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Introducción
Las plantas mantienen una constante interacción con los microorganismos que se desarrollan a su alrededor, mediante procesos bioquímicos como la señalización del regulador maestro TOR (por sus siglas en inglés: Target of Rapamycin), el cual funciona como receptor de señales ambientales regulando el crecimiento y metabolismo de eucariontes (Corona et al., 2018). En dichas interacciones interviene también la liberación de compuestos volátiles o difusibles como terpenos, compuestos sulfurados y sideróforos, entre otros (Cantúa et al., 2020; Hernández-León et al., 2015); a su vez, participan en el establecimiento de relaciones que pueden clasificarse como asociativas, simbióticas, neutrales o patógenas (Bouwmeester et al., 2019; Yadav et al., 2018); es por esto que las asociaciones planta-microorganismo están directamente relacionadas con la modulación del desarrollo, metabolismo y defensa vegetal (Agarwall et al., 2019; Wenke et al., 2019).
El cultivo del arándano (Vaccinium corymbosum L.) representa un potencial de desarrollo económico para México, ya que de su producción total anual (66,482 t) se exporta el 96.1 % al mercado estadounidense, siendo los estados de Jalisco, Michoacán y Sinaloa los principales productores de esta frutilla con un total de 31,912; 15,490 y 9130 t, respectivamente (SIAP, 2022). Para cumplir con la demanda actual, los productores se basan en el uso de productos sintéticos que afectan directamente a las comunidades microbianas de la rizósfera y disminuyen su diversidad, por lo que modifican la estructura y propiedades del suelo, llevándolo a su degradación y pérdida de fertilidad (Meena et al., 2020). Vaccinium tiene un amplio rango de interacciones, en su mayoría con ascomicetos que mejoran su nutrición mineral (Van Geel et al., 2020). Oidiodendron maius Pescie et al., 2021), Cadophora sp. y Lachnum sp. (Bizabani y Dames, 2015) se han identificado en las células rizodérmicas de plantas ericáceas sanas formando la micorriza ericoide, caracterizada por la presencia de finas bobinas de hifas intracelulares (Read, 1996) encargadas de conferir beneficios, como una mejor adquisición de nutrientes minerales (Pescie et al., 2023) y el alivio de estrés por sequía Mu et al., 2021), entre otros. También destaca su asociación con hongos endófitos septados oscuros, como Phialocephala fortinii, con capacidad de liberar enzimas capaces de disolver nutrientes insolubles como el fósforo (Daghino et al., 2022) o algunos hongos de la división Basidiomicota, destacando algunos Sebacinales (Vohník et al., 2016). Desafortunadamente la identidad de los hongos asociados con V. corymbosum en México es aún limitada, por lo que es necesario ampliar el conocimiento de su función y establecer herramientas de manejo que permitan su mejor aprovechamiento.
La especie vegetal A. thaliana puede ser utilizada como organismo modelo (Piacentini et al., 2019), ya que el amplio conocimiento de su genoma ha permitido la generación de líneas transgénicas con las que es posible analizar la expresión de genes clave en diferentes vías de señalización, convirtiéndose en una herramienta para explorar las respuestas vegetales (Méndez-Gómez et al., 2021). El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto promotor de crecimiento vegetal de seis hongos aislados de la raíz y suelo rizosférico de V. corymbosum sobre el desarrollo de A. thaliana, cambios en la estructura de la raíz y elucidar posibles mecanismos involucrados a través de líneas reporteras.
Materiales y métodos
Obtención de muestras
Se seleccionó un cultivo en producción de arándano, ubicado en San Rafael Coapa, Michoacán. Mediante un muestreo aleatorio se seleccionaron cinco plantas aparentemente sanas y vigorosas, de las cuales se obtuvieron muestras de raíces y suelo rizosférico que se mantuvieron en frío hasta su procesamiento.
