NOMENCLATURA

PTAR: Planta de tratamiento de aguas residuales

3D-BER: Reactor tridimensional bioelectroquímico

UASB: Reactor anaerobio de lecho de lodos y flujo ascendente (Upflow Anaerobic Sludge Blanket)

SBR: Reactor de lotes secuenciados (Sequential batch reactor)

CAS: Lodo activado convencional

STR: Reactor de tanque agitado (stirred tank reactor)

PT: Planta de tratamiento

MBR: Reactor de membrana

EGSB: Reactor granular de lecho expandido (Expanded Granular Sludge Bed)

GRA: Genes de resistencia a antibióticos

NT: Nitrógeno total

NI: Nitrógeno inorgánico

NH₄⁺: Amonio

NO₂^-: Nitrito

NO₃^-: Nitrato

SDZ: Sulfadiazina

SMX: Sulfametoxazol

SMZ: Sulfametazina

AMP: Ampicilina

AMOX: Amoxicilina

TET: Tetraciclina

OTC: Oxitetraciclina

CTC: Clortetraciclina

CIP: Ciprofloxacino

NOR: Norfloxacino

OFL: Ofloxacino

MOX: Moxifloxacino

ENR: Enrofloxacino

AC PIP: Ácido pipemídico

AC PIR: Ácido piromídico.

ERY: Eritromicina

ROX: Roxitromicina

STRP: Estreptomicina

TYL: Tilosina

INTRODUCCIÓN

Debido al crecimiento poblacional y las necesidades humanas, tanto la cantidad de desechos generados como la contaminación ambiental se han incrementado (^{Gambhir et al., 2012}). Se contaminan los suelos, el aire y el agua de este planeta, afectando la flora y fauna (^{Boxall, 2004}; ^{Qin et al., 2015}). Se estima que gran parte del agua potable en el mundo está contaminada, siendo la principal causa de diversas enfermedades (^{Nabeela et al., 2014}; ^{WHO, 2019}). Compuestos químicos como los clorados, pesticidas, ácidos, metales pesados, entre otros, son residuos de actividades industriales, que constituyen una fuente principal de contaminantes que afectan a los ecosistemas macro y microbiológicos del agua (^{Brown et al., 2006}).

Los compuestos nitrogenados inorgánicos (NI) como el NH₄⁺, NO₂^- y NO₃^- (amonio, nitrito y nitrato, respectivamente), son contaminantes que se encuentran en aguas no tratadas, ya sea de origen doméstico, agrícola e industrial. Particularmente, el NO₃ ^- puede provenir de diferentes procesos industriales como mataderos, destilerías, complejos azucareros, producción de levaduras, almidones, textiles y fertilizantes, entre otros (^{Ávila & Sansores, 2003}). La presencia de nitrato tanto en suelos como en acuíferos ha aumentado principalmente debido al uso excesivo de fertilizantes, así como al aumento de los residuos humanos (^{Larios-Ortiz, 2009}). Se han reportado concentraciones de nitrato desde 0.01 y hasta 3,644 mg/l en efluentes de ganadería, hospitalarios y de plantas de tratamiento de aguas residuales (PTAR), mientras que de nitrógeno total (NT) se han reportado concentraciones entre 0.00002 y 18 mg/l (Tabla 1, material suplementario). Los compuestos NI y NT causan entre otros problemas, efectos tóxicos en organismos acuáticos, la acidificación de lagos (^{Camargo & Alonso, 2007}), así como eutrofización de cuerpos acuáticos, la cual promueve la formación de grandes cantidades de biomasa, el consumo excesivo del oxígeno disponible en los sistemas acuáticos y afectaciones en la fotosíntesis al evitar el paso de la luz (^{Ansari et al., 2010}). La ingesta de concentraciones altas de nitrato repercute en la salud humana, causando metahemoglobinemia en niños menores de 3 años (^{Fewtrell, 2004}). También se ha reportado que los productos generados del contacto del nitrato utilizado como conservador de alimentos con la saliva, así como de la acidificación en el estómago de las aminas presentes en algunos alimentos (^{Moreno et al., 2015}), pueden causar enfermedades como diabetes, Parkinson y Alzheimer (^{De la Monte et al., 2009}).

Por otro lado, la cantidad de antibióticos presentes en diferentes tipos de aguas residuales, como hospitalarias o ganaderas, también ha ido en aumento, debido a su uso en el tratamiento de infecciones bacterianas y a su uso excesivo en actividades veterinarias durante la producción de animales de granja (^{Ahmad et al., 2014}). Aproximadamente 200,000 toneladas de antibióticos se utilizan en el mundo por año (^{Hou et al., 2015}; ^{Yin et al., 2017}), de las cuales 52-70% son canalizadas para usos veterinarios (^{Cuong et al., 2018}; ^{Zhang et al., 2019}) y el resto para uso humano y agrícola, es decir, tratamiento de plagas en plantas. En todos los casos, entre un 30-90% de los antibióticos consumidos se absorben en el organismo y el resto se desecha por la orina y heces, donde el antibiótico sigue siendo activo (^{Xia et al., 2012}; ^{Hou et al., 2015}). La excesiva presencia de antibióticos en los diferentes ambientes y ecosistemas tiene diversos efectos, por ejemplo, provoca la muerte de microorganismos y cambios en las poblaciones bacterianas, así como un aumento de genes de resistencia a antibióticos (GRA) (^{Zuccato et al., 2010}; ^{Tsiaka et al., 2013}; ^{Fraqueza, 2015}).

