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INTRODUCCIÓN
Las microalgas y cianobacterias son una fuente renovadora del oxígeno de la atmósfera terrestre ya que son las responsables de aproximadamente el 50% del total de la fotosíntesis que se realiza en nuestro planeta (Gama, 2004). Estos microorganismos poseen gran variedad morfológica (unicelulares o formando filamentos, cadenas, colonias o cenobios) y habitan casi todos los cuerpos de agua en donde existan las condiciones más simples para crecer (Abalde et al., 1995; Lara et al., 1996).
Sin embargo, las microalgas y cianobacterias también se caracterizan por producir moléculas bioactivas, que pueden ser de utilidad para el hombre y el ambiente; por tanto, en los últimos años se ha incrementado el interés por la búsqueda de compuestos bioactivos en estos organismos, tales como: compuestos antibacterianos, anticancerígenos, antivirales, antitumorales, antiinflamatorios y anticoagulantes (Blaine y Pyne, 1988; Schlegel et al., 1999; Shimizu, 2003; Nurby et al., 2009; Silva et al., 2020; Roopashri y Savitha, 2022). Estos metabolitos secundarios que producen las algas se deben a una respuesta como defensa química contra los herbívoros, competencia por el espacio y nutrientes entre otras y al ser liberadas en su entorno, constituyen una herramienta estratégica para su defensa en un medio tan competido (Ördög et al., 2004; Alvarez-Hernández et al., 2019).
Entre 1930 y 1940 se demostró la producción de diversas sustancias biológicamente activas, tal es el caso de la “Chlorelina” obtenida a partir de ácidos grasos de Chlorella vulgaris (Beyerinck), la cual se ha identificado como un potente activo antibacteriano; así mismo se reporta la actividad inhibitoria de diez extractos metanólicos correspondientes a tres géneros de microalgas clorofitas Desmococcus, Chlorella y Scenedesmus, probados contra diferentes cepas bacterianas Gram + y Gram - (Chu et al., 2004; Ördög et al., 2004). Pérez-Gutiérrez (2007) evaluó la actividad antimicrobiana de extractos hexánico, clorofórmico y metanólico de Oedogonium capillare (Kützing ex Hirn) probados ante ocho diferentes bacterias, donde se observó un amplio espectro antibacteriano en el extracto hexánico en comparación con los otros dos.
En el caso de las cianobacterias, Blaine y Pyne (1988) señalan el uso de la cianobacteria Nostoc para tratar la gota y el cáncer y la especie Arthrospira platensis (Gomont) ha sido estudiada por su potencial antibacteriano y por producir el ácido pipecólico vía a-aminoadipato-b-semialdehído, el cual favorece el metabolismo del aminoácido lisina, además de ser un precursor importante de numerosos metabolitos secundarios (Abedin y Taha, 2008; Kaushik y Chauhan, 2008; Naranjo-Briceño et al., 2010).
Las lectinas son proteínas de origen no inmune, que unen carbohidratos y que aglutinan varios tipos de células y glicoconjugados (Goldstein et al., 1980). Su presencia se ha reportado en todo tipo de células y tejidos, se les ha encontrado en casi todos los taxa, desde vira hasta vertebrados (Gold y Balding, 1975). Se ha podido observar que las lectinas son sumamente importantes en interacciones ecológicas altamente específicas como el reconocimiento de partículas alimenticias del mismo tamaño que son identificadas químicamente por parte de los bivalvos que se alimentan de microalgas (Pales et al., 2010). Una gran cantidad de protozoarios se alimentan de otros protozoarios, bacterias e incluso de pequeños crustáceos. Es claro que no se alimentan indiscriminadamente, sino que presentan cierta selectividad en sus relaciones depredador-presa. El reconocimiento a nivel bioquímico señala al depredador el grado de beneficio que le puede brindar esa presa y esto en particular es un tema recurrente en la literatura (Martel, 2009). Estas moléculas también están relacionadas al reconocimiento simbionte en algunos invertebrados como los corales que reconocen a zooxantelas, (Symbiodinium