Aislamiento de Pseudomonas fluorescentes

Se utilizó una colección de 356 cepas de P. fluorescentes aisladas de diferentes orígenes ecológicos: 272 de la rizósfera de jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) var. Criolla, 74 de la rizósfera de jitomate var. Cid y 10 de la micósfera de esclerocios del patógeno de maíz (Zea mays L.) Claviceps gigantea. Las P. fluorescentes de la rizósfera se aislaron a partir de 1 g de raíz con suelo rizosférico en 10 mL de agua destilada estéril, esto se mantuvo en agitación por 10 min; de aquí se realizaron diluciones seriadas (de 10^-1 a 10^-4) y se inocularon 100 μL de la suspensión en placas Petri con medio B de King (^{King, Ward, & Raney, 1954}) e incubaron a 28 ± 2 °C por 72 h. Para el aislamiento de las cepas bacterianas de la micósfera se utilizó el procedimiento anterior a partir de 1 g de esclerocios de C. gigantea. Las poblaciones de P. fluorescentes se verificaron por la emisión de fluorescencia de las colonias bajo luz UV (268 nm). Las colonias en cultivo puro se preservaron en caldo nutritivo y 40 % glicerol a -80 °C.

Selección in vitro de Pseudomonas fluorescentes antagonistas

El efecto inhibitorio de las P. fluorescentes contra Cmm y Xv se determinó por triplicado mediante pruebas de confrontación dual in vitro en medio de cultivo B de King en placas Petri (12 x 12 cm). Las placas se dividieron en 25 cuadrantes iguales y cada patógeno se inoculó individualmente con 500 μL de una suspensión en agua destilada estéril con una densidad de 3 x 10⁸ unidades formadoras de colonias (UFC) por mL. Posteriormente, cada cepa fluorescente se inoculó en el centro de cada cuadrante con 3 µL de una suspensión con 3 x 10⁸ UFC·mL^-1. Las placas se incubaron a 28 ± 2 °C por 72 h; como testigo se establecieron placas inoculadas solo con los patógenos bacterianos. El antagonismo in vitro se determinó por la formación de halos de inhibición en el sitio de inoculación y se midió el ancho del halo con un escalímetro (0-30 cm, escala 1:100).

Inoculación de Pseudomonas fluorescentes en semilla de jitomate

Se seleccionaron 20 cepas fluorescentes que mostraron antagonismo in vitro con un halo de inhibición ≥ 5 mm contra Cmm y Xv. Las P. fluorescentes (n = 20) se inocularon por la técnica de Bio-priming en semillas de jitomate de tipo Saladette var. Río Grande. Antes de la inoculación, las semillas se hidrataron por el método descrito por ^{Artola, Carrillo-Castañeda, y García-de los Santos (2003)}: se colocaron individualmente lotes de 33 semillas en una malla cerrada con ligas dentro de un frasco con 1 L de agua destilada en aireación por 24 h mediante una bomba de pecera. Después, las semillas se distribuyeron uniformemente en placas Petri de plástico (60 mm diámetro) y se eliminó el agua de la superficie mediante aireación con dos ventiladores por 3 h en condiciones de laboratorio.

Las P. fluorescentes se inocularon por triplicado para cada cepa mediante la inmersión de la semilla por 2 h en 0.4 mL de una suspensión bacteriana a una densidad celular de 3 x 10⁸ UFC·mL^-1 (absorbancia de 0.9 en un espectrofotómetro marca Coleman Junior^® II 620 a 660 nm). Cada tratamiento se colocó en placas Petri con papel filtro estéril, se agregaron 3.5 mL de agua destilada a cada caja y se colocaron en una cámara de germinación a 28 ± 2 °C durante 12 días (^{International Seed Testing Association [ISTA], 2009}). El efecto de la inoculación de las bacterias se comparó con semillas tratadas solo con agua destilada, para lo cual se realizaron recuentos diarios de semillas germinadas con radículas >1 mm. Los resultados se expresaron en porcentaje de germinación a los 12 días de cada cepa de P. fluorescente inoculada y se determinó el tiempo (h) en que germinó 50 % de las semillas (T₅₀) de acuerdo con la ecuación descrita por ^{Salehzade, Shishvan, Ghiyasi, Forouzin, y Siyahjani (2009)}.