Como se ilustra en la Tabla 1, una amplia variedad de grupos de antibióticos, como los antibióticos sintéticos: sulfonamidas y fluoroquinolonas; antibióticos de origen microbiano y semisintético: tetraciclinas y β-lactámicos; se han detectado en diversos tipos de aguas residuales. Todos ellos son antibióticos de amplio espectro ampliamente usados en medicina humana y veterinaria, así como en el área agrícola (^{Hoff & Kist, 2009}; ^{Amorim et al., 2014}; ^{Etebu & Arikekpar, 2016}; ^{Vicente & Pérez-Trallero, 2010}). De manera general, en los efluentes de las PTAR se alcanzan concentraciones de distintos antibióticos entre 0.005-31x10³ µg/l (Tabla 1) (^{Brown et al., 2006}; ^{Kümmerer, 2009}; ^{Watkinson et al., 2009}; ^{Hu et al., 2018}; ^{Kovalakova et al., 2020}). Es notorio que en las aguas residuales hospitalarias la concentración de antibióticos es más alta (0.013 a 5x10⁵ µg/l), seguida de las aguas ganaderas (0.002 a 2100 µg/l). Los antibióticos que están en mayor concentración son las tetraciclinas seguidas de las fluoroquinolonas, sulfonamidas, β-lactámicos y finalmente se encuentran los macrólidos con una menor presencia. Es importante resaltar que en estas aguas residuales de origen urbano, agrícolas, de rastros y ganaderos, además de estar contaminadas con antibióticos, también se encuentran presentes diferentes concentraciones de nitrato. Por lo que es necesario eliminar ambos compuestos.

Aunque existen diferentes procesos fisicoquímicos para eliminar materia nitrogenada de forma eficiente, son altamente costosos y la mayoría de las veces generan una contaminación colateral (^{Boyer, 2014}). Por otro lado, hay diversos procesos biológicos que eliminan completamente diferentes compuestos nitrogenados. Estos procesos son amigables con el medio ambiente y tienen una buena relación costo-efectividad (^{Mozumder & Hossain, 2020}). Dentro de estos procesos, se incluyen la nitrificación, el anammox y la desnitrificación. El proceso biológico de la desnitrificación cobra relevancia, ya que es un proceso anóxico de óxido-reducción donde el nitrato se reduce a nitrógeno molecular, a través de la acción de diferentes enzimas reductasas y simultáneamente, la materia carbonada se oxida a HCO₃^-, al utilizarla como fuente de electrones (^{Cuervo-López et al., 2009}). La temperatura, pH, oxígeno y relación carbono/nitrógeno (C/N), afectan el desempeño de la desnitrificación, observándose efectos sobre la velocidad de consumo y crecimiento celular, inhibición de algunas de las enzimas desnitrificantes, pérdida de la actividad desnitrificante, así como una desnitrificación incompleta. Estos factores deben ser controlados de forma que se evite una acumulación de sustratos e intermediarios y se presente una disminución en las eficiencias de consumo y conversión de los sustratos utilizados (^{Knowles, 1982}; ^{Cuervo-López et al., 2009}; ^{Martínez et al., 2017}).

Para realizar la desnitrificación, es posible utilizar como donadores de electrones compuestos orgánicos como etanol, acetato, glucosa, entre otros (^{Cuervo-López et al.,1999}; ^{Elefsiniotis & Li, 2006}) o inorgánicos como hidrógeno, compuestos de azufre o metano, por lo tanto, organismos litótrofos y organótrofos pueden estar involucrados en el proceso respiratorio (^{Ma et al., 2020}). En los últimos años, el interés científico ha crecido y se ha centrado en el uso de la desnitrificación organotrófica para la eliminación y/o degradación de antibióticos. Tal es el caso de los estudios realizados bajo condiciones desnitrificantes con diferentes sulfonamidas como SDZ, SMX, SMZ (^{Sun et al., 2017}; ^{An & Qin, 2018}; ^{Hou et al., 2019a}; ^{Zhang et al., 2020a}; ^{Zheng et al., 2020}; ^{Li et al., 2021}); con β-lactámicos como AMP y AMOX, y tetraciclinas como TET y OTC (^{Islas-García et al., 2017}; ^{Rahman et al., 2018}; ^{Semedo et al., 2018}; ^{Feng et al., 2020}; Li et al., 2020; ^{Yu et al., 2021}). Incluso, se ha estudiado la eliminación de otro grupo de antibióticos como las fluoroquinolonas, tal es el caso de CIP y OFL bajo condiciones desnitrificantes (^{Tong et al., 2019}; ^{Hassan et al., 2020}; ^{Ruan et al., 2020}). Aunque en la literatura se encuentran estudios sobre el uso de la desnitrificación para eliminar antibióticos presentes en las aguas residuales, es difícil saber qué ocurre con el proceso respiratorio biológico, es decir si es posible eliminar el antibiótico y mineralizarlo por desnitrificación, ya que las variables de respuesta como eficiencias de consumo de sustratos, rendimientos de formación de productos y velocidades de consumo de sustrato y formación de producto no siempre son reportadas. El utilizar este tipo de variables de respuesta permitiría demostrar qué sucede con el proceso desnitrificante, así como el destino de los antibióticos que son degradados por esta vía biológica y así proponer este proceso respiratorio como un proceso biológico eficiente y amigable con el ambiente para la depuración de aguas residuales. Asimismo, en presencia de antibióticos, aun no se ha realizado la asociación de variables biológicas como abundancia relativa de comunidades desnitrificantes, genes desnitrificantes y de resistencia, con variables fisiológicas y cinéticas, por lo que sería deseable generar más información sobre estos temas.

El objetivo del presente documento es proporcionar una revisión de los estudios que se han realizado en los últimos años bajo condiciones desnitrificantes a fin de ahondar sobre el papel de la desnitrificación en la biodegradación de los antibióticos, así como identificar los efectos de los antibióticos sobre la fisiología, cinética y comunidad microbiana desnitrificante.

