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INTRODUCCIÓN
Las enfermedades transmitidas por alimentos continúan siendo una amenaza a la salud pública alrededor del mundo y causa importante de mortalidad. Aunque la mayoría de los casos son leves y se asocian a síntomas gastrointestinales agudos, en ocasiones son más severas y peligrosas para la vida, especialmente en niños, personas inmunocomprometidas y adultos mayores; en ciertas situaciones la infección puede ocasionar enfermedades crónicas (Blackburn y McClure 2002).
El consumo de moluscos bivalvos ha aumentado de manera significativa en los últimos años y algunas especies son consumidas preferentemente crudas (ostras) o poco cocidas (mejillones) (FAO 2008). La importancia de estos organismos es que, al ser filtradores, pueden acumular contaminantes que se hallan en la columna de agua (Ristori et al. 2007, Lee y Silk 2013). Numerosos autores demostraron que las ostras pueden concentrar niveles de contaminantes 100 veces superiores a los existentes en el agua circundante (Soto Varela et al. 2016).
La ostra del Pacífico, Crassostrea gigas, nativa de Japón, Corea, China y Rusia, fue introducida en muchos ecosistemas costeros del mundo con fines de cultivo debido a su rápido crecimiento y su tolerancia a un amplio rango de condiciones ambientales (Shatkin et al. 1997). Este molusco genera más del 90 % de la producción mundial de ostras (FAO 2010), por lo cual, su producción comercial se ha convertido en la principal vía de dispersión (Nehring 2006, Troost 2010). El cultivo de C. gigas en la Argentina (Bahía Anegada, 40º de latitud Sur) comenzó en 1981, y en los años siguientes se naturalizó formando extensos arrecifes en las zonas intermareales. Dos Santos y Fiori (2010) reportaron por primera vez la presencia de C. gigas en el estuario de Bahía Blanca (38º de latitud sur); mencionan que aun existiendo evidencias que permiten afirmar que está en continua expansión, su rango de distribución actual es incierto.
La bacteria Escherichia coli (Ec) es utilizada tradicionalmente como indicador de contaminación fecal. Se asume que su comportamiento es similar al de otras bacterias del mismo origen cuando son liberadas al ambiente (Lipp et al. 2001, Jeng et al. 2005). Su detección alerta sobre la posible presencia de microorganismos patógenos intestinales, con el consiguiente riesgo higiénico-sanitario para la población.
El género Salmonella incluye algunos de los patógenos más importantes en alimentos crudos, especialmente aquellos de origen animal (González et al. 2009). Su presencia en sistemas acuáticos se atribuye a las descargas de aguas residuales urbanas y agrícolas (Baurdart et al. 2000).
Históricamente, las epidemias causadas por Vibrio a nivel mundial se asocian a zonas tropicales y subtropicales, sin embargo, se han reportado brotes en regiones con aguas de baja temperatura (Andersson y Ekdahl 2006, Fuenzalida et al . 2007). Por lo que es necesario incrementar los estudios de estos patógenos en ambientes no considerados endémicos. V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus son los principales responsables de las enfermedades infecciosas emergentes y re emergentes en humanos (Morens et al. 2004, Wetz et al. 2014).
En Argentina, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA 2006) establece que los moluscos para consumo humano deben contener menos de 230 Ec por cada 100 g de carne y líquido intervalvar, y ausencia de Salmonella spp. en 25 g. Si bien la normativa para el consumo interno no exige la búsqueda del género Vibrio, varios mercados extranjeros (MINCETUR 2010) establecen como requisito para la importación de los moluscos bivalvos la ausencia de Vibrio parahaemolyticus, V. cholerae y V. vulnificus en 50 g de tejido.
En el estuario de Bahía Blanca existen registros previos de la presencia del género Vibrio (Vuano 2012, Baldini y Vuano 2014) y de Ec (Streitenberger y Baldini 2010, Pierini et al. 2012) en el agua, pero no se cuenta con datos sobre la calidad bacteriológica de las ostras implantadas en la zona.
Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la calidad bacteriológica de la ostra Crassostrea gigas, implantada en la zona interna del estuario de Bahía Blanca, además del agua y sedimentos donde se desarrollan.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio
El estuario de Bahía Blanca situado en el sudoeste de la provincia de Buenos Aires se extiende entre los 38º 42’ y 39º 25’ de latitud Sur, y entre los 61º 50’ y 62º 22’ de longitud Oeste, ocupando una amplia faja costera en dirección noroeste-sudeste (Streitenberger y Baldini 2010). Sobre su costa norte se encuentran varias localidades, siendo la de mayor importancia Bahía Blanca, con más de 350 000 habitantes. Estas poblaciones vuelcan sus efluentes cloacales, en su mayoría insuficientemente tratados, en las aguas superficiales costeras del estuario (Fig. 1).
Estaciones de muestreo
Se establecieron dos estaciones de muestreo en la zona interna del estuario de Bahía Blanca: Club Náutico (CN) de Ingeniero White y Puerto Cuatreros (PC) (Fig. 1). Entre junio de 2015 y junio de 2018, se realizaron 21 campañas. Se recolectaron manualmente agua subsuperficial (≈ 20 cm de profundidad), sedimentos superficiales (2 cm de profundidad) y ostras (Crassostrea gigas) de la zona intermareal. Se utilizaron recipientes estériles y aptos para cada caso. Las muestras se trasladaron refrigeradas al laboratorio y su procesamiento se realizó en menos de dos horas de su recolección (APHA, AWWA, WPCF 2012). Se registró la temperatura del agua in situ.
Análisis microbiológico
En las tres matrices (agua, sedimentos y tejido de ostras) se hicieron recuentos del indicador de contaminación fecal Ec y detección de Vibrio spp. Además, en el tejido de ostras se buscó el patógeno intestinal Salmonella spp.
Para la detección de Ec se utilizó la técnica de la doble capa, a fin de recuperar las bacterias estresadas por las condiciones ambientales. La revivificación se hizo durante 2 h en un medio de agar para recuento en placa (PCA; Merck, 5463) para posteriormente adicionar el medio Endo-C-Agar (Merck, 4044; Streitenberger y Baldini 2016). La incubación se realizó a 44.5 ± 0.5 ºC durante 24 h (Eijkman 1904). Los resultados para agua se expresaron en unidades formadoras de colonias por 100 mL (UFC/100 mL). Para la identificación bioquímica se realizaron las pruebas de indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y citrato (IMViC) y tres azúcares hierro (TSI, por sus siglas en inglés) (McFaddin 2003). Para la búsqueda de Ec en sedimentos, se resuspendieron 6 gramos en 54 mL de Locke (dilución 10-1), se agitó a 450 rpm durante 15 min en un agitador rotatorio (New Brunswick Scientific Company) y el homogeneizado se sembró siguiendo la misma metodología que para las aguas. Los resultados se expresaron como UFC por gramo de peso seco (UFC/g). Para la búsqueda de Ec y Salmonella spp. en tejido de ostras se usaron 30 g de músculo y de líquido intervalvar a los que se adicionaron 120 mL de agua peptonada para obtener una dilución de 10-1. Las muestras para Ec se sembraron siguiendo la misma técnica descrita previamente para las aguas, sólo que los resultados se expresaron como UFC/100 g de muestra de tejido de ostras. Para la detección de Salmonella spp. se realizó un pre enriquecimiento en agua peptonada amortiguada (preparada en el laboratorio a partir de sus componentes), posteriormente, un enriquecimiento selectivo en caldo tetrationato (Merck, 5285) e inmunoensayo con RapidCheck® Salmonella lateral flow (Romer Labs, AOAC Lic. Nº 030301), el cual, es sensible para detectar una Salmonella en 25 g de muestra. Los resultados positivos se confirmaron por aislamiento en agar Salmonella-Shigella (Merck, 7667), Hekctoen (Difco, 285340) y agar XLD (Difco, 278850). Finalmente, se realizó la tipificación bioquímica para confirmar el género (Pascual-Anderson y Calderón-Pascual 2000, Caffer y Terragno 2008).
