Colecta de muestras y aislamiento

Se colectaron plantas de sandía con síntomas de marchitez y necrosis vascular (Figura 1A, 1B) en un campo agrícola ubicado en el municipio de Hermosillo, Sonora, México (29° 01’ 39’’ LN y 111° 28’ 02’’ LO). Se lavaron con abundante agua tallos de tres plantas sintomáticas del triploide Joy Ride (con resistencia parcial a la raza 1, y susceptible a las razas 2 y 3 de Fon), se cortaron secciones internas de los tallos de ~1 cm, se desinfectaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 1 % durante 1 min, se enjuagaron tres veces con agua destilada esterilizada y se colocaron en papel secante esterilizado. Los fragmentos de tejido se sembraron en medio PDA (Difco®) e incubaron a 28 °C durante 5 días. Se obtuvieron cultivos puros de los aislamientos a partir de una sola espora. Para la identificación morfológica, se realizaron montajes de tejido de cultivos de 10 días de edad. Se inocularon tres aislados representativos (un aislado por planta), denominados UESFON01, UESFON02 y UESFON03, en plantas de sandía, con una hoja verdadera, del cultivar Sugar Baby, el cual es considerado como un susceptible universal, pues carece de genes de resistencia a todas las razas conocidas de Fon.

Figura 1 Síntomas y morfología de F. o f. sp. niveum aislado de plantas de sandías con síntomas de marchitez y necrosis vascular: A) marchitez en condiciones de campo, B) marchitez de un solo lado de la planta, C) necrosis vascular en tallo, D) aislamiento en medio PDA, 72 h después de incubación (di), E) crecimiento en PDA a los 8 días di, F) macroconidias, G) fiálides cortas y H) pruebas de patogenicidad (de izquierda a derecha: control, aislamiento UESFON01, UESFON02 y UESFON03). 

La inoculación se realizó en 15 plántulas de sandía por aislamiento, con el pipeteó de 5 mL de una suspensión conidial (1 x 10⁶ esporas∙mL^-1) en el sustrato alrededor de la planta. Las plantas control sólo se trataron con agua esterilizada (^{Latin & Snell, 1986}). Después de los tratamientos, las plantas se mantuvieron en una cámara de crecimiento a 30 ± 2 °C.

Identificación molecular de razas de F. oxysporum f. sp. niveum

Para la extracción del ADN se empleó el método de CTAB al 3 % (^{Zhang, Uyemoto, & Kirkpatrick, 1998}), con algunas modificaciones. Se obtuvo un trozo de micelio de cada uno de los tres aislados fúngicos monoconidiales, el cual se transfirió a un tubo de 1.5 mL y se maceró con 800 µL de buffer de extracción CTAB al 3 %; posteriormente, se incubó a 60 °C durante 30 min. Las muestras se extrajeron con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), se añadieron 15 µL de RNasa A (1 µg∙µL^-1) y se incubaron a 37 °C durante 10 min. La capa acuosa de ADN se precipitó con 600 µL de isopropanol a -20 °C. La pastilla de ADN se lavó con etanol al 70 % y se secó a temperatura ambiente, para después resuspenderla en 30 µL de agua libre de nucleasas (Invitrogen) y almacenarla a -20 °C para su posterior análisis. La calidad e integridad del ADN se evaluó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 % y por espectrofotometría (A260/A280) con un Nanodrop (ND-1000-UV-Vis, Nanodrop Technologies, EUA).

El ADN extraído de los aislados fúngicos se analizó por PCR con tres diferentes pares de primers, los cuales permiten diferenciar las razas 1, 2 y 3 de Fon (Cuadro 1). El primer par de primers Fon-1/Fon-2, específicos para Fon, amplifican una región de 174 pb (^{Lin et al., 2010}). El segundo par, FONSIX6F/FONSIX6R, amplifica un fragmento de 453 pb y permite diferenciar Fon raza 2, de aislados de raza 1 y 3, con base en la ausencia del gen SIX6 (^{Niu et al., 2016}). Finalmente, FNR3-F y FNR3-R amplifican 511 pb y permiten diferenciar aislados de Fon raza 3, de aislados de raza 1 y 2 (^{Hudson et al., 2021}). Las mezclas de reacción de PCR se realizaron en un volumen de 25 µL, el cual contenía 1 µL de ADN, 1X de buffer, 2 mM de MgCl₂, 0.2 µM de cada par de primers, 0.2 mM de cada nucleótido trifosfatado (dNTP) y 1 unidad de Taq polimerasa (Invitrogen Life Technologie, Brasil). Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador automático (C1000 Thermal Cycler, BioRad, EUA).