DISCUSIÓN

Eliminación de antibióticos y su efecto sobre el proceso desnitrificante. La eliminación de antibióticos del medio ambiente es un tema de preocupación en la comunidad científica, por lo que los estudios para su eliminación mediante procesos biológicos han ido aumentando. La desnitrificación es un ejemplo de éstos y se destaca porque elimina el nitrógeno y la materia carbonada simultáneamente. Algunos estudios en los que se reproducen las concentraciones de antibióticos encontradas en aguas residuales y en el medio ambiente, muestran que en condiciones desnitrificantes utilizando diferentes tipos de reactores y condiciones de operación, es posible la eliminación de diferentes antibióticos, ya sea de forma individual y/o en mezcla, en concentraciones desde µg/l hasta mg/l (Tabla 2, material suplementario).

Los antibióticos pueden ser eliminados por tres formas principalmente: por adsorción, acción química y acción biológica (^{Oberoi et al., 2019}). La adsorción es un proceso en el que los antibióticos presentes en el agua contaminada se adhieren a los microorganismos depuradores, que se encuentran ya sea en forma de biopelícula, aglomerados granulares o floculares. Qué tanto se adsorban los antibióticos a los lodos depuradores dependerá de diferentes factores, entre ellos de sus interacciones con iones metálicos como Ca²⁺ y Mg²⁺ presentes en la matriz del lodo y del pH del medio, como sucede con las fluoroquinolonas (^{Li & Zhang, 2010}; ^{Cao et al., 2019}) y sulfonamidas (^{Wang et al., 2015}), antibióticos de los que, bajo condiciones desnitrificantes, se ha reportado su eliminación por adsorción desde un 7.7 y hasta un 70% (Tabla 2). La composición de las sustancias exopoliméricas (EPS) que conforman los agregados microbianos también juega un papel determinante en la adsorción de antibióticos (^{Cao et al., 2019}). En general, el tipo de antibiótico, su concentración, la cantidad de biomasa presente, así como la composición de las EPS y su capacidad de adsorción, son entre otros, los factores que determinan la adsorción de antibióticos (^{Xiang et al., 2019}). Debido a esto, el intervalo de eliminación de antibióticos por adsorción resulta ser muy variable. Asimismo, la eliminación y/o degradación de antibióticos puede favorecerse por la acción de determinados factores ambientales como la temperatura, la luz o el pH, o bien por oxidación química (^{Ding et al., 2016}).

Aunque la eliminación de antibióticos por adsorción o vía química puede ser alta, la eliminación de estos compuestos por acción biológica y bajo condiciones desnitrificantes en ocasiones puede ser el proceso más importante, alcanzando valores de hasta un 100% bajo estas condiciones (Tabla 2). Si bien no en todos los casos se reporta la eliminación del compuesto nitrogenado, la biodegradación de los antibióticos se puede asociar con el consumo del NO₃^- presente en las aguas por desnitrificación heterotrófica (^{Matějů et al., 1992}). Al respecto, en ensayos donde se encuentra un único antibiótico y según el tipo de éste, se han reportado diferentes porcentajes de eliminación por biotransformación. Por ejemplo, tanto SMX como SMZ se eliminan parcialmente, entre un 13 y 21%, mientras que, dependiendo de la concentración de CIP, es posible eliminar entre 20 y hasta 93% del compuesto (^{Suarez et al., 2010}; ^{Liu et al., 2013}; ^{Hassan et al., 2020}). Está documentada una eliminación total de AMP asociada completamente al consumo total de nitrato por el proceso desnitrificante (^{Islas-García et al., 2017}). Asimismo, se ha reportado la eliminación por desnitrificación de diferentes concentraciones de AMP, desde 5 y hasta 100 mg/l totalmente asociada a la reducción de nitrato (^{Banda et al., 2022}). Existen también reportes sobre la eliminación de mezclas de antibióticos bajo condiciones desnitrificantes. Tal es el caso de la eliminación parcial de mezclas de antibióticos como CIP, NOR, OFL, MOX; ERY y ROX, de entre 1 y 20%, en otro ejemplo con AMP, SMX, SDZ, TET, CTC y OTC donde la eliminación varió entre el 77-99%. En todos estos casos, se asoció con el consumo de nitrato (Tabla 2). Sin embargo, hay que tener en cuenta que la presencia de más de un antibiótico puede provocar interacciones farmacodinámicas, ya sean sinérgicas (suma de los efectos de los distintos antibióticos) o antagónicas (inhibiendo o bloqueando los efectos bactericidas) (^{Roose-Amsaleg et al., 2021}), repercutiendo en el consumo del propio antibiótico. Por ejemplo, se ha informado que una mezcla de distintas tetraciclinas (^{Chen et al., 2020}), tiene efectos antagonistas en la digestión aerobia, disminuyendo el consumo de la materia orgánica.

La variabilidad en los porcentajes de eliminación tanto de antibióticos como de nitrato podría estar asociada con la relación C/N establecida (^{Cuervo-López et al., 2009}). En este sentido, ^{Hassan et al. (2020)} utilizando CIP y relaciones C/N entre 0.5 y 3.5, observaron que a la C/N de 0.5, la biodegradación del antibiótico y la eliminación de NO₃^- fueron del 50 y 20% respectivamente, mientras que a una C/N mayor que 1.5, la biodegradación de ambos sustratos fue mayoritaria. Esto apunta a que, al establecer relaciones C/N estequiométricas o cercanas a ellas, se incrementa la posibilidad de obtener una eliminación de antibióticos cercana al 100%, como lo reportado por ^{Islas-García et al. (2017)} y ^{Banda et al. (2022)}. Otro punto puede ser que el antibiótico esté en la presencia de una fuente carbonada fácilmente degradable. Al respecto, existen trabajos en los que el consumo de CIP (^{Hassan et al., 2020}) y AMP (^{Islas-García et al., 2017}) se ha logrado en presencia de acetato de sodio. Los autores proponen que estos resultados podrían estar asociados con procesos cometabólicos, donde el acetato de sodio es la fuente de carbono que funciona como principal donador de electrones y promueve el crecimiento microbiano. También se ha informado que bajo condiciones desnitrificantes litotróficas es posible eliminar NO₃^- y el 21% de SMX utilizando azufre como fuente donadora de electrones. Cabe mencionar que el proceso desnitrificante litotrófico es poco utilizado, por lo que hace falta generar información sobre este proceso en presencia de antibióticos. La información presentada muestra la viabilidad de utilizar el proceso desnitrificante para tratar aguas residuales contaminadas con antibióticos. Sin embargo, dado que factores como el tipo de antibiótico, concentración y número de antibióticos presentes en las aguas residuales, así como la concentración de compuestos nitrogenados presentes, afectan la eliminación de ambos compuestos, se necesita más investigación al respecto para corroborar que la eliminación del antibiótico esté acoplada a la eliminación de nitrato por el proceso desnitrificante.