spp.) e incluso son capaces de diferenciarlos para no digerirlos y mantenerlos en condiciones de supervivencia en sus células endodérmicas (Koike et al., 2004). Sin embargo, la presencia de lectinas ha sido reportada solo en algunas pocas especies de cianobacterias y microalgas (Chu et al., 2004, 2007). Chu et al. (2004) han detectado actividad aglutinante en 18 especies de Chlorella spp., 16 especies de Chlamydomonas spp., tres especies de Spirulina spp., dos especies de Scenedesmus spp. y una especie de los géneros Synechococcus, Selenastrum, Monoraphidium, Coelastrum y Eutetramorus. Estas especies aglutinaron eritrocitos nativos y tratados con papaína y tripsina. En Chu et al. (2007) reportaron actividad aglutinante en 32 de 43 cepas de microalgas y cianobacterias contra eritrocitos de humano, vaca, oveja y cerdo. Destaca la investigación de algunas lectinas provenientes de cianobacterias que se han usado en el modelo anti-VIH con excelentes resultados, tal es el caso de la lectina de Oscillatoria agardhii (Gomont) (OAA) que inhibe la cepa silvestre de VIH y la cepa de VIH-1 (Férir et al., 2014). La cianovirina-N, aislada de Nostoc ellipsosporum (Rabenhorst ex Bornet y Flahault), ha inhibido las cepas de VIH-1 y 2, así como el virus de la inmunodeficiencia de simios (Boyd et al., 1997). La Scytovirina, aislada de la cianobacteria Scytonema varium (Kützing ex Bornet y Flahault) que requiere el amino terminal para así expresar la potencia inhibitoria contra el virus de inmunodeficiencia humana (Alexandre et al., 2013; Garrison et al., 2014). La lectina aislada de Microcystis viridis (A.Braun) Lemmermann inhibe la fusión con la célula que es mediada por la cubierta del virus VIH tipo 1 (Yamaguchi et al., 1999).
Debido a la amplia diversidad y complejidad de estos microorganismos, se requieren investigaciones enfocadas en detectar este tipo de metabolitos y así poder dar soluciones acertadas a problemáticas actuales. En el presente trabajo probamos el potencial de algunas especies de microalgas y cianobacterias como aglutinantes de eritrocitos (presencia de lectinas) y bactericidas, considerando la influencia de los sistemas y medios de cultivo y producción de estos microorganismos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las cepas de microalgas y cianobacterias utilizados en esta investigación pertenecen a la colección de Cultivos del Laboratorio de Ficología Aplicada UAMI; la cual cuenta con más de 400 cepas aisladas de diferentes regiones de la República Mexicana y se están trabajando en proyectos de investigación aplicada en búsqueda de beneficios para el hombre y el ambiente. Estas fueron aisladas de las siguientes localidades: del lago de origen volcánico Chalchoapan, Veracruz (Chlorella vulgaris, Chlorella kessleri); del lago de Chapultepec, Ciudad de México (Desmodesmus quadricauda, Tetradesmus obliquus); del Lago de Texcoco, Estado de México (Arthrospira platensis); del estero Garrapatas Salado Norte, Tamaulipas (Spirulina subsalsa); de una muestra de suelo agrícola (Neochloris oleoabundans); de la zona marina de Veracruz (Phaeodactylum tricornutum); del lago de Chapala, Jalisco (Tetradesmus dimorphus).
Cultivos en laboratorio. Se seleccionaron las cepas clonales de microalgas Chlorophyta: Chlorella vulgaris, Chlorella kessleri (Fott y Nováková), Desmodesmus quadricauda (Turpin) Bréb, Neochloris oleoabundans (S. Chantanachat y Bold), Tetradesmus dimorphus (Turpin) M. J. Wynne, Tetradesmus obliquus (Turpin) M. J. Wynne, Bacillariophyta: Phaeodactylum tricornutum (Bohlin) y las cianobacterias: Arthrospira platensis (Gomont), Spirulina subsalsa (Oersted ex Gomont). Las cepas se escalaron cuando se encontraban en fase de crecimiento exponencial de un volumen inicial de 10 mL, (tubos de ensayo con tapón de bakelita) a matraces Erlenmeyer de 100 mL, 500 mL y 3 L. De ahí se pasaron a fotobiorreactores de 16 L, cada cultivo se estableció por triplicado (Fig. 1).
