Establecimiento del experimento

La plantación se estableció en un terreno salino que fue parte del ELT, ubicado dentro del Colegio de Postgraduados, campus Montecillo, Texcoco, Estado de México, con elevación de 2237 m de altitud, temperatura media anual de 15.3 °C y precipitación media anual de 644 mm. En febrero de 2019, con la ayuda de un ahoyador de espiral montado sobre un tractor agrícola, se cavaron 60 cepas circulares (Figura 1b y 1e). Las dimensiones de estas fueron de 0.60 × 1 m de diámetro y profundidad, mientras que las cepas testigo comunes se realizaron con dimensiones de 0.4 × 0.4 m respectivamente y