Destino de los antibióticos y del nitrógeno. Son pocos los estudios que han reportado los productos finales provenientes de la respectiva oxidación y reducción de la fuente de carbono y nitrógeno bajo condiciones desnitrificantes. El destino de los antibióticos y nitrato eliminados es un punto importante por responder, puesto que los productos formados no necesariamente son CO₂ y N₂, los productos carbonados generados podrían ser más recalcitrantes y/o tóxicos que el antibiótico de origen, y el nitrato podría ser reducido parcialmente y quedarse como NO₂^- y/o N₂O (^{Moraes et al., 2012}), es decir, los productos podrían causar más daño al medio ambiente.

En algunos estudios se ha realizado la asociación del proceso desnitrificante con el consumo simultáneo de antibióticos, así como el seguimiento de los productos de la ruta carbonada y nitrogenada. Por ejemplo, ^{Islas-García et al. (2017)} observaron que la AMP se mineralizó completamente a HCO₃^- y el NO₃^- se redujo totalmente a N₂ con una formación transitoria de NO₂^-. Esto demostró que la AMP se puede eliminar y mineralizar por completo en condiciones desnitrificantes. En algunos estudios, se ha observado una mineralización parcial de antibióticos. ^{Banda et al. (2022)} observaron que dependiendo de la concentración de AMP utilizada como única fuente de electrones, es posible la eliminación completa del antibiótico o bien su mineralización parcial a HCO₃^- y a dos intermediarios carbonados, mientras que el NO₃^- fue reducido parcialmente a N₂ y N₂O, por lo que, bajo ciertas condiciones desnitrificantes, es posible eliminar AMP, pero no mineralizarla completamente. Cabe destacar que en otros estudios se observa la mineralización parcial de antibióticos, pero no se habla del destino del nitrato. Por ejemplo, ^{Liu et al. (2013)} detectaron dos intermediarios como posibles productos de la biotransformación de CIP. Asimismo, ^{Hassan et al. (2020)} observaron que bajo condiciones desnitrificantes y al establecer una relación C/N de 1.5, surgen cuatro intermediarios carbonados procedentes de la biotransformación de CIP; para este caso en particular, los autores proponen a los cuatro intermediarios como posibles pasos de reacciones independientes para la degradación del antibiótico. Al utilizar SMX se observó la formación transitoria de un intermediario (^{Barbieri et al., 2012}), en otro ensayo con SMX se observó la formación de cuatro intermediarios de carbono (^{Zhang et al., 2020a}), para este caso en particular, los autores proponen a los cuatro intermediarios como posibles reacciones dependientes, por lo que se proponen dos posibles rutas de degradación de SMX. Por último, se encuentran los casos donde solo se observó el destino de la materia nitrogenada. ^{Liu et al. (2013)} con CIP observaron una reducción parcial del nitrato ya que el 26% del nitrato consumido se redujo completamente a N₂ y el 52% se redujo a nitrito. Si bien no en todos los casos se forman intermediarios carbonados o nitrogenados bajo condiciones desnitrificantes, se podría decir que su aparición depende del antibiótico evaluado, así como de la disponibilidad del nitrato presente.

Es importante subrayar que muchos de los intermediarios carbonados detectados no han sido identificados, por lo que, en la mayoría de los casos, se desconocen los efectos o grado de toxicidad que podrían ocasionar a los microorganismos presentes en el ambiente o a la salud humana. Otro punto que está poco abordado son las posibles rutas metabólicas de degradación de los antibióticos, así como las enzimas involucradas en dichos procesos. Con la información presentada se observa la falta de medición y/o verificación de la mineralización de antibióticos. Contar con esta información permitiría constatar su oxidación total o parcial. Asimismo, hay poca evidencia que muestre la capacidad de los lodos desnitrificantes para mineralizar completamente otros antibióticos de uso común, por lo que aún se desconoce la posibilidad de que los antibióticos actualmente utilizados puedan oxidarse bajo condiciones desnitrificantes.

Efectos de antibióticos sobre el proceso desnitrificante. Se ha reportado que, como consecuencia de la exposición de los lodos desnitrificantes a un único antibiótico, pueden ocurrir diversos efectos fisiológicos, tales como una disminución en la eficiencia de consumo de nitrato (^{Li et al., 2021}), así como una acumulación de compuestos nitrogenados ya sea en forma de nitrito, óxido nitroso o ambos (^{Ahmad et al., 2014}; ^{Yin et al., 2017}). También se han documentado efectos cinéticos sobre el proceso desnitrificante (^{Hou et al., 2015}; ^{Islas-García et al., 2017}; ^{Banda et al., 2022}), tal es el caso de la disminución en una o varias de las velocidades específicas (q) del proceso, ya sea en el consumo de nitrato o del propio antibiótico (q_NO3, q antibiótico), o bien de la formación de los productos de la desnitrificación, como el bióxido de carbono y/o bicarbonato (q_CO2, q_HCO3), nitrógeno molecular (q_N2) y/o intermediarios como el nitrito (q_NO2) y el óxido nitroso (q_N2O). Ejemplos de estos efectos sobre el proceso desnitrificante se muestran en la Tabla 3 (material suplementario). La evidencia científica ha permitido corroborar que, bajo condiciones desnitrificantes, la presencia de antibióticos usados como fuente orgánica o donador de electrones, ya sea de forma individual o en mezcla, provoca más de un efecto cinético o fisiológico en los lodos.