Estos cultivos se mantuvieron en el laboratorio de Ficología Aplicada UAMI, con ciclo de luz obscuridad 12:12 h, a 22 ºC y 166.8 μmol m-2 s-1 de irradiancia.
Cultivos en planta piloto. Los inóculos en sistemas de 16 L se trasladaron a la Planta Piloto de Cultivo de microalgas ubicada en la Universidad Iberoamericana de Puebla (UIAP) para escalar en fotobiorreactores tubulares de 80 L, y estanques tipo raceways de 300 y 3000 Litros (Fig. 2). Aquí las condiciones fueron luz natural, aireación constante por burbujeo, temperaturas de 2 - 40 °C y las pruebas se realizaron por duplicado.
Figura 2 Sistemas de cultivo de la Planta Piloto en la UIAP. a. Fotobiorreactores de 16 L, b. Fotobiorreactores de 80 L, c. Estanques tipo raceways de 300 L, d. Estanques tipo raceways de 3000 L.
Medios de cultivo. El medio que se utilizó para las microalgas fue un fertilizante foliar (Bayfolan forte ®) en una proporción de 1 mL por litro de cultivo (Rodríguez-Palacio, 2018), para las Bacillariophyta se ocupó el medio F/2 (Guillard y Rhyter, 1962) y para las cianobacterias se usó el medio Jourdan modificado (Jourdan mod) (Rodríguez-Palacio, 2020), Zarrouk (Rajasekaran et al., 2016) y Spirulina Medium (UTEX) (https://utex.org/products/spirulina-medium?variant=30991737454682).
Cosecha
Se cosechó la biomasa en fase de crecimiento estacionaria, tomando 16 L de cada sistema de cultivo. Se decidió cosechar en fase estacionaria por ser un momento de estrés debido a la falta de nutrientes y alta competencia en el cultivo y por lo tanto fase de producción de metabolitos secundarios. La biomasa se concentró por sedimentación y centrifugación, se almacenó en tubos tipo Falcon previamente rotulados de 50 mL y se congelaron. La biomasa se liofilizó y se preservó hasta su análisis.
Para los bioensayos también se ocupó biomasa cosechada de experimentos de biorremediación de lixiviados orgánicos (LBO) y agua residual municipal (ARM) (Rodríguez Palacio et al., 2018).
Lectinas. Preparación de extractos. Se extrajo un gramo de biomasa algal liofilizada con 10 mL de solución amortiguadora de fosfatos (PB) pH 7.2. Se centrifugó a 1 000 x g durante 15 minutos y el sobrenadante se filtró en un equipo Millipore® a través de un filtro de 0.22 µm. El extracto se guardó a -20 °C para las pruebas de aglutinación.
Reactivo de eritrocitos. Se obtuvo sangre humana por venipuntura de cuatro donadores sanos, de los tipos (O, A, B y AB positivos), se le agregó formol siguiendo las recomendaciones de Nowak y Barondes (1975) se guardó como una suspensión al 2 % en PB a 4°C, para la detección de actividad aglutinante.
Ensayos de aglutinación. Las pruebas de aglutinación se realizaron por medio de diluciones, esto se hizo en placas de microtitulación de polipropileno de fondo U. A cada pozo se le añadieron 50 mL de PB, el primer pozo sirvió como testigo y a partir del segundo se agregaron 50 mL del extracto a probar y se realizaron diluciones seriadas, por último, se agregó 50 mL del tipo sanguíneo O, A, B o AB a todos los pozos y la placa se dejó reposar por dos horas a temperatura ambiente. Se registró la aglutinación positiva macroscópicamente. Los valores de título se expresaron como el recíproco de la más alta dilución que provocó aglutinación (Muñoz et al., 1985, Alvarez-Hernández et al., 1999).
Antibiosis. Siembra de las bacterias. Se utilizaron las bacterias Gram + Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn; Staphylococcus aureus (Rosenbach) y Gram - Enterobacter aerogenes (Hormaeche y Edwards), Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers, Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula; Salmonella thyphimurium (Schroeter) Migula.
Para la siembra se preparó caldo nutritivo y agar base sangre en agua destilada según las indicaciones de los fabricantes y se esterilizaron en autoclave durante 15 minutos a 121 ºC y 15 libras de presión. Una vez fríos se realizó la siembra en campana de flujo laminar con un asa de platino. Se dejaron incubar a 36 ºC por 2 días y pasado este tiempo se conservaron en refrigeración hasta su uso.