Para el aislamiento de las especies de Vibrio se siguió la metodología descrita por el Manual de Procedimientos del Instituto Malbrán, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas-Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (INEI-ANLIS) “Dr. Carlos G. Malbrán” (INEI-ANLIS 2010) y el Manual de Procedimientos del Instituto de Salud Pública (Silva-San Cristóbal et al. 2008). Alícuotas de 10 mL de las muestras de agua, 6 g de sedimentos y 30 g de músculo, contenido visceral y líquido intervalvar de ostras se colocaron en distintos matraces Erlenmeyer con agua peptonada alcalina (APA-Britania: peptona de carne 1 %, NaCl 1 %, pH: 8.5 ± 0.2). Se incubaron 24 h a 37 ºC. Posteriormente, se aislaron en el medio selectivo tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS, MERCK) (ISO 1990, Kaysner y De Paola 2004). Las colonias se re aislaron en agar nutritivo (Merck) adicionado con 1 % NaCl y en el medio cromogénico CHROMagar Vibrio (Microbiología, Francia). Para la identificación bioquímica se utilizaron las pruebas propuestas por Alsina y Blanch (1994) y Silva San Cristóbal et al. (2008). A las colonias presuntivas de V. cholerae se les realizó la prueba del cordón (String test) y cultivo en agar sangre con eritrocitos de carnero (Britania) para observar su actividad hemolítica. Además, se llevó a cabo la reacción de Kanagawa en el medio especial agar Wagatsuma (preparado en el laboratorio con glóbulos rojos humanos). Esta prueba tiene por finalidad la detección de una hemólisis específica que se relaciona con la patogenicidad de cepas de Vibrio parahaemolyticus (Pascual-Anderson y Calderón-Pascual 2000).
Análisis estadístico
Para verificar los supuestos de normalidad y homocedasticidad los datos se transformaron a log10. Se aplicó una prueba t a dos colas para muestras apareadas. Los resultados fueron considerados significativamente diferentes p < 0.05 (InfoStat, Di Rienzo et al. 2011).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Como se observa en la figura 2, los mayores recuentos de Ec (expresados como media geométrica) se registraron en la estación CN siendo 1200 UFC/100 mL para aguas y 4200 UFC/100 g para el tejido de ostras. Es evidente la acumulación de esta bacteria en las ostras ya que los recuentos en músculo superaron el orden de magnitud de los registrados en el agua circundante. En el 66 % de las muestras de ostras de PC y en el 100 % de las de CN, los valores de Ec fueron mayores a lo establecido por la legislación vigente en Argentina (230 Ec/100 g), por lo cual, no serían aptas para consumo humano. La prueba t mostró diferencias altamente significativas entre los sitios muestreados para Ec en el tejido de ostras y en el agua (p < 0.01) (Cuadro Ia, b y Fig. 2). El alto índice de bacterias indicadoras de contaminación fecal en las ostras puede ser atribuido a que la zona está siendo afectada por el volcado de efluentes cloacales crudos. A esto se suma la capacidad concentradora de los moluscos bivalvos (Graü et al. 2004). No se encontraron diferencias significativas (p > 0.05) (Cuadro Ic) para los recuentos de Ec entre los sedimentos de los sitios muestreados. Como se observa en la figura 3, los recuentos de Ec en sedimentos de ambas estaciones fueron superiores a los de agua. Los valores en CN oscilaron entre 3.7 × 103 y 1 × 105 UFC/g de peso seco y en PC estuvieron entre 7 × 102 y 2.2 × 105 UFC/g. Rehmann y Soupir (2009) y Garzio-Hadzick et al. (2010), mostraron que los sedimentos albergan un mayor número de bacterias que el agua circundante, ya que en él encuentran protección y nutrientes que aumentan su persistencia de semanas a meses. De esta forma, el sedimento constituye un reservorio potencial de bacterias fecales y patógenas (Badgley et al. 2010) que podrían resuspenderse y volver a la columna de agua por corrientes de marea o distintas actividades humanas (Dorsey et al. 2013, Brinkmeyer et al. 2015). Esto último podría explicar la similitud de resultados entre aguas y sedimentos en el CN ya que es una zona somera en donde es posible la suspensión continua de bacterias.