En algunos casos, la exposición de lodos desnitrificantes a diferentes concentraciones de CIP no afectó el consumo de NO₃^-, resultando en altas eficiencias de consumo del compuesto nitrogenado (^{Li et al., 2021}). Es posible que este resultado esté asociado con la C/N utilizada de 3.7. En este sentido, ^{Hassan et al. (2020)} observaron que en presencia de CIP y cuando se establecen relaciones C/N mayores a la estequiométrica, el consumo de NO₃^- es mayoritario y no se ve afectado. Sin embargo, esto no quiere decir que se pueda usar CIP como fuente orgánica donadora de electrones sin causar repercusiones en el proceso desnitrificante puesto que se han observado en lodos con actividad desnitrificante, otros efectos fisiológicos como la acumulación de nitrito y cinéticos, como una disminución en la velocidad de consumo de NO₃^-.

Son diferentes factores los que determinan qué tanto disminuye la eficiencia de consumo de NO₃^-, entre ellos se pueden citar al tipo de antibiótico y su concentración. Por ejemplo, concentraciones de 10 mg/l de CIP, AMOX o CTC parecen no tener efecto sobre la eficiencia de consumo de NO₃^- en comparación a un ensayo control, ya que son cercanas al 100% en ambos casos. Sin embargo, con 10, 50 y 100 mg/l de β-lactámicos, sulfonamidas y tetraciclinas como AMOX, SMX y CTC respectivamente, la eficiencia de consumo de NO₃^- disminuye en las 3 concentraciones (10, 50 y 100 mg/l) un 71.2, 42.62 y 74.43% respectivamente, al aumentar la concentración de los antibióticos y en comparación con un ensayo control sin ellos (^{Li et al., 2021}). Aunque la disminución de la eficiencia de consumo de NO₃^- es similar con AMOX y CTC, existió un efecto mayor (98 al 26.8% y 90.89 al 16.46% respectivamente) cuando se utilizó SMX (50.6 al 7.98%). De hecho, diversos estudios coinciden en que la disminución de consumo de nitrato ocurre con más frecuencia cuando se usan algunas sulfonamidas o tetraciclinas (^{Zhang et al., 2022}).

Por otra parte, las fluoroquinolonas, β-lactámicos, sulfonamidas y tetraciclinas han causado la acumulación de diferentes intermediarios nitrogenados como el caso del nitrito (^{Ahmad et al., 2014}; ^{Li et al., 2021}). Este efecto ha sido asociado con la disminución de la actividad de las enzimas reductasas, con modificaciones celulares estructurales sobre las comunidades desnitrificantes en los lodos, así como cambios en las comunidades desnitrificantes debido al efecto bactericida de los antibióticos (^{Katipoglu-Yazan et al., 2016}). En ensayos con Pseudomonas stutzeri se observó que, bajo condiciones desnitrificantes, la actividad de las enzimas óxido nitroso, óxido nítrico y nitrito reductasa disminuía en presencia de SMX, provocando acumulación de intermediarios nitrogenados como N₂O, NO y NO₂^- (^{Gui et al., 2017}). La información de la literatura sugiere que la acumulación de nitrito depende de la concentración del antibiótico, por ejemplo, se observa una tendencia decreciente de nitrito acumulado con respecto al aumento en la concentración de antibióticos como AMOX, SMX y CTC. Cabe destacar que, hasta el momento, no se han encontrado reportes en ensayos con mezclas de diferentes antibióticos, en los que se muestren afectaciones en variables fisiológicas como la eficiencia de consumo de NO₃^- y la acumulación de nitrito, por lo que falta realizar más estudios con lodos bajo condiciones desnitrificantes y mezclas de antibióticos.

El efecto de los antibióticos sobre algunas variables cinéticas como velocidades de consumo de nitrato y formación de productos (HCO₃^-, N₂O y N₂) se muestra en la Tabla 3. En el caso de antibióticos pertenecientes al grupo b-lactámico, se observa una mayor afectación en la velocidad específica de consumo de NO₃^- en presencia de 18 mg de AMP y acetato (^{Islas-García et al., 2017}) que con 10 mg/l de AMOX (^{Li et al., 2021}), mientras que en un ensayo realizado con AMP como única fuente de electrones, las velocidades de consumo de NO₃^-, de mineralización a HCO₃^- y reducción a N₂ fueron menores a las reportadas cuando el proceso desnitrificante es realizado con acetato (^{Banda et al., 2022}). En algunos casos, se han reportado las velocidades de consumo de nitrato y formación de óxido nitroso, por ejemplo, al evaluar con SMZ (^{Hou et al., 2015}) y con una mezcla de antibióticos conteniendo a SMZ (^{Yin et al., 2017}). Se observó que la disminución de la velocidad de consumo de NO₃^- fue de 38% con SMZ y 44% con la mezcla que contenía ERY, NOR, SMZ y OTC. Los autores sugieren que la velocidad de consumo se ve afectada por el efecto sinérgico de la presencia de los otros antibióticos y de la SMZ (^{Yin et al., 2017}). Además, ^{Yin et al. (2017)} así como ^{Hou et al. (2015)}, reportaron que el aumento de 3.77 y 39 veces en la velocidad de formación de N₂O fue debido a la presencia del antibiótico, este efecto también se ha observado con sulfonamidas, tetraciclinas y fluoroquinolonas como SMX, TET y OFL (^{Roose-Amsaleg et al., 2021}), donde se muestran efectos sinérgicos en la liberación de N₂O. Por último, se encuentran estudios donde se ha reportado la disminución en la velocidad de consumo de nitrato, en los cuales se observa que al ser comparadas contra un ensayo control en ausencia de antibióticos, el porcentaje de disminución de la velocidad de consumo de nitrato aumenta con respecto a la concentración de distintos antibióticos como CIP, AMOX, SMZ, SMX y CTC. Es importante resaltar una vez más, que el tipo y concentración de antibiótico provoca efectos diferentes, de hecho, con concentraciones entre 10-100 mg/l de estos antibióticos, el orden de afectación en la velocidad de consumo de nitrato fue el siguiente: SMX>CTC>AMOX>CIP. La información presentada muestra los efectos de los antibióticos sobre el proceso desnitrificante, donde los factores antes mencionados, juegan un rol importante para llevar a cabo la desnitrificación. Es importante resaltar que la utilización de variables fisiológicas y cinéticas permitiría una mejor evaluación de los efectos de los antibióticos sobre la desnitrificación.