Obtención y purificación de aislados fúngicos
De cada muestra de rizósfera se realizaron cinco diluciones con agua destilada estéril. En la dilución 1 × 10-5 se observaron las hifas con un microscopio estereoscópico (marca Labomed, modelo Luxeo 4D, Fremont, California, EUA) y se tomó cada una para resembrarse en cajas Petri con medio de cultivo agar dextrosa papa (PDA, por sus siglas en inglés, Bioxon). Las raíces se desinfectaron superficialmente sumergiéndolas en una dilución de cloro al 10 %, seguida de una solución antibiótica de eritromicina 2 % y gentamicina 1 % con enjuagues de agua destilada estéril (Ortega, 2008); se cortaron en segmentos transversales de 1 cm y se sembraron en medio de cultivo elaborado con 20 g de extracto malta (Sigma Aldrich), 1 g de peptona de caseína (BD, Bioxon), 20 g de agar nutritivo (BD, Bioxon) y 20 g de sacarosa comercial, obteniendo un total de tres réplicas por raíz que se mantuvieron en incubación a 25 ºC durante 30 días; posteriormente, se sembraron en agar agua 2 % durante 24-36 h y se observó su crecimiento al microscopio en cámara de flujo laminar para seleccionar una hifa solitaria y transferirla a PDA obteniendo cultivos axénicos por punta de hifa (French y Hebert, 1980).
Determinación molecular de aislados fúngicos
Los aislados fúngicos se sembraron en papa dextrosa Broth (PDB, por sus siglas en inglés, Sigma Aldrich) y se mantuvieron en agitación a 50 rpm a 25 ºC durante 15-30 días en un agitador en seco (Thermo Scientific, modelo MaxQ 4450, Waltham, Massachusetts, EUA). Las hifas desarrolladas se transfirieron a membranas de diálisis (0.2 µm) montadas en una bomba de extracción al vacío para obtener el micelio fúngico, siguiendo el protocolo de Beltrán-Nambo et al. (2018). Para la extracción de ADN se utilizaron aproximadamente 3 cm3 de micelio de cada aislado, el cual se molió en frío en un tubo de 2 mL con el protocolo establecido por Sambrook y Russel (2001) con modificaciones en el buffer de extracción (LiCl 0.4 M y SDS 1 %, EDTA 25 mM, Tris-HCl 200 mM). La amplificación se realizó mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) en un termociclador (Eppendorf, modelo AG 22331, Hamburgo, Alemania) utilizando los cebadores universales ITS 1F (5`-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3´) (Gardes y Bruns, 1993) e ITS 4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) (White et al., 1990), siguiendo el protocolo sugerido por Swarts et al. (2010), pero utilizando ADN polimerasa de la compañía Invitrogen (Platinum Green Hot Start PCR Master Mix 2x). Los productos se corrieron en gel de agarosa 1 % y se observaron bajo luz UV en un transiluminador (High Performance, modelo UVP 95-0429-02, Madrid, España). La secuenciación en ambas direcciones (5´-3´ y 3´-5´) se llevó a cabo por Macrogen (Seul, Korea). Las secuencias se editaron en el software Sequencher version 4.1.4 y la identificación de secuencias similares se llevó a cabo con la herramienta BLAST de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) considerando 99-100 % de similitud.
Respuesta de A. thaliana (Col 0) a compuestos liberados por los aislados fúngicos
De manera previa, se realizaron pruebas de germinación para asegurar la viabilidad de semillas de A. thaliana ecotipo silvestre Columbia (Col 0); se desinfectaron superficialmente con etanol 95 % (v/v) durante 5 min y una solución de hipoclorito de sodio 20 % por 7 min, se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se refrigeraron a 4 ºC durante 48 h. Con la finalidad de conocer si la respuesta de A. thaliana es provocada por compuestos involucrados en interacción directa (difusibles más volátiles) o indirecta (sólo volátiles), se prepararon dos configuraciones experimentales: 1) cajas no compartimentadas que contenían medio de cultivo Murashige y Skoog (MS, Phytotechlab), en las cuales se sembraron 10 semillas en un extremo y se inoculó cada cepa fúngica en el extremo contrario; 2) cajas Petri compartimentadas, las cuales contenían en un compartimento medio de cultivo MS donde se sembraron cinco semillas, y en el otro, medio de cultivo PDA donde se colocó cada cepa fúngica. La siembra de semillas e inoculación fúngica se realizaron de acuerdo con la tasa de crecimiento de cada hongo dando ventaja a la semilla para la germinación, o en su caso, al hongo para iniciar el conteo de 14 días de interacción con tres réplicas por tratamiento. Las cajas Petri se mantuvieron con una inclinación de 65º en una cámara de crecimiento (fotoperiodo 16 h luz/8 h oscuridad, humedad relativa 89 % y temperatura 22 ºC) durante 14 días, después de los cuales se midió el crecimiento de la raíz primaria y se contaron las raíces laterales. Se determinó la biomasa en peso fresco, por tratamiento, utilizando una balanza analítica (Radwag, modelo AS 220.R2, Miami, Florida, EUA). Se obtuvieron imágenes con una cámara digital (SONY modelo Carl Zeiss DSC-S75, Tokio, Japón). Los datos se analizaron con una prueba de ANDEVA y comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05) con el software SPSS Statistics (IBM) Versión 28.0.1 para establecer diferencias significativas entre los tratamientos.