Fig. 2 Recuentos del indicador de contaminación fecal Escherichia coli (Ec) en aguas y en tejido de ostras del Club Náutico (CN) y de Puerto Cuatreros (PC). Los resultados se expresan como medias geométricas de las unidades formadoras de colonias (UFC) por 100 mL de agua o 100 g de tejido de ostras. Las diferencias entre las estaciones en ambas matrices son altamente significativas (p < 0.01).
CUADRO I RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE t A DOS COLAS. SE COMPARAN LOS RECUENTOS DE Escherichia coli EN LAS DOS ESTACIONES DE MUESTREO Y EN LAS TRES MATRICES ESTUDIADAS
| a | b | c | |
| Estadistico “t” | 5.0857 | 13.8195 | 1.6537 |
| p | 0.0001 | 0.0001 | 0.1138 |
Las matrices estudiadas fueron: a) tejido de ostras, b) agua y c) sedimentos
Fig. 3 Comparación de los recuentos de Escherichia coli en aguas y sedimentos de los sitios muestreados: Club Náutico (CN) y Puerto Cuatreros (PC). Los resultados se expresan como medias geométricas de las unidades formadoras de colonias (UFC) por 100 mL de agua o por 100 gramos de peso seco de sedimento. Las diferencias entre las aguas de ambas estaciones son altamente significativas (p < 0.01), no así entre los sedimentos (p = 0.11).
Salmonella spp. se detectó en el 45 % de las muestras (n = 21) de tejido de ostras de CN. La totalidad de las muestras de PC fueron negativas para esta bacteria. La salmonela se encuentra con frecuencia en vertidos de granjas, en las aguas residuales humanas y en cualquier material con contaminación fecal. Cortes-Lara (2003) señala que concentraciones mayores de 1000 coliformes fecales/mL aumentan 50 % la probabilidad de encontrar Salmonella spp. y cualquier otro patógeno de origen intestinal (bacterias, virus o parásitos).
Vibrio spp. fue detectado en las dos estaciones de muestreo durante todo el período de estudio (Fig. 4). La predominancia de V. alginolyticus sobre las demás especies concuerda con resultados obtenidos en estudios realizados en el mar del Caribe de Venezuela (Muñoz et al. 2012) y en el canal inglés al norte de Francia (Tall et al. 2012). Esta especie es la más abundante en el ambiente marino y es habitante recurrente en las costas de regiones templadas (Matté et al . 1994). Las vibriosis causadas por V. alginolyticus son esporádicas y conciernen en su mayoría a personas inmunocomprometidas, sin embargo, la importancia de su estudio se debe a la posibilidad de transferencia de genes de patogenicidad entre esta especie y V. parahaemolyticus y V. cholerae (Xie et al. 2005, González-Escalona et al. 2006, Kopprio et al. 2017).
Fig. 4 Especies de Vibrio aisladas de aguas, sedimentos y tejido de ostras del estuario de Bahía Blanca, Argentina
Vibrio vulnificus no se encontró en ninguna de las muestras. La ausencia de esta especie en los muestreos no necesariamente determina su inexistencia en el estuario ya que Vuano (2012) la reportó con anterioridad. Esta bacteria ses poco frecuente en ambientes estuarinos del sur de Argentina, como lo han demostrado investigaciones en la Patagonia, en las cuales, se identificó en muy baja proporción y asociada a microplancton (Kopprio et al. 2017).
Cuando se comparan los resultados de las aguas, los sedimentos y las ostras del estuario, se evidencia que las distintas especies están presentes en las tres matrices, salvo V. cholerae, que solamente se aisló del agua y de ostras (Fig. 5). El hallazgo de esta especie implica un riesgo, ya que se han reportado casos de infecciones por V. cholerae no-O1 y no-O139 por contacto con agua de mar o consumo de pescados de las zonas costeras del mar Báltico (Lukinmaa et al. 2006). La presencia de V. parahaemolyticus y V. cholerae en el tejido de las ostras representa un riesgo para la salud, ya que puede ser una vía directa de transmisión a la población por consumo de los ejemplares crudos o insuficientemente cocidos.
La distribución de vibrios en las diferentes matrices según la temperatura del agua se presenta en la figura 6. Se observa que a bajas temperaturas se reduce la frecuencia de aislamiento del género en agua. Sin embargo, en los sedimentos y las ostras no se refleja esta tendencia, sino más bien, manifiestan cierto grado de independencia a la temperatura ambiente. Otros autores también han comprobado que la abundancia de Vibrio spp. en sedimentos exhibe una moderada a insignificante correlación con la temperatura y salinidad del ambiente (Blackwell y Oliver 2008, Deter et al. 2010, Johnson et al. 2010). Por otro lado, la falta de correlación entre el número de especies de Vibrio en las ostras y el aumento de temperatura es un hecho curioso, ya que habría de esperarse que el aumento térmico pudiera acelerar el metabolismo de las ostras estimulando su filtración y, consecuentemente, la concentración de microorganismos en sus tejidos, lo cual, coincide con lo reportado por Deter et al. (2010) y Takemura et al. (2014). La realización de estudios cuantificando bacterias en las ostras del estuario sería útil para detectar la existencia de una relación entre el número de microorganismos y la temperatura del agua.
Fig. 6 Relación de la temperatura del agua con la detección de especies de Vibrio en las distintas matrices analizadas.
Con respecto a la evaluación de la actividad hemolítica de V. cholerae, se obtuvieron cuatro cepas β-hemolíticas, una α-hemolítica y tres que no presentaron dicha actividad. Este resultado alerta sobre la potencial patogenicidad de las cepas de V. cholerae aisladas. La citolisina-hemolisina de V. cholerae (VCC) pertenece a una familia de proteínas que generan daños en la membrana celular, llamadas colectivamente toxinas formadoras de poros (Heuck et al. 2001, Tweten 2005). La VCC se encuentra tanto en los serogrupos O1 como en los no-O1 y actúa sobre un diverso grupo de células eucariotas incluyendo eritrocitos, enterocitos y linfocitos (Mazumdar et al . 2011). La VCC es capaz de causar severos efectos citotóxicos tales como lisis celular, vacuolización y aumento de la apoptosis en células del epitelio intestinal (Figueroa-Arredondo et al. 2001, Saka et al. 2008). En este estudio, la reacción de Kanagawa practicada en las 29 cepas de V. parahaemolyticus arrojó resultados negativos.
CONCLUSIONES
En el presente trabajo se confirmó la presencia de Ec, Salmonella spp. y Vibrio spp. en la zona interna del estuario de Bahía Blanca. Anteriormente, sólo se contaba con registros en aguas de estos microorganismos (Streitenberger y Baldini 2010, Pierini et al. 2012, Baldini y Vuano 2014). Con este estudio, se extiende la información a otras matrices como sedimentos y ostras. Estas últimas de particular interés desde el punto de vista de la salud pública, ya que pueden actuar como vehículos de transmisión de patógenos a la comunidad.
En ambas estaciones de muestreo se evidenció una acumulación de Ec tanto en ostras como en sedimentos, aumentando hasta un orden de magnitud con respecto a lo registrado en el agua circundante. En el CN, además de los altos valores de Ec en las tres matrices, se detectó la presencia de salmonelas en ostras.
En todas las matrices de las dos estaciones, se aisló alguna especie del género Vibrio, incluyendo a las potencialmente peligrosas para el hombre: V. cholerae y V. parahaemolyticus. Esto era de esperarse ya que son autóctonas y están ampliamente distribuidas en los ambientes marinos y estuarinos a nivel mundial (Lara et al. 2011, Johnson et al. 2012). Por lo tanto, es necesario aumentar los estudios de estas especies de importancia clínica e incorporar información de los factores de patogenicidad.
Si bien en la zona de Bahía Blanca no hay una explotación comercial, los bancos de ostras estudiados están en un lugar muy accesible. Esto unido a que los animales son de buen tamaño, los hace atractivos para su recolección informal y consumo. Los resultados bacteriológicos obtenidos no cumplen, en la mayoría de los casos, con la legislación vigente de Argentina (230 Ec/100 g y ausencia de salmonelas en 25 g), por lo cual, representan un riesgo potencial para la salud humana por su consumo.
Se considera necesario continuar con los estudios de la calidad microbiológica de las ostras implantadas en el estuario de Bahía Blanca para generar información que provea herramientas a las instancias de control que les permita manejar y administrar adecuadamente la zona costera.