Las condiciones de amplificación se describen a continuación. Los primers Fon-1/Fon-2 tuvieron una desnaturalización inicial a 94 °C durante 90 s, seguida de 30 ciclos de 94 °C por 30 s, 62 °C por 30 s y 72 °C por 60 s, con una extensión final de 72 °C por 10 min. Los primers FONSIX6F/FONSIX6R tuvieron una amplificación de un ciclo a 95 °C por 3 min, 30 ciclos sucesivos de 94 °C por 1 min, 66 °C por 1 min y 72 °C por 1 min, con un ciclo de extensión final a 72 °C durante 10 min (^{Branham, Levi, & Wechter, 2019}). Los primers FNR3-F/FNR3-R tuvieron una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos a 95 °C durante 30 s, 63 °C durante 30 s y 72 °C durante 40 s, con una elongación final a 72 °C durante 6 min. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 % teñidos con bromuro de etidio (2 mg∙µL^-1), y se visualizaron en un transiluminador UV (Gel Doc XR+ Gel Documentation System, Bio-Rad, EUA). Los amplicones de los primers Fon-1/Fon-2 se purificaron y se secuenciaron en ambas direcciones, usando el respectivo par de iniciadores por separado. Para la secuenciación, se utilizó un secuenciador automatizado (3500 y 3130 Series Genetic Analyzer, Thermo Fisher Scientific, EUA).

Inoculación en plantas diferenciales de sandía

Los tres aislados de Fon se inocularon en los cultivares diferenciales de sandía Sugar Baby (sin genes de resistencia a Fon 0, 1, 2 y 3), Charleston Gray (resistente a Fon 0, susceptible a Fon 1, 2 y 3) y Dixielee (resistente a Fon 0 y 1, susceptible a Fon 2 y 3), con la finalidad de evitar confundir la raza 0 con la raza 1. Para esto, se sembraron semillas de los tres cultivares diferenciales en Peat Moss esterilizado, en charolas germinadoras de 50 cavidades con un volumen de 62.5 cm³ por cavidad. Después de 15 días, se inocularon 30 plantas, con una hoja verdadera, en el sustrato alrededor de la planta con 5 mL de una suspensión conidial (1 x 10⁶ esporas∙mL^-1). Las plantas control sólo se trataron con agua esterilizada (^{Latin & Snell, 1986}; ^{Pal, Rao, Thontadarya, Chandran, & Sriram, 2020}). Las esporas de cada aislado fúngico se obtuvieron al adicionar 30 mL de agua destilada esterilizada a cajas con PDA con el hongo crecido durante 10 días. El micelio se raspó superficialmente y se filtró a través de gasas estériles para remover los fragmentos de micelio y se ajustó a una concentración de 1 x 10⁶ esporas∙mL^-1. El ensayo se realizó dos veces bajo condiciones experimentales similares.

Los cultivares de sandía se consideraron susceptibles si mostraban ≥33 % de plantas con síntomas de marchitez o muerte, y resistentes si tuvieron <33 % de plantas marchitas o muertas después de la inoculación con el hongo (^{Zhou, Everts, & Bruton, 2010}; ^{Pal et al., 2020}). Las plantas de sandía inoculadas se evaluaron de manera individual con la finalidad de observar los síntomas típicos de Fon (clorosis, marchitez o muerte de plantas) hasta los 28 días después de la inoculación.

Aislamiento e identificación morfológica

Se aisló únicamente a Fusarium oxysporum a partir de plantas de sandía con síntomas de marchitez y necrosis vascular. Las plantas colectadas en campo presentaron clorosis, marchitez generalizada (Figura 1A) o marchitamiento de un solo lado de la planta (Figura 1B). También, se observó necrosis y decoloración del tejido vascular del tallo, la cual se puede distinguir fácilmente con un corte longitudinal o transversal en la parte baja del tallo (Figura 1C). Se seleccionaron tres aislados representativos de Fusarium oxysporum (con claves de identificación UESFON01, UESFON02 y UESFON03) de diferentes plantas sintomáticas para su identificación a nivel de raza.