Preparación de los extractos y sensidiscos. Se utilizó 1 g de biomasa de cada especie y se sometió a extracción liposoluble e hidrosoluble, mediante agua y metanol al 99.8 % respectivamente, en una proporción 1:50 (p/v). Para la fracción hidrosoluble se sometió a un proceso de congelado-descongelado por una hora, durante 5 ocasiones, para asegurar la ruptura celular. Para el extracto metanólico se dejó reposar 48 horas en refrigeración a una temperatura de 4 ºC, posteriormente ambos se centrifugaron a 5000 rpm por 20 min, se recuperó el sobrenadante, y se evaporó a temperatura ambiente.
Una vez seco, se resuspendió con 10 mL de agua o metanol según la fracción. Se manejaron los siguientes volúmenes A con 50 mL, B con 100 mL y el control con 50 mL. Se cargaron los sensidiscos elaborados con papel Whatman No. 42, con ayuda de una micropipeta, y se colocaron en una cámara hermética de luz UV durante 2 días.
Bioensayo en placa. Se sembraron las bacterias en cajas Petri con agar bacteriológico por la técnica de difusión en placa. Se colocaron los sensidiscos cargados con tres diferentes concentraciones del extracto algal y un control. Las cajas se incubaron a 36º C y se examinaron pasadas las 24, 36 y 48 horas. Se midió cada halo de inhibición empleando un vernier. Los valores obtenidos se promediaron, obteniendo así el diámetro promedio utilizado como índice de actividad antibacteriana. Se utilizó como convención el símbolo + para indicar la presencia de actividad y - para la ausencia de actividad. Las pruebas se realizaron por triplicado (Bauer et al. 1966).
Se sometieron a ensayos de aglutinación nueve especies de las cuales seis pertenecen a la División Chlorophyta, una a Bacillariophyta y dos al Phylum Cyanobacteria. Tres especies (33.3%) provocaron la aglutinación de eritrocitos formalinizados nativos (sin tratamiento enzimático) dos de ellas de Chlorophyta: Tetradesmus obliquus y Desmodesmus quadricauda y una cianobacteria Arthrospira platensis (Tabla 1).
Tabla 1 Resultados de las pruebas de aglutinación con los extractos de microalgas y cianobacterias. El signo - indica la ausencia de actividad.
| Sistemas de cultivo | |||||||||
| Cerrados (fotobiorreactores) | Abiertos (estanques tipo raceways) | Tipo de Sangre | |||||||
| Chlorophyta | 16 L | 80 L | 300 L | 3000 L | Medios de cultivo | O+ | A+ | B+ | AB+ |
| Chlorella vulgaris | X | Bayfolan forte | - | - | - | - | |||
| Chlorella kessleri | X | Bayfolan forte | - | - | - | - | |||
| Desmodesmus quadricauda | X | Bayfolan forte | 26 | 26 | 26 | 25 | |||
| D. quadricauda | X | Bayfolan forte | 24 | 24 | 25 | 22 | |||
| D. quadricauda | X | Bayfolan forte | 27 | 27 | 27 | 27 | |||
| Neochloris oleoabundans | X | LBO | - | - | - | - | |||
| N. oleoabundans | X | LBO | - | - | - | - | |||
| N. oleoabundans | X | Bayfolan forte | - | - | - | - | |||
| N. oleoabundans | X | ARM | - | - | - | - | |||
| Tetradesmus dimorphus | X | Bayfolan forte | - | - | - | - | |||
| Tetradesmus obliquus | X | Bayfolan forte | 23 | 26 | 26 | 26 | |||
| T. obliquus | X | Bayfolan forte | 25 | 24 | 24 | 24 | |||
| T. obliquus | X | Bayfolan forte | 26 | 26 | 26 | 26 | |||
| T. obliquus | X | Bayfolan forte | 26 | 26 | 26 | 26 | |||
| Bacillariophyta | |||||||||
| Phaeodactylum tricornutum | X | F/2 | - | - | - | - | |||
| P. tricornutum | X | ARM | - | - | - | - | |||
| Cyanobacteria | |||||||||
| Arthrospira platensis | X | Zarrouk | 26 | 26 | 26 | - | |||
| A. platensis | X | Jourdan mod | 26 | 26 | 26 | - | |||
| A. platensis | X | Utex | - | - | - | - | |||
| Spirulina subsalsa | X | Jourdan mod | - | - | - | - | |||
| S. subsalsa | X | Jourdan mod | - | - | - | - | |||
En los organismos que mostraron aglutinación, los títulos que se observaron fueron similares, con pequeñas variaciones. También las dos especies de Chlorophyta aglutinaron los cuatro tipos sanguíneos, esto no se presentó en la cianobacteria que falló en aglutinar al tipo AB positivo; aquí debemos destacar que esta especie no presentó actividad aglutinante y cuyas condiciones de cultivo fueron: columnas de 80 litros y medio de cultivo UTEX.