Interacción de líneas reporteras de A. thaliana con cepas fúngicas seleccionadas
Se seleccionaron los hongos promotores de crecimiento vegetal y se analizó su efecto sobre las líneas reporteras ARR5::GUS (citocininas) y DR5::GUS (auxinas). Se prepararon dos configuraciones experimentales (cajas Petri compartimentadas y no compartimentadas) con el método descrito anteriormente. Se realizó un análisis histoquímico del gen reportero GUS, en el cual las plantas de A. thaliana se incubaron en X-Gluc [0.5 mg mL-1 5-bromo-4- cloro-3-indolil-β-D-glucuronido 0.1 % en tampón fosfato (NaH2PO4 y Na2HPO4, 0.1 M; pH 7), EDTA 10 mM 0,1 % (v/v) Triton X-100 con ferrocianuro de potasio 2 mM y ferricianuro de potasio 2 mM] durante 12 h y se clarearon utilizando el método de Malamy y Benfey (1997). Las plantas procesadas se fijaron en portaobjetos con glicerol 50 % (v/v). Para cada línea reportera, por cada tratamiento, se analizaron 15 plantas en un microscopio (Carl Zeiss, Modelo Axiostar plus, Göttingen, Alemania) y se tomaron fotografías representativas de los tejidos teñidos con una cámara digital (SONY modelo Carl Zeiss DSC-S75, Tokio, Japón).
Resultados
Identificación molecular de hongos asociados a arándano ( V. corymbosum)
Se obtuvieron seis cepas fúngicas (cinco de raíz y una de suelo rizosférico), de las cuales Phialocephala fortinii, Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Phialemonium obovatum y Botrytis cinerea pertenecen al Phylum Ascomycota, mientras que Mortierella alpina a la división Mucoromycota. Por su parte, F. oxysporum, A. alternata y B. cinerea son patógenos de plantas (Sánchez-Fernández et al., 2013), P. obovatum y M. alpina son hongos saprótrofos, y P. fortinii es un hongo endófito septado obscuro con alto potencial como formador de micorriza tipo ericoide. Los hongos identificados se registraron en GenBank y el número de acceso se muestra en el Cuadro 1.
Cuadro 1 Especies fúngicas asociadas a raíz y suelo rizosférico de arándano identificadas molecularmente y su número de acceso en GenBank.