Los aislados de Fusarium presentaron las siguientes características morfológicas: micelio de color rosado a púrpura (Figuras 1D y 1E), macroconidios curvados y puntiagudos en los extremos con tres a cinco células de 18.76 a 41.9 µm de largo y 3.38 a 4.34 µm de ancho (Figura 1F), microconidios unicelulares de forma oval o elipsoidal de 6.1 a 12.8 µm de largo y 2.12 a 3.4 µm de ancho, y monofiálides cortas (Figura 1G). De acuerdo con estas características morfológicas, los aislados UESFON01, UESFON02 y UESFON03 se identificaron como Fusarium oxysporum (^{Leslie & Summerell, 2006}). Asimismo, los tres aislados causaron síntomas de clorosis, marchitez y muerte cuando se inocularon en plántulas de sandía cultivar Sugar Baby (Figura 1H).

Fusarium oxysporum es un complejo de aislados capaces de causar enfermedad en un amplio rango de cultivos de importancia agrícola. F. oxysporum se caracteriza por tener un alto grado de especificidad hacia un hospedante. Los aislados que son patogénicos a un solo hospedante se agrupan en una forma especial (^{Rana, Sahgal, & Johri, 2017}). F. o. f. sp. niveum es la forma especial que es patogénica a la sandía; no obstante, existen más de 100 formae speciales reconocidas, y la identificación con base en la morfología de sus esporas no es posible debido a la gran similitud entre formas especiales y otras especies de Fusarium. Por ello, la identificación molecular es una alternativa importante para una identificación más exacta, pues presenta ventajas sobre los métodos tradicionales de diagnóstico, ya que es más rápida, sensible y confiable (^{Lin et al., 2010}; ^{Martyn, 2014}; ^{Hudson et al., 2021}).

Identificación molecular con primers específicos

La PCR con los primers específicos Fon-1/Fon-2 amplificaron un fragmento de 174 pb, lo cual permitió confirmar que los aislados UESFON01, UESFON02 y UESFON03 pertenecen a la forma especial niveum (Figura 2A). Asimismo, se observó la amplificación de fragmentos de 453 y 511 pb con los primers FONSIX6F/FONSIX6R y FNR3-F/FNR3-R, respectivamente (Figura 2B y 2C).

Figura 2 Amplificación de aislados de Fon con tres pares de primers para la identificación de las razas 1, 2 y 3. A-C (de izquierda a derecha): negativo, marcador de peso molecular, UESFON01, UESFON02 y UESFON03. 

Las secuencias de los amplicones obtenidos con los primers Fon-1/Fon-2 (OP060462, OP060463, OP060464), a partir del ADN de los aislados UESFON01, UESFON02 y UESFON03, se depositaron en el Banco de Genes del National Center for Biotechnology Information (NCBI; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Estas secuencias se compararon mediante el programa BLAST del NCBI, y mostraron de 98 a 100 % de similitud con Fusarium oxysporum f. sp. niveum (EU603504.1).

Durante la infección en la planta huésped, Fusarium oxysporum f. sp. niveum secreta proteínas efectoras en el xilema que pueden favorecer la virulencia o desencadenar resistencia. SIX6 (proteína secretada en el xilema) es un gen de avirulencia que está presente en las razas 0, 1 y 3, pero no en la raza 2 (^{Niu et al., 2016}). Por otra parte, ^{Hudson et al. (2021}) realizaron un análisis genómico de las razas 1, 2 y 3 de Fon, y diseñaron los marcadores FNR3-F/FNR3-R que amplifican una región de 511 pb, dentro de una región más grande (1,121 pb), en el cromosoma de patogenicidad que está ausente en la raza 3, y presente en las razas 1 y 2, con lo cual es posible diferenciar la raza 3 de las razas 1 y 2. Por lo anterior, Hudson et al. (2021) señalan que sólo los aislados de la raza 1 amplifican con los tres pares de primers, mientras que la identificación de las razas 2 y 3 de Fon se determina por la ausencia de la amplificación al usar el correspondiente par de primers.