Donde N es el número final de germinación, nj y ni son el número acumulado de semillas germinadas por conteo adyacente al momento en que ni < N/2 < nj, ti el número de días que corresponden a ni y tj el número de días que corresponden a nj.

Con los datos de germinación se realizó un análisis de varianza con ayuda del paquete Statistical Analysis System (^{SAS, 2002}). Las diferencias entre las medias de los tratamientos se estimaron mediante la prueba de Dunnet para comparar cada tratamiento con el control (^{Narbona-Fernández, Ortiz-Ballesteros, & Arista-Palmero, 2003}).

Efecto de Pseudomonas fluorescentes en el vigor de plántula de jitomate

Se seleccionaron al azar 20 semillas germinadas por cada repetición del experimento anterior y se trasplantaron en charolas de plástico con peat moss (PRO-MOSS TBK turba de Sphagnum rubio de fibra larga selecta) esterilizado a 121 °C por 1.5 h. Las charolas se mantuvieron en invernadero durante 45 días. Pasado este tiempo, se tomaron 10 plántulas por repetición (30 plántulas por tratamiento), se lavaron las raíces con agua corriente y se dejaron a temperatura ambiente por 72 h; posteriormente, se colocaron en una estufa a 42 °C por 1 h y después se mantuvieron a 60 °C por 24 h. Al finalizar, con una balanza analítica ES 120A, se obtuvo el peso de biomasa seca de raíz y tallo junto con el follaje. Para el análisis de los resultados se utilizó el mismo procedimiento estadístico que el de germinación.

Producción de metabolitos por Pseudomonas fluorescentes antagonistas

Las 20 cepas antagonistas se caracterizaron por su producción de ácido-3-indol acético (AIA) mediante el método colorimétrico modificado descrito por ^{Sarwar y Kremer (1995)}; para lo cual se inoculó masa bacteriana dentro del pozo de la microplaca y se incubó a 28 ± 2 °C por 72 h, posteriormente se agregó directamente el reactivo de Salkowski. El viraje a color rosa en el sustrato inoculado determinó la producción de AIA (+), y un color más intenso se consideró mayor producción de AIA (++). Por otro lado, la producción de sideróforos (SID) se determinó mediante el protocolo universal CAS agar descrito por ^{Schwyn y Neilands (1987)} ; la formación de un halo amarillo en el sitio de inoculación determinó la producción de SID (+) por la cepa bacteriana.

Amplificación del gen 16S rADN, secuenciación e identificación de Pseudomonas fluorescentes

Se realizó una Bio-PCR (reacción en cadena de la polimerasa biológica y enzimática) para la amplificación del gen 16S rRNA con los iniciadores universales para Eubacterias FD1 (5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’) y RD1 (5’ AAGGAGGTGATCCAGCC 3’) que amplifican un fragmento de aproximadamente 1,500 a 1,600 pb (^{Rodrigues, Silva-Stenico, Gomes, Lopes, & Tsai, 2003}). Se preparó una suspensión bacteriana acuosa en 100 µL de agua para PCR (Promega Nuclease-Free water). La reacción se realizó en un volumen final de 25 µL que contenía 1 µL de los iniciadores, a una concentración de 10 µM, buffer para PCR (a una concentración de 1X), MgCL₂ a 1.5 mM, dNTP’s a 200 µM, 2U de taq polimerasa (Promega) y 2 µL de la suspensión bacteriana (DNA). Las condiciones de la PCR consistieron en una desnaturalización inicial de un ciclo de 95 °C durante 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C por 1 min, 55 °C por 30 s, 72 °C por 2 min y una extensión final de 72 °C por 7 min. Adicionalmente, se utilizó un marcador molecular 1 Kb (Promega). Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador marca Techne^® Prime Thermal Cycler.

Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1 % a 95 V por 45 min en buffer TBE 1X. El gel se tiñó con bromuro de etidio y se visualizó en un fotodocumentador (Infinity 5T-5). El producto de la PCR se purificó con el protocolo de Wizard (^{Tereba, 1999}), y después se secuenció, junto con el iniciador FD1, en la Unidad de Biología Molecular del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México y se compararon con la base de datos del GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando el Basic Local Aligment Search Tool (BLAST).

Antagonismo in vitro de Cmm y Xv por Pseudomonas fluorescentes

Los resultados de antagonismo in vitro indicaron que de las 356 cepas de P. fluorescentes evaluadas 20 produjeron un halo de inhibición ≥ 5 mm; de estas, 100 % mostraron antagonismo contra Xv y 45 % (nueve cepas) expresaron antagonismo hacia Cmm (Cuadro 1). Los resultados también indicaron que entre los diferentes aislados de P. fluorescentes se encuentran cepas que difieren en el rango de metabolitos producidos que inciden directamente en la sensibilidad in vitro para una o ambas bacterias fitopatógenas, lo cual resalta la diversidad genética y metabólica que se puede encontrar entre estas poblaciones bacterianas (^{Gross & Loper, 2009}; ^{Loper et al., 2012}). Dicha diversidad está mediada por la capacidad de sintetizar compuestos con actividad biológica para el biocontrol, como el ácido cianhídrico con actividad nematicida (^{Siddiqui, Shahid, Hussain, & Khan, 2006}), sideróforos como la pseudobactina y la ferrioxiamina B (^{Saranraj, Sivasakthivelan, & Siva-Sakthi, 2013}) y antibióticos como la fenazina-1-carboxílico, 2,4-diacetil fluoroglucinol, oomicina, prirrolnitrina, kanosamina, pioluteorina, zwittermycina-A y la pantocina (^{Dilantha-Fernando, Nakkeeran, & Zhang, 2005}). Por lo anterior, el uso de estos microorganismos puede ser una alternativa pertinente y segura.

Efecto de Pseudomonas fluorescentes en la germinación de semilla y vigor de plántula de jitomate

Los resultados del efecto en la germinación de la inoculación de las semillas de jitomate con las cepas de P. fluorescentes no presentaron una distribución normal; por lo que se hizo una transformación angular de los datos, la cual consistió en obtener el arcoseno de la raíz cuadrada de los valores obtenidos (^{McDonald, 2014}), y posteriormente se realizó el análisis de varianza (P ≤ 0.05). Los resultados no mostraron diferencias estadísticas significativas (P ≤ 0.05) en el porcentaje de germinación de las semillas inoculadas con las 20 cepas de P. fluorescentes; sin embargo, 14 cepas (75 %) aumentaron la velocidad de germinación en un rango de 31 a 38 h con respecto al testigo (Cuadro 1), beneficio que se ha demostrado en otras investigaciones (^{Raj et al., 2004}; ^{Weller, 2007}).

En relación con la expresión del vigor de las plántulas, de las 20 cepas evaluadas 15 (75 %) incrementaron la biomasa seca de raíz en rangos de 138 a 177.7 % respecto al testigo, y de éstas, cuatro (26.6 %) mostraron una relación con la producción de SID y mayor producción (++) de AIA (Cuadro 1). En este sentido, de la caracterización metabólica de las 20 cepas de P. fluorescentes inoculadas, 100 % produjeron SID y 13 cepas (65 %) AIA, de las cuales 7 (35 %) presentaron la mayor producción de este ácido (Cuadro 1).