Efectos de antibióticos en las comunidades desnitrificantes. Se ha reportado la dinámica de las comunidades microbianas bajo condiciones desnitrificantes expuestas a diferentes antibióticos de forma individual o en mezcla, observándose una gran diversidad de géneros presentes. Esta gran diversidad de géneros reportados es posiblemente debida a las condiciones experimentales establecidas, así como al tipo de ensayo realizado, en lote o en continuo, o bien, a la concentración, tipo y número de antibióticos utilizados, entre otras. En la Tabla 4 (material suplementario) se muestra el efecto de algunos antibióticos sobre la abundancia relativa de géneros bacterianos presentes en las comunidades microbianas bajo condiciones desnitrificantes. Esta variable de respuesta es utilizada para evaluar la biodiversidad, es decir, determinar el porcentaje de cada género con relación al total de los géneros que conforman la comunidad microbiana. Se dice que los géneros bacterianos resistentes se definen como aquellos que tienen la capacidad de crecer y sobrevivir ante el efecto del antibiótico (^{Brauner et al., 2016}), lo cual se ve reflejado como un aumento en su abundancia relativa durante la exposición a antibióticos; mientras que los géneros bacterianos tolerantes, son aquellos que subsisten durante el tiempo en que el antibiótico esté presente (^{Brauner et al., 2016}), por lo que es posible observar una disminución en su abundancia relativa. Algunos de estos géneros, incluyen microorganismos desnitrificantes completos y bacterias que contienen una o más enzimas que forman parte de la vía desnitrificante. Aunque las comunidades microbianas son diversas, algunos géneros desnitrificantes como Thauera, Comamonas, Pseudomonas y Thiobacillus son los más frecuentemente encontrados cuando éstas se exponen a antibióticos (^{Liu et al., 2016}; ^{An & Qin, 2018}; ^{Tong et al., 2019}; ^{Zhang et al., 2019}; ^{Hassan et al., 2020}; ^{Zhang et al., 2020a}; ^{Zhang et al., 2020b}; ^{Li et al., 2021}).

Entre los géneros bacterianos tolerantes a antibióticos como β-lactámicos, sulfonamidas, fluoroquinolonas, macrólidos y tetraciclinas se encuentran Thauera y Comamonas. Con AMOX, la abundancia relativa disminuye un 32 y 12%, respectivamente (^{Li et al., 2021}); ante 100 mg/l de SMX la abundancia relativa de éstos disminuye un 28 y 9%, respectivamente (^{Airong et al., 2005}; ^{Liu et al., 2016}; ^{Feng et al., 2020}; ^{Zhang et al., 2020b}), mientras que dependiendo de la concentración utilizada de CIP su abundancia relativa disminuye entre 10 a 24% y 7%, respectivamente (^{Tong et al., 2019}; ^{Zhang et al., 2019}; ^{Hassan et al., 2020}; ^{Zhang et al., 2020a}; ^{Li et al., 2021}). Un fenómeno similar se observa en presencia de STRP y TYL; en tanto que con CTC la abundancia relativa de Comamonas disminuye un 7% (^{Li et al., 2021}). El efecto en Thauera y Comamonas, sigue el siguiente orden: AMOX>SMX>CIP>STRP>TYL>CTC. ^{Chen et al. (2017)} observaron que la actividad desnitrificante disminuía con el aumento de la concentración de SMX, lo cual podría estar fuertemente relacionado con la afectación a diferentes géneros desnitrificantes. Es importante resaltar que, el mecanismo de acción de los antibióticos citados es diferente, a saber: inhibidores de la síntesis de la pared microbiana (β-lactámicos), en la síntesis de folato (sulfonamidas), en la actividad de la ADN girasa (fluoroquinolonas) o síntesis proteica (macrólidos y tetraciclinas).

Se ha reportado que uno de los géneros desnitrificantes más resistente tanto a fluoroquinolonas como CIP y macrólidos como STRP es Pseudomonas (^{Hancock & Speert, 2000}), debido posiblemente a las mutaciones en las enzimas blanco como girasas y topoisomerasas que se han reportado en diferentes especies de Pseudomonas, así como a su resistencia intrínseca a macrólidos (^{Jalal et al., 2000}; ^{Bruchmann et al., 2013}; ^{Morita et al., 2014}). Aunque se ha reportado a Pseudomonas como tolerante a OFL y TYL, es más frecuentemente reportado como género desnitrificante resistente (^{Tong et al., 2019}; ^{Zhang et al., 2019}). Cuando se usan concentraciones en µg/l de SMX, Thauera y Thiobacillus son resistentes. Caso que difiere con SDZ, ya que al menos Rhodopseudomonas y Thiobacillus permanecen en el medio. Mientras que en presencia de tetraciclinas como TET y OTC, se observa la resistencia de Thauera aumentando su abundancia relativa entre un 17 y 22% (^{Liu et al., 2016}; ^{Li et al., 2021}). Por último, cuando los lodos desnitrificantes se encuentran expuestos a mezclas de antibióticos, Comamonas aparece como género desnitrificante resistente. Esto es posiblemente debido tanto a la concentración como al tipo de antibióticos presentes. Es importante notar que, para tener un mejor entendimiento sobre los cambios poblacionales en las comunidades desnitrificantes expuestas a diferentes antibióticos, éstos deberían ser complementados con el seguimiento de las variables fisiológicas y cinéticas de la desnitrificación, así como con el estudio del cambio en los genes de la desnitrificación, ya que existen otros factores como el tiempo de exposición y la transferencia horizontal de genes, que podrían inducir la resistencia a antibióticos.

