-ATGGATAAGAGGCTC-3', 16S-antisentido 5'-TGTTG-TTCCCCTCCCAAGGG-3'. TrAPF 5'-ACTACCAAAAAT-GCAAAATT-3', Rep-R 5'-CAGCTCTCCTTTTAGCA-ATC-3'

Determinación de clorofila total

Para la determinación de clorofila se cortaron pedazos de hojas de roseta (0.25 g), se colocaron en tubos con 5 mL de acetona al 80 % y se incubaron 10-12 h a —20 °C. Las mediciones de clorofila se hicieron en un espectrofotómetro usando como blanco acetona al 80 %. Las lecturas de la densidad óptica de todas las muestras se realizaron a 645 nm y 663 nm. Para obtener la cantidad total de clorofila, los valores se sustituyeron en la ecuación: Concentración de clorofila= (20.2×(OD 645nm)) + (8.02×(OD 663nm)) (Arnon, 1949).

Medición del diámetro de la roseta

Para obtener el diámetro de la roseta, las rosetas de 10 plantas de cinco líneas 35S-PGM se midieron con un calibrador Vernier 45 d después de la germinación. Cada roseta fue medida dos veces formando un cuadrante X-Y porque la forma de cada roseta no es homogénea. Los datos fueron analizados y graficados en el programa Microsoft^® Excel^®.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación de genes de respuesta a la infección por virus

Las trampas génicas se usan para estudiar los patrones de expresión y la identificación de nuevos genes, especialmente aquellos difíciles de identificar en escrutinios de pérdida de función (Fridborg et al., 2004). Además, se usan para identificar genes cuya expresión está asociada al desarrollo del gametofito femenino en plantas de Arabidopsis, en procesos de senescencia y germinación y en genes regulados en la falta de oxígeno (Liu et al., 1995; Campisi et al., 1999; He et al., 2001; Baxter-Burrell et al., 2003; Acosta-García y Vielle-Calzada, 2004). Sin embargo, esta herramienta se usa poco para identificar genes que respondan a infecciones de patógenos, específicamente a geminivirus.

Para identificar genes que responden a la infección del geminivirus CaLCuV, se realizó un escrutinio en colecciones de líneas transposantes de A. thaliana de ambos tipos: ET (enhancer trap) y GT (gene trap). En este escrutinio, las líneas de interés fueron aquellas que mostraron actividad del gen reportero única y exclusivamente en las plantas inoculadas con el ADN viral.

Las líneas analizadas fueron 506: 273 del tipo MGT y 233 del tipo MET. El 60 % de esas líneas (306) no mostró actividad detectable del gen reportero después de la inoculación viral. Este resultado sugiere que las trampas génicas en esas líneas no estaban integradas en elementos reguladores de algún marco de lectura abierto (MLA) o bien, estaban integradas en elementos que no responden a la infección viral.

Un tercio de las líneas (168) mostró actividad del reportero tanto en tejido inoculado con el virus como en los controles sin inocular, sugiriendo que la trampa génica etiquetó elementos reguladores o MLAs con una expresión constitutiva que no es alterada por la presencia viral. El 4.3 % de las líneas evaluadas (22) mostró actividad del gen reportero como resultado del método de inoculación (balística), es decir, respondieron de manera similar al daño mecánico ocasionado por el bombardeo con partículas con y sin ADN viral. Finalmente, el 2.3 % de las líneas evaluadas (11) mostró una actividad del gen reportero en respuesta a la inoculación viral, indicando que la trampa génica etiquetó elementos que respondieron a la infección por el virus.

De las 11 líneas con respuesta específica al virus CaLCuV se identificaron 8 genes, ninguno de los cuales está relacionado con patogénesis usando otras herramientas como microarreglos o análisis cADN-AFLP (Cooper, 2001; Golem y Culver, 2003; Whitham et al., 2003; Ascencio-Ibañez et al., 2008). La comparación de las secuencias de los 8 genes mostró gran diversidad en la naturaleza de los genes etiquetados por las trampas génicas. Se encontró una proteína similar a aquellas en el complejo de transcripción CCR4, dos proteínas hipotéticas, dos con repetidos ricos en leucina, una proteína similar a receptores de membrana, un pseudogen, y una desaturasa de ácidos grasos (Cuadro 1). La función en la infección viral de dos de los genes identificados en el cuadro 1 fue estudiada y se presentan los datos del gen PGM. Trejo-Saavedra et al. (2009) presentó la información relacionada con el gen CRL (Crumpled leaf) involucrado en morfogénesis y división de plástidos, pero que no estaba asociado al proceso de interacción planta patógeno.