Diversas poblaciones de P. fluorescentes se consideran dentro de las bacterias más aptas para estimular y promover el crecimiento de las plantas, lo cual está relacionado con la producción de fitohormonas y SID (^{Saha, Saha, Donofrio, & Bestervelt, 2013}). La producción de SID es una expresión metabólica importante en la colonización, competencia por nutrientes y biocontrol de patógenos (^{Ali-Saber, Abdelhafez, Hassan, & Ramadan, 2015}). Asimismo, la biosíntesis de AIA por P. fluorescentes destaca como promotor del crecimiento de las raíces estimulando la división y elongación celular, aumentando con ello la capacidad de adquisición de nutrientes; además, induce la actividad de etileno y de la enzima ACC desaminasa que mejora la nutrición vegetal y la resistencia de la planta a factores de estrés (^{Glick, 2014}; ^{Grobelak, Napora, & Kacprzak, 2015}).

El incremento del peso de biomasa seca de la raíz de las plántulas de jitomate exhibe el rol benéfico de las P. fluorescentes utilizadas, lo que podría constituirse como un esquema válido para seleccionar bacterias potencialmente eficientes como promotoras del crecimiento. Los resultados de este estudio coinciden con otras investigaciones que han demostrado que las bacterias promotoras del crecimiento de las plantas basan su habilidad en la producción de AIA y SID (^{Ali-Saber et al., 2015}; ^{Magnucka & Pietr, 2015}).

Identificación de antagonistas

Con la amplificación del gen 16S rRNA, de las 20 cepas bacterianas, mediante los iniciadores FD1 y RD1 se obtuvo un fragmento de aproximadamente 1,500 pb. La secuenciación y alineación de estas cepas en el NCBI identificó a 13 (65 %) como Pseudomonas sp., 5 (25 %) como P. putida y 2 (10 %) como P. fluorescens (Cuadro 2).

En otros trabajos, la inoculación de la semilla y raíz de jitomate con P. fluorescentes demostró su eficiencia en la promoción del crecimiento de la planta y el control de Cmm en invernadero (^{Amkraz, Boudyach, Boubaker, Bouizgarne, & Ben-Aoumar, 2010}; ^{Umesha, 2006}), así como otros patógenos fungosos en jitomate (^{Pastor, Carlier, Andrés, Rosas, & Rovera, 2012}; ^{Srivastava, Khalid, Singh, & Sharma, 2010}). En este trabajo, el 50 % de las cepas identificadas como P. fluorescens y 60 % como P. putida inhibieron el crecimiento in vitro de Cmm y Xv; por lo tanto, pueden ser consideradas como cepas bacterianas con alto potencial para el biocontrol. Algunos investigadores han destacado la alta eficiencia de P. putida y P. fluorescens como promotoras de crecimiento y agentes de biocontrol en la protección del cultivo de jitomate. ^{Byrne et al. (2005)} y ^{McSpadden-Gardener (2007)} indican que P. putida fue efectiva en condiciones de campo para reducir la severidad de infecciones foliares causados por Xv; mientras que ^{Kavitha y Umesha (2007)} mencionan que P. fluorescens inoculada en la semilla de jitomate mejoró la germinación y disminuyó significativamente la incidencia de Xv en condiciones de campo, además, ^{Vanitah, Niranjana, Mortensen, y Umesha (2009)} reportan su eficiencia contra otros patógenos bacterianos importantes en este cultivo.

Las bacterias P. putida (cepa 177Jaf) y P. fluorescens (cepa Ecl), inoculadas en semillas de jitomate, podrían considerarse con alto potencial para su uso como promotores de crecimiento y agentes de biocontrol en el cultivo de jitomate, ya que ambas cepas mostraron el incremento significativo más alto en la velocidad de germinación de la semilla (T₅₀), biomasa de la raíz (peso seco de la raíz) y grado de antagonismo in vitro contra Cmm y Xv (Cuadros 1 y 2).