La aglutinación que presentaron las dos especies de Chlorophyta no dependió del medio de cultivo ya que todas crecieron en Bayfolan forte, sin embargo, se nota una influencia del sistema de cultivo en la intensidad de la aglutinación, en los dos casos, las que crecieron en columnas de 80 litros, disminuyó la actividad de aglutinación en dos títulos.
Los Raceways de 300 y 3000 litros fueron los sistemas de cultivo cuyas algas mostraron mayor potencia de aglutinación. En el caso de la cianobacteria Arthrospira platensis la aglutinación no se presentó con el tipo sanguíneo AB, mientras que ante los demás tipos de sangre la aglutinación fue constante.
En los extractos resuspendidos con agua destilada (Tabla 2), solo una especie (Desmodesmus quadricauda) presentó actividad biológica ante Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, bacteria Gram negativa (Fig. 3). La actividad biológica observada correspondió a un efecto bacteriostático, el cual a diferencia de la actividad antibiótica, no produce la muerte a las bacterias, sin embargo, inhibe o retarda el crecimiento bacteriano.
Tabla 2 Resultados de las pruebas de actividad antibiótica con los extractos de microalgas y cianobacterias en el extracto acuoso El símbolo + indica presencia de actividad y - indica la ausencia de actividad
| Gram + | Gram - | |||||
| Clorofitas | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Chlorella vulgaris | - | - | - | - | - | - |
| Chlorella kessleri | - | - | - | - | - | - |
| Desmodemus quadricauda | - | - | - | - | + | - |
| Neochloris oleoabundans | - | - | - | - | - | - |
| Tetradesmus dimorphus | - | - | - | - | - | - |
| Tetradesmus obliquus | - | - | - | - | - | - |
| Cianobacteria | ||||||
| Arthrospira platensis | - | - | - | - | - | - |
| Spirulina subsalsa | - | - | - | - | - | - |
1. Bacillus subtilis, 2. Staphylococous aureus, 3. Enterobacter aerogenes, 4. Escherichia coli, 5. Pseudomonas aeruginosa, 6. Salmonella typhimurium
Figura 3 Actividad bacteriostática determinada mediante la técnica de difusión de placa. El extracto acuoso de Desmodesmus quadricauda inhibió el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. El diámetro del halo de inhibición promedio fue de 4 mm para el volumen de extracto A con 50 mL, y 5 mm para el B con 100 mL.
DISCUSIÓN
Es sabido que las lectinas se expresan dependiendo de diversas condiciones del medio donde viven las algas, entre estas condiciones se puede nombrar el tipo de hábitat, la presión de selección por depredadores, el clima e insolación, la estación de año y la zona de recolecta, todos estos factores son capaces de modificar la síntesis de proteínas (Fabregas, 1989; Hori et al., 1993; Padmakumar y Ayyakkannu, 1997). Los resultados mostraron pequeñas diferencias en los títulos de aglutinación para las mismas especies que crecieron en diferentes sistemas de cultivo como Desmodesmus quadricauda y Tetradesmus obliquus. Se observó que los sistemas de cultivo con mayor volumen (raceways de 300 y 3000 litros) mostraron títulos de aglutinación mayores que los de menor volumen (garrafones de 16 y columnas de 80 litros).