El hecho de que los genes identificados en este estudio no estén reportados en estudios de expresión diferencial en la interacción planta-virus, consolida el uso de las líneas transposantes como una herramienta importante para la búsqueda de genes asociados a la respuesta a geminivirus. Esta metodología presenta ventajas importantes; por ejemplo, puede detectar genes cuya expresión diferencial ocurre en un tejido o periodo muy específico. Las técnicas basadas en la detección directa de ARN (microarreglos, RNAseq) frecuentemente fallan en detectar genes que solo se expresan diferencialmente en unas cuantas células o durante un periodo muy específico debido a un efecto de dilución del ARN en el momento de la extracción. Además, debido a los problemas de costos, estos métodos tienden a ser análisis puntuales en el tiempo (fotografía del momento) y si un gen tiene su expresión diferencial en otro momento, es muy probable que no se detecte. El analizar toda la planta con pruebas histoquímicas y en cualquier momento de su desarrollo aumenta la probabilidad de encontrar genes no detectados en otros sistemas.

Los virus afectan el estado transcripcional de la células infectadas, según Cooper (2001), Golem y Culver (2003) y Trinks et al. (2005). Pero aún no es fácil discernir entre los genes que modifican su expresión como una respuesta específica a la infección viral y aquellos que son parte de una respuesta más global a cualquier tipo de estrés. Esas alteraciones representan los efectos directos e indirectos de la replicación o movimiento viral (Cooper, 2001; Golem y Culver, 2003; Huang et al., 2005). Hay cambios en la expresión de genes durante los primeros días de la infección en plantas de Arabidopsis infectadas con caulimovirus (CaMV) (Cecchini et al., 1997), cucumovirus (CMV), tobamovirus (TVCV), potex-virus (PVX) potyvirus (PVY) (Whitham et al., 2003) y por geminivirus (Ascencio-Ibañez et al., 2008). Esos cambios están relacionados con procesos celulares que reflejan los cambios bioquímicos y fisiológicos involucrados en el desarrollo de la enfermedad (Cooper, 2001; Golem y Culver, 2003; Whitham, 2003).

Análisis de expresión del gen PGM

La selección del gen PGM se basó en que este gen no está reportado como involucrado en la interacción planta-patógeno usando otras herramientas ya mencionadas (microarreglos, cADN AFLP) (Cooper, 2001; Golem y Culver, 2003; Whitham et al., 2003; Ascencio-Ibañez et al., 2008). Por medio de PCR cuantitativo se comparó la expresión del gen PGM de plantas de Arabidopsis Col-0 sin infectar, de plantas infectadas con el virus CaLCuV y de plantas inoculadas con partículas pero sin ADN viral (inoculación mock). Los resultados indican que la expresión del gen PGM aumenta a las 24 h después de la inoculación con virus (1 dpi) y disminuye drásticamente los siguientes días (Figura 2).

Para obtener más información de la expresión del gen PGM, una región de 1515 pb río arriba del codón de inicio se amplificó y se usó como promotor, y esta secuencia se fusionó al gen reportero UidA que codifica para la β-glucuronidasa (GUS). Con esta construcción se transformaron plantas de A. thaliana Col-0. Las líneas transgénicas ( pPGM::GUS ) se analizaron por una prueba histoquímica de GUS para determinar su expresión específica de tejido. En todas las líneas la expresión del gen GUS se observó hasta los 21 d post germinación (dpg) (Figura 3C). Debido a que todas las líneas mostraron el mismo patrón de expresión del gen reportero GUS, algunas de ellas se seleccionaron al azar. Las líneas seleccionadas se inocularon con el virus CaLCuV y se analizaron por pruebas histoquímicas de GUS. La expresión del reportero no fue tan intensa; sin embargo, al analizar con más detalle el tejido inoculado, se observaron células aisladas con expresión de GUS en toda la hoja al primer y tercer dpi (Figura 3A, CaLCuV). Estos resultados son consistentes con los obtenidos en el análisis de PCR cuantitativo, donde la cantidad del mensajero aumenta el primer día y disminuye los siguientes días después de la inoculación (Figura 2).