Detección de genes desnitrificantes en comunidades microbianas expuestas a antibióticos. Los efectos de los antibióticos sobre los lodos desnitrificantes se han evaluado al cuantificar los diferentes genes responsables de la desnitrificación: narG, napA, nirS, nirK, cnorB, qnorB y nosZ, encontrándose cambios en la abundancia de éstos. Ejemplos de estos cambios se presentan en la Tabla 5 (material suplementario). Las condiciones experimentales establecidas, el uso de diferentes antibióticos como fuente orgánica donadora de electrones, concentración y origen de los lodos, así como el tiempo de exposición a los antibióticos, son variables de importancia que influyen en la abundancia de diversos genes desnitrificantes.

Diferentes autores han observado que una posible causa por la que disminuye la abundancia de los genes desnitrificantes es por el efecto negativo de los antibióticos sobre los hospederos que los contienen (^{Wu et al., 2017}; ^{Feng et al., 2020}). La disminución tanto del número de copias como de la abundancia relativa de los genes nirS y nosZ se ha observado ante la exposición de diferentes tetraciclinas (TET u OTC), sulfonamidas (SMT) o bien mezclas de estos antibióticos, disminuyendo entre el 17-48% y 50-65% respectivamente. Este fenómeno ha sido igualmente observado con diferentes concentraciones de OTC, posiblemente debido al tiempo de exposición y concentraciones de antibiótico ensayadas (^{Hou et al., 2015}; ^{An & Qin, 2018}; ^{Semedo et al., 2018}; ^{Yu et al., 2021}). Asimismo, se ha observado la inhibición de la expresión del gen nirS, que controla el paso de reducción de NO₂^- a NO y del gen nosZ, que controla el paso de la reducción de N₂O a N₂, por la presencia de sulfonamidas y tetraciclinas. Se ha reportado una disminución en la expresión de genes nirS y nosZ expuestos a SMX de 0.030 y 0.036 FC respectivamente (^{An & Qin, 2018}; ^{Li et al., 2021}) asociada también con la acumulación de intermediarios nitrogenados (Tabla 5). De esta forma, las sulfonamidas no solo afectan la concentración de los genes desnitrificantes sino también su actividad (^{Gao et al., 2012}; ^{Zhang et al., 2022}). Hasta el momento, solo se ha observado la disminución en la abundancia de los genes de la enzima nitrato reductasa narg y napA (el 37 y 50% respectivamente) en presencia de OTC (^{Yu et al., 2021}). Igualmente, la variación en la abundancia de los genes desnitrificantes podría ser posiblemente debida al tipo y concentración de antibióticos, así como al tiempo de exposición.

Es importante notar que no todos los antibióticos inhiben la expresión de los genes de la desnitrificación, ya que existen antibióticos que la promueven, hecho que se ha asociado con la presencia de bacterias hospederas resistentes (^{Li et al., 2021}). De esta forma, en diferentes estudios realizados bajo condiciones desnitrificantes con antibióticos como OFL, TYL, OTC y mezclas de sulfonamidas como SFD y SMX, se ha observado el aumento del número de copias de los genes narG, napA, nirS, nirK, cnorB, qnorB y nosZ entre 1 y 5 órdenes de magnitud o bien entre 10 y 100% en su abundancia relativa (^{Sun et al., 2017}; ^{Tong et al., 2019}; ^{Zhang et al., 2019}; ^{Feng et al., 2020}; ^{Yu et al., 2021}). También se ha observado un aumento en la expresión de los genes nirS y nosZ en un cultivo axénico con fluoroquinolonas como CIP (^{Ruan et al., 2020}). Hasta el momento se desconoce el efecto de antibióticos como β-lactámicos u otros tipos de sulfonamidas, tetraciclinas, fluoroquinolonas, así como macrólidos sobre la abundancia y expresión de los genes desnitrificantes, aunque sí se sabe que han tenido efectos negativos sobre el comportamiento cinético de la desnitrificación. El hecho de utilizar consorcios microbianos dificulta la obtención de resultados, por lo que se requiere más investigación sobre estos temas en presencia de otros antibióticos.

Detección de genes de resistencia a antibióticos (GRA) en comunidades desnitrificantes expuestas a antibióticos. Se ha reportado la presencia de GRA en lodos desnitrificantes expuestos a diferentes concentraciones de antibióticos y tiempos de exposición, asumiéndose que actúan como mecanismos de defensa a la presencia de estos compuestos. Se ha registrado la presencia de diferentes GRA, por ejemplo: sul¸ cuando lodos desnitrificantes son expuestos a sulfonamidas, erm en presencia de macrólidos y tet en presencia de tetraciclinas (^{Hou et al., 2015}; ^{Zhang et al., 2019}; ^{Li et al., 2020}) (Tabla 6, material suplementario). El aumento de la abundancia de GRA se ha observado por distintas causas, ya sea por la proliferación de bacterias resistentes a antibióticos (^{Zhou et al., 2017}), por la presencia de altas concentraciones de antibióticos (^{Zhao et al., 2021}) o bien como mecanismo de protección de los microorganismos a la presencia del antibiótico (^{Yu et al., 2021}). En presencia de tetraciclinas se ha observado el aumento de la abundancia relativa de diferentes genes tet desde un 32% y hasta 5 veces de su valor inicial (^{Feng et al., 2020}). Asimismo, se ha observado en presencia de SMZ, TYL y TET el aumento del número de copias de los GRA como sul1, sul2, tetA, tetC, tetX y ermQ entre 1 y hasta 5 órdenes de magnitud (^{Hou et al., 2015}; ^{Zhang et al., 2019}; ^{Li et al., 2020}). Es notorio que en presencia de TYL se ha reportado un aumento en el número de copias de GRA como tet, sul y erm, es decir, la sola presencia de un antibiótico estimula el aumento de diferentes GRA. En este sentido, ^{Zhao et al. (2021)} reportan la predominancia de GRA propios del antibiótico utilizado, además de detectar la presencia de otros tipos de GRA, efecto referido de igual manera por ^{Wu et al. (2017)}. Se ha observado que el aumento en la detección de los GRA está relacionado con su actividad para promover la resistencia a antibióticos. En un estudio realizado en una planta piloto con etapa desnitrificante, se encontró que la expresión génica de los GRA era igual para los diferentes genes de resistencia detectados, indicando que la actividad de resistencia estaba en funcionamiento (^{Hou et al., 2019b}), lo cual posiblemente puede contribuir a la diseminación de la resistencia. También se ha registrado la disminución de la abundancia de GRA asociada a la disminución del número de microorganismos hospederos de los GRA; a la disminución de factores que favorecen la transferencia horizontal de genes (^{Shin et al., 2020}), así como a la disipación del antibiótico (^{Sun et al., 2017}). En este sentido, se ha reportado la disminución del número de copias de entre 1 y 4 órdenes de magnitud de diferentes GRA (^{Sun et al., 2017}; ^{Zhang et al., 2019}), así como la disminución del 16 al 50% de diferentes genes tet, en presencia de tetraciclina (^{Yu et al., 2021}). Hasta el momento, en diferentes estudios se ha registrado la tendencia creciente de detección de GRA en lodos desnitrificantes, lo cual podría ser un problema en el futuro, ya que la resistencia a antibióticos se puede prolongar a bacterias patógenas, requiriéndose de la generación de nuevos antibióticos, los cuales, a su vez, continuarán aumentando la contaminación de aguas, siendo ésto un ciclo interminable. Las investigaciones se deben enfocar en la eliminación de antibióticos de las aguas bajo condiciones desnitrificantes, así como en la búsqueda de tratamientos para la eliminación de los GRA.

Conclusiones principales y perspectivas. La creciente contaminación de las aguas residuales por nitrato y antibióticos es un problema que ha ido incrementando con el paso del tiempo. Ante esta situación, el proceso biológico de la desnitrificación puede ser una buena alternativa para la eliminación simultánea de estos dos compuestos presentes en aguas residuales, ya sean de origen municipal, o provenientes de residuos agrícolas o de rastros. El proceso respiratorio desnitrificante puede realizarse en diferentes sistemas operativos, como los llevados a cabo en lotes o bien, en sistemas dinámicos como los reactores SBR y reactores alimentados en continuo, como UASB y EGSB, entre otros. Bajo condiciones desnitrificantes, la concentración, tipos de antibióticos y mezclas de estos presentes en el agua, afectan el comportamiento fisiológico de los lodos depuradores, en términos de la eficiencia de eliminación del nitrato y de los antibióticos, así como su desempeño cinético en términos de velocidades específicas. De esta forma, la eliminación de antibióticos puede variar desde un 1 hasta un 93%. Se debe prestar mayor atención al control de la relación C/N y a la posible adición de fuentes carbonadas que potencien o permitan obtener un mejor desempeño del proceso desnitrificante y, por tanto, mayores eficiencias de eliminación de los antibióticos. Es importante resaltar que bajo condiciones desnitrificantes y en la mayoría de los casos, se desconoce la mineralización y/o el grado de oxidación de los antibióticos, la generación de intermediario(s), así como su posible efecto tóxico o inhibitorio. De igual manera, se desconoce el efecto de otros antibióticos comúnmente utilizados sobre el proceso desnitrificante. La información revisada ha destacado que la presencia de antibióticos ejerce una presión sobre la diversidad microbiana desnitrificante presente en el medio ambiente. También se ha reportado que, dependiendo de la concentración y tipo de antibiótico, géneros desnitrificantes como Thauera y Comamonas pueden ser sensibles, resistentes y/o tolerantes a AMOX, SMX, CIP, STRP, TYL y CTC mientras que Pseudomonas es resistente a fluoroquinolonas y macrólidos. Hasta el momento solo se ha reportado que la exposición de lodos desnitrificantes a diferentes tetraciclinas (TET u OTC), sulfonamidas (SMZ) o bien a mezclas de estos antibióticos, disminuye el número de copias entre un 17-48% y 50-65% respectivamente de genes desnitrificantes como nirS y nosZ. Asimismo, se ha reportado una disminución en la expresión génica de nirS y nosZ. Esto podría ser un cuello de botella en el desempeño cinético de las enzimas desnitrificantes y causar la acumulación de nitrito u óxido nitroso. Es importante remarcar que, como un posible mecanismo de defensa a la presencia de antibióticos, se ha detectado tanto en lodos desnitrificantes como no desnitrificantes, la existencia de diferentes GRA, lo cual podría ser benéfico para la realización del proceso desnitrificante y a la vez llegar a ser un problema ambiental y ecológico importante. Finalmente, es necesario realizar más estudios sobre los efectos cinéticos, fisiológicos, así como los efectos en las poblaciones y genes de los lodos desnitrificantes expuestos a diferentes antibióticos, a fin de contribuir en la obtención de una eliminación más eficiente y estable de estos contaminantes del agua mediante la desnitrificación.