Con base en lo anterior, los aislados UESFON01, UESFON02 y UESFON03 se identificaron como pertenecientes a la raza 1. Sin embargo, con estos primers no es posible identificar o determinar la raza 0, ya que cuando se amplifican aislamientos de la raza 0 con estos primers los resultados son variables (^{Keinath, DuBose, Katawczik, & Wechter, 2020}; ^{Hudson et al., 2021}). Por lo tanto, para evitar confundir los aislados con los de la raza 0, es necesario inocular éstos en cultivares diferenciales de sandía disponibles comercialmente, que permiten diferenciar entre la raza 0 y 1 de Fon (^{Kleczewski & Egel, 2011}; ^{Zhou & Everts, 2003}).

Inoculación en plantas diferenciales

La reacción a la enfermedad (susceptible o resistente) de los cultivares diferenciales, cuando se inocularon con los tres aislados de Fon, fue igual en los dos ensayos realizados; por ello, en el Cuadro 2 sólo se muestran los datos del primero. En este ensayo, las plantas de Sugar Baby (susceptible universal) mostraron 100 % de mortalidad, Charleston Gray (resistente a la raza 0, susceptible a la raza 1) presentó rangos de mortalidad entre 73.4 y 86.7 %, mientras que, Dixilee (resistente a la raza 0 y 1) mostró entre 6.7 y 16.7 % de plantas muertas con la inoculación de los aislamientos. El bajo porcentaje de marchitez o mortalidad de plantas del cultivar Dixilee inoculadas con UESFON01, UESFON02 y UESFON03 confirman que estos aislados pertenecen a la raza 1 de Fon.

La marchitez vascular de la sandía se observó por primera vez en 1890 al sur de Estados Unidos, y desde entonces esta enfermedad ha sido reportada en todos los continentes (excepto en la Antártida), siendo la enfermedad fúngica más importante de este cultivo a nivel mundial (^{Martyn, 2014}). Existen cuatro razas de Fon: 0, 1, 2 y 3 (^{Rahman et al., 2021}), las cuales están presentes en Estados Unidos y en algunos otros países; sin embargo, en México no hay información sobre la presencia, la distribución o prevalencia de estas razas en las diferentes zonas productoras de sandía. Existen muchos cultivares de sandías diploides con resistencia a los aislados de las razas 0 y 1; no obstante, el incremento en la producción de sandías triploídes (sin semillas), muchas de las cuales carecen de altos niveles de resistencia a la raza 1, ha permitido el resurgimiento de la marchitez por Fusarium (^{Everts, Egel, Langston, & Zhou, 2014}; Everts & Himmelstein, 2015). Para la raza 2, no hay cultivares con resistencia a Fusarium, excepto PI296341- FR (^{Martyn & Netzer, 1991}). Mientras que la raza 3, reportada por primera vez en Maryland, es altamente virulenta a todos los cultivares de sandía, incluyendo al PI296341- FR (^{Zhou et al., 2010}).

La raza 0 de Fon tiene poca importancia económica debido a que la mayoría de los cultivares que se cultivan son resistentes a ésta (^{Everts & Himmelstein, 2015}). Mientras que, la raza 1 de Fon es considerada la más dominante en las áreas productoras de sandías del mundo (^{Rahman et al., 2021}), como la India (^{Pal et al., 2020}), Turquía (^{Kurt et al., 2008}) y China (^{Zhong et al., 2022}). No obstante, la raza 2 es, actualmente, un problema emergente y ha sido reportada con mayor prevalencia que la raza 1 en varias regiones (^{Zhou & Everts, 2003}; ^{Keinath et al., 2020}), como Israel (^{Netzer, 1976}), España (^{Gonzalez-Torres, Meléro-Vara, Gómez-Vázquez, & Jiménez-Díaz, 1993}) y China (^{Duan et al., 2007}). El incremento en las poblaciones de la raza 2 es favorecido por el uso de cultivares con resistencia a las razas 0 y 1 (^{Hopkins, Lobinske, & Larkin, 1992}; ^{Zhou & Everts, 2007}).

En México, a pesar de la gran importancia que tiene el cultivo de la sandía, no hay información sobre las razas de Fon asociadas con la marchitez o muerte de plantas en el cultivo de sandía. En el presente estudio, basados en los síntomas descritos, las características morfológicas, la amplificación con los primers específicos Fon-1/Fon-2, FONSIX6F/FONSIX6R y FNR3-F/FNR3-R, y la inoculación en tres cultivares diferenciales de sandía, se puede concluir que la raza 1 de Fusarium oxysporum f. sp. niveum es parte del complejo de hongos que causan marchitez y muerte de plantas de sandía en México.