Para analizar si el cambio de expresión del gen PGM fue debido a la presencia del virus o a una respuesta específica hacia alguna proteína viral, los marcos de lectura abierta (MLAs) de los genes Rep, TrAP y REn del componente A se clonaron bajo el promotor 35S del virus CaMV. Estos genes están involucrados en la replicación viral, modificación del ciclo celular y la transactivación de genes importantes para el ciclo infectivo viral (Hanley-Bowdoin et al., 2013). Estas construcciones se inocularon de manera independiente en las plantas pPGM::GUS. La prueba histoquímica se realizó a los 1, 3, 5 y 7 dpi y solo se pudo observar la expresión del reportero con las construcciones CaMV35S-Rep y CaMV35S-REn durante el periodo de 1 a 5 dpi (Figura 3A). En ninguno de los casos analizados se observó expresión del reportero GUS a los 7 dpi. Además, la expresión inducida por la presencia individual de las proteínas virales fue más baja que la observada en los experimentos con el virus completo. Estos resultados sugieren que el cambio de expresión observado en la infección con el virus completo se debe a la conjunción de la acción de los genes Rep y REn. Sin embargo, no se descarta que alguno de los genes del componente B o la proteína de la cápside (CP) o ambos, también influyan.

Para determinar una posible función del gen PGM en el proceso de infección por CaLCuV se examinó el efecto de la ganancia de función de este gen. Para esto se generaron construcciones de sobreexpresión usando el vector pFGC5941 (http://www.chromdb.org/rnai/ordervectors.html). Con las construcciones generadas se transformaron plantas de A. thaliana ecotipo Col-0 utilizando A. tumefaciens. Se obtuvieron 56 líneas CaMV35S-PGM T1 de las cuales 44 (78.5 %) mostraron fenotipo de hojas enrolladas y generación de tallos adicionales (Figura 4B) mientras que las otras 12 líneas (21.5 %) no mostraron fenotipo. La cantidad relativa del transcrito fue cuantificada por RT-PCR, mostrando que en la línea CaMV35S-PGM T2-8 hay mayor cantidad de ARN mensajero del gen PGM con respecto a la línea wt (Figura 4E).

Para descartar alguna diferencia de desarrollo se realizaron análisis fenotípicos en las plantas silvestres y en las líneas transgénicas. Los resultados muestran que las plantas de las líneas transgénicas y las plantas silvestres presentan valores no significativamente diferentes en la cantidad de clorofila, el número de hojas, y el diámetro de la roseta (Figura 4F, G, H).

Sin embargo, se observaron diferencias en el número de tallos y la forma de las hojas entre las líneas transgénicas y las no transgénicas (Figura 4A, B, C y D).

La expresión del gen PGM en plantas de A. thaliana infectadas con CaLCuV, se induce drásticamente al primer dpi pero disminuye notablemente en los días posteriores. Al analizar las plantas transgénicas que tienen fusionado el promotor de PGM con el gen reportero UidA, se detectó la expresión de GUS en tallos hasta los 21 dpg y en inflorescencias. Estas plantas al ser inoculadas con el virus CaLCuV, muestran expresión de GUS al primer dpi. Estos resultados fueron similares a los observados en el RT-PCR cuantitativo, donde también se detecta una fuerte expresión del mensajero de PGM al primer dpi en plantas wt.

El gen identificado en este estudio (At1G09935) codifica para una proteína similar a las PGM/ bPGM. Este gen presenta 49 % de similitud con el gen AtPGM (Mazarei et al., 2003). Además, muestra el motivo fosfohistidina típico de las dPGM: (LIVM)-x-R-H-G-(EQ)-x-(3)-N) el cual sería esencial para la actividad de la proteína (Todd et al., 2002).