La influencia del tipo de medio y de las condiciones de cultivo ha sido reportado para la actividad antibacteriana de Synechococcus leopoliensis por Noaman et al. (2004). Este fenómeno puede estar relacionado con las hipótesis que han expuesto estos autores sobre la modificación en la síntesis debido a condiciones ambientales. Se destaca la influencia de los sistemas de cultivo como una variable más a considerar para la expresión de estas proteínas en microalgas.
Desmodesmus quadricauda ha sido reportada previamente por poseer aglutininas (Chu et al., 2007); los títulos de aglutinación obtenidos por este investigador coinciden con los del presente trabajo. Varias especies de Chlorella, particularmente C. pyrenoidosa (Chu et al., 2004) y Chlorella ellipsoidea (Liao y Huang, 2000) han aglutinado eritrocitos tripsinisados y papinizados. Las especies de Chlorella, C. vulgaris y C. kessleri que se sometieron a los ensayos no mostraron aglutinación lo cual puede estar relacionado con la especie y cepa que se utilizó, este fenómeno se presenta con mucha frecuencia en macroalgas (Chung et al., 2003; González del Val et al., 2001; Padmakumar y Ayyakkannu, 1997; Sreenivasa y Parekh, 1981). Otra razón para no observar aglutinación es que en este trabajo se utilizó una solución de eritrocitos sin tratamiento enzimático, lo cual elimina impedimentos estéricos permitiendo que las lectinas se unan a los determinantes glucosídicos de las células sanguíneas (Ainouz, et al., 1992; Benevides et al., 1999).
Chu et al. (2004) también han reportado aglutinación con una cepa de Arthrospira platensis ATCC 53844 y eritrocitos tratados enzimáticamente, proceso que permite eliminar impedimentos estéricos en la superficie de los eritrocitos permitiendo que las lectinas se unan más fácilmente a la superficie de éstos, promoviendo la aglutinación con menor concentración de lectina. En el caso del presente trabajo, no se usaron eritrocitos tratados enzimáticamente y sin embargo los títulos de aglutinación fueron iguales a los reportados por estos autores. La lectina puede poseer una estructura tal que le permita unirse a determinantes glucosídicos aun con algún tipo de impedimento estérico en la superficie del eritrocito.
La nula aglutinación que presentó la especie que creció en medio UTEX, puede deberse a la composición del medio de cultivo, como fue reportado por Noaman et al. (2004).
Con respecto a la actividad antibiótica, en la literatura se manifiestan diversas opiniones al considerar la resistencia o sensibilidad a una cepa bacteriana cuando se llevan a cabo pruebas antimicrobianas con extractos derivados de microalgas. Algunos autores utilizan como referencia para considerar el efecto antimicrobiano como positivo ≥ 2 mm de diámetro promedio, tal es el caso de Jaki et al., 1999; Mian et al., 2003; Rosales, 2007. De manera que, bajo estas consideraciones de positivo para actividad antibiótica, se puede inferir que existe actividad bacteriostática en el extracto acuoso de Desmodemus quadricauda contra la cepa bacteriana gram negativa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Para la especie Desmodesmus quadricauda,Abedin y Taha (2008) reportaron actividad en cuatro extractos probados contra cuatro bacterias, mismas que se utilizaron en este estudio. Ördög et al., 2004 reportaron actividad antibiótica en dos géneros de Scenedesmus sp. ante S. aureus y Alternaria sp. con halos que van de 5 a 10 mm respectivamente. Si bien se ha reportado en muchos microorganismos la producción de sustancias con actividad biológica, de igual forma se ha informado que algunas condiciones ecológicas como la competencia, la herbivoría y la densidad, entre otras pueden favorecer la producción de metabolitos (Benkendorff et al., 2001; Ördög et al., 2004; Chadwick et al., 2007; Hernández et al., 2008; Alvarez-Hernández et al., 2019) de manera que en situaciones de estrés es cuando suele presentarse una mayor producción de estos metabolitos, los cuales son liberados a su entorno, constituyendo una herramienta estratégica para su defensa en un medio competido (Ördög et al., 2004).
En México, los autores no encontraron trabajos recientes sobre estos temas y por tanto se requiere más investigación aplicada para estar a la vanguardia. El trabajar con cepas nativas mexicanas abre un panorama de usos y aplicaciones potenciales para beneficio del hombre y del ambiente.