| Especie | Zona de extracción | Número de acceso GenBank | Similitud (%) |
| Phialocephala fortinii | Raíz | OP895174 | 99.76 |
| Fusarium oxysporum | Raíz | OP932005 | 100.00 |
| Alternaria alternata | Raíz | OP932006 | 100.00 |
| Phialemonium obovatum | Raíz | OP932009 | 99.79 |
| Mortierella alpina | Suelo rizosférico | OP912989 | 99.89 |
| Botrytis cinerea | Raíz | OP932012 | 99.80 |
Respuesta de A. thaliana (Col 0) a compuestos liberados por aislados fúngicos
El tiempo de germinación de las semillas de A. thaliana fue de 3 días. Por su parte, en cajas no compartimentadas, la mayoría de los hongos afectaron negativamente el crecimiento de las plantas, con excepción los de P. fortinii que promovio el desarrollo, indicando un efecto benéfico de su interacción directa (Figura 1). Cabe aclarar que, en este caso, además de los compuestos difusibles, están los compuestos volátiles. En el caso de cajas compartimentadas, P. fortinii y M. alpina promovieron el desarrollo vegetal (Figura 2), mejorando las tres variables de crecimiento analizadas (Figura 3). La longitud de la raíz principal se promovió en ambas configuraciones de caja Petri por P. fortinii (5.1 y 4.6 cm respectivamente) con respecto al control (2.4 y 2.6 cm), así como mediante los volátiles (caja Petri compartimentada) de M. alpina (4.4 cm; Figura 3A). El número de raíces laterales se favoreció con estas dos cepas fúngicas en cajas compartimentadas; las plantas control tuvieron tres en promedio, mientras que en las plantas en interacción con los hongos esta variable aumentó a más de 50 (Figura 3B); además, la biomasa incrementó de 10 mg en los controles a más de 50 mg con los tratamientos fúngicos (Figura 3C).
Figura 1 Efecto de interacción de hongos aislados de arándano (V. corymbosum) sobre el desarrollo de plántulas de A. thaliana (Col 0) en caja Petri no compartimentada. A) control B) Phialocephala fortinii, C) Fusarium oxysporum, D) Alternaria alternata, E) Phialemonium obovatum, F) Mortierella alpina, G) Botrytis cinerea.
Figura 2 Efecto de interacción de hongos aislados de arándano (V. corymbosum) sobre el desarrollo de plántulas de A. thaliana (Col 0) en caja Petri compartimentada. A) control, B) Phialocephala fortinii, C) Fusarium oxysporum, D) Alternaria alternata, E) Phialemonium obovatum, F) Mortierella alpina, G) Botrytis cinerea.
Figura 3 Variables evaluadas en plántulas de A. thaliana en co-cultivo con hongos aislados de arándano (V. corymbosum) en dos configuraciones de caja Petri (compartimentada y no compartimentada). A) longitud de raíz principal, B) número de raíces laterales y C) biomasa en peso fresco. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (Tukey, P ≤ 0.05).
Expresión diferencial de las líneas reporteras DR5::GUS y ARR5::GUS
Se observaron respuestas significativas a la inoculación de P. fortinii y M. alpina. En el área foliar de A. thaliana, los compuestos volátiles incrementaron la expresión del gen DR5::GUS, pero no de ARR5::GUS, indicando una mayor presencia de auxinas. Por su parte, en la raíz primaria de cajas no compartimentadas (presencia de compuestos difusibles y volátiles), se incrementó la expresión de ambos genes reporteros; este comportamiento también se observó en cajas compartimentadas (compuestos volátiles) en la interacción A. thaliana-P.fortinii. Se detectó también la influencia de los volátiles sobre el ensanchamiento de la zona apical de la raíz primaria mediada por la actividad de auxinas, sugiriendo un desencadenamiento de mecanismos relacionados con la elongación y división celular (Figura 4). Mortierella alpina no incrementó la expresión de los genes reporteros analizados en el área foliar; en cambio, en la raíz hay un incremento en la expresión causada por citocininas únicamente por efecto de volátiles (cajas compartimentadas). En cajas no compartimentadas, la presencia de ambos tipos de compuestos (difusibles y volátiles) de este hongo inhiben la expresión del gen reportero de auxinas con respecto al control en la variable raíz primaria (Figura 5).
Figura 4 Efecto de P. fortinii aislado de raíz de arándano (V. corymbosum) sobre la expresión de los genes reguladores de citocininas y auxinas (ARR5::GUS y DR5::GUS) en el área foliar y radicular de A. thaliana.
Discusión
En este estudio se identificaron hongos reportados como patógenos (F. oxysporum, B. cinerea y A. alternata) que provocan pérdidas considerables a los agricultores (Moya-Elizondo et al., 2019; Ramos-Bell et al., 2022; Wang et al., 2021). Phialemonium obovatum es un hongo saprótrofo oportunista (Gams y McGinnis, 1983) y P. fortinii es un hongo endófito septado oscuro con capacidad de mejorar la absorción de nutrientes como el calcio, fierro, aluminio y fósforo (Surono y Narisawa, 2021); siendo este último un potencial promotor de desarrollo vegetal, lo cual es corroborado con este estudio al aumentar la expresión de genes de respuesta a auxinas y citocininas mediante compuestos difusibles y volátiles en A. thaliana. Mortierella alpina pertenece a un género con especies conocidas por ser hongos promotores de crecimiento vegetal que mejoran la absorción de elementos no biodisponibles para las plantas (Ozimek y Hanaka, 2021), lo cual coincide con los resultados reportados en este trabajo en que las plantas de A. thaliana aumentaron la expresión de genes de respuesta a auxinas y citocininas en su interacción con compuestos volátiles de M. alpina, aislada por primera vez en el año 2014 en Corea (Yadav et al., 2014) y de suelo rizosférico de manzano en el estado de Chihuahua, México, por Mares-Ponce de León et al. (2018), su estudio en la agricultura es aún limitado; sin embargo, su aislamiento en el presente estudio permitió elucidar algunos mecanismos involucrados en su actividad promotora de crecimiento. A pesar de que en este estudio no se determinaron los compuestos liberados por los hongos, algunos otros reportan que especies del género Mortierella sintetizan fitohormonas como ácido indolacético y ácido giberélico, colocándolos en un lugar importante como hongos con potencial de mejorar el crecimiento vegetal (Ozimek et al., 2018).
De acuerdo con los resultados encontrados, los volátiles aumentaron el número de raíces y área foliar, sugiriendo que la presencia de una barrera física permite que estos compuestos desencadenen respuestas relacionadas con la división y elongación celular, estimulando el crecimiento. Las respuestas encontradas en cajas compartimentadas en este estudio coinciden con los resultados de Coria-Arellano et al. (2023), quienes evaluaron el efecto de rizobacterias aisladas de Suaeda sp. sobre A. thaliana; los autores reportaron que Aneurinibacillus migulanus, Staphylococcus sp. y Bacillus cereus mejoraron el desarrollo vegetal. El presente estudio sugiere que los hongos evaluados sintetizan metabolitos secundarios que estimulan la divergencia de raíces, como lo observado por Contreras-Cornejo et al. (2009) al evaluar el efecto de Trichoderma virens sobre A. thaliana, donde se reporta que los efectos observados son el resultado de la presencia de compuestos fúngicos similares a las auxinas. Casarrubia et al. (2016) evaluaron la capacidad de Oidiodendron maius para influir en el crecimiento de A. thaliana utilizando las mismas configuraciones experimentales para investigar la influencia de las moléculas fúngicas solubles y volátiles en el fenotipo de la planta; los autores reportaron que O. maius promovió el crecimiento en ambas configuraciones; sin embargo, observaron un fenotipo peculiar caracterizado por el acortamiento de la raíz primaria y un aumento en la longitud y el número de raíces laterales sólo en las placas no compartimentadas, por lo que sugieren que ambos tipos de moleculas son las responsables.
Al no observar una promoción de crecimiento en cajas no compartimentadas dentro de los resultados del presente estudio, es posible que el contacto directo planta-hongo desencadene otros mecanismos donde se involucran compuestos reportados como inductores de defensa vegetal como el ácido jasmómico o ácido salicílico (Glazebrook, 2005; Pieterse et al., 2012).
Conclusiones
El presente estudio es un aporte importante acerca de la identidad de las especies fúngicas asociadas con Vaccinium corymbosum en el estado de Michoacán, México; sin embargo, son necesarios estudios más detallados que amplíen el panorama acerca de la diversidad fúngica asociada al arándano y que mejoren el entendimiento de las vías de señalización activadas por estos microorganismos. Phialocephala fortinii y Mortierella alpina promovieron el crecimiento de A. thaliana; esta estimulación correlacionó con algunos cambios en la expresión de genes de respuesta a las hormonas auxinas y citocininas, observándose de manera diferencial en hojas y raíz, lo que sugiere que el efecto en la promoción del crecimiento es mediado por el incremento de estas hormonas. Estos hongos representan un recurso biológico con potencial de uso como bioestimulantes en la agricultura actual.