Las proteínas PGM tienen una actividad central en la glicólisis. En plantas, esta ruta es solo parte de una compleja red de rutas del metabolismo de carbohidratos, las cuales se distribuyen en diferentes compartimientos celulares (Bourgis et al., 2005). Dos familias de enzimas poseen actividad de PGM: una donde las PGM son dependientes de cofactores (dPGM), y otra en la cual estas proteínas no requieren ninguna proteína adicional como cofactor (iPGM) (Jedrzejas, 2000). Aunque ambos tipos de PGM catalizan la misma reacción, no hay similitud en la secuencia de aminoácidos entre ambas enzimas (Jedrzejas, 2000). En el genoma de Arabidopsis hay al menos 15 posibles genes con homología a las PGM, de los cuales no se sabe si todos son expresados (Bourgis et al., 2005). Múltiples isoenzimas de las iPGM están presentes en plantas. Algunas están exclusivamente en el citosol (Westram et al., 2002), otras en plastidios y en citosol (Botha y Dennis, 1986), y una más en el núcleo (Wang et al., 1996). Esta distribución sugiere que estas proteínas tienen diferentes funciones en la célula a pesar de pertenecer a la misma familia. En este sentido, una iPGM modifica la fotosíntesis y el crecimiento (Westram et al., 2002).

Mazarei et al. (2003) identificaron el gen AtPGM en una librería de soya y después en Arabidopsis y este gen dirige la expresión del gen reportero GUS solo en tallos y en meristemos apicales. Al infectar estas plantas con nematodos, la expresión se observa en las estructuras tipo callo inducidas por estos patógenos para alimentarse. Además, el promotor fue regulado negativamente por ácido abscísico e hidroxiurea; por el contrario, fue inducido por sacarosa, orizalina y auxina. Esta expresión es típica de los genes que tienen una función en células meristemáticas donde la maquinaria de replicación de ADN está activa. Este es el primer informe de la posible función de las PGM/bPGM en la fisiología de la planta en interacciones planta-patógeno.

Las líneas que sobreexpresan el gen PGM presentan una mayor susceptibilidad a la infección por CaLCuV

Para evaluar si la sobreexpresión del gen PGM afectaba la susceptibilidad de las plantas de Arabidopsis a la infección por CaLCuV (expresada como tiempo de aparición y tipo de síntomas), 20 plantas de la línea transgénica 35S:PGM T2-8 y de la wt fueron infectadas con el virus CaL-CuV. Las variables evaluadas fueron porcentaje de plantas infectadas, periodo de latencia o tiempo de aparición y tipo o severidad de síntomas. El porcentaje de la infección a los 12 dpi en las plantas CaMV35S-PGM T2-8 fue 50 %, mientras que el porcentaje obtenido con las plantas wt fue 90 % (Figura 5A). A pesar de que la eficiencia de la infección fue alterada en las plantas transgénicas, no hubo diferencia en los síntomas (deformación foliar, arrugamiento y moteados cloróticos) producidos por el virus CaLCuV en ambas líneas (Figura 5B). Resultados similares fueron obtenidos con otra línea que tuvo 35 % menos de niveles de mensajero que la línea CaMV35S-PGM T2-8 (datos no mostrados).

En los análisis de infección viral las plantas sobreexpresantes produjeron síntomas 3 d antes que las wt. Es posible que esta PGM tenga una función similar a la reportada por Mazarei et al., (2003), pues su expresión es específica de tejido infectado donde se necesita la maquinaria de replicación activa para iniciar el ciclo infectivo viral. Este resultado sugiere que PGM probablemente facilite de alguna manera el establecimiento de la infección. Además, esta expresión puede ser parte de una respuesta de defensa general de la planta o quizá hay otras proteínas PGM con actividad similar que alteren de manera indirecta el ciclo infectivo viral. Sin embargo, a pesar de los datos experimentales obtenidos para su caracterización, no hay todavía evidencias suficientes para definir una función específica de esta proteína.

 

CONCLUSIONES

Las trampas génicas son una herramienta para identificar genes que responden a la infección por geminivirus. Con esta metodología se identificó que la expresión del gen PGM (fosfoglicerato mutasa) se altera durante la infección viral en Arabidopsis. La determinacion de la expresion del gen PGM de manera precisa en tiempo y espacio durante la infeccion con geminivirus sería muy complicada con otras metodologías, por ejemplo, ensayos tipo Northern blot o RNAseq, ya que su expresión diferencial sería muy difícil de detectar debido al efecto de dilución por muy baja proporción de células expresantes sobre un número mayor de células sin expresión de ese gen en particular.

De acuerdo con los resultados la proteína PGM pudiera facilitar el establecimiento de la infección viral. Pero hay muy poca información sobre la función básica de este gen en el metabolismo de la planta, lo cual impide establecer más claramente su función en la infección por geminivirus.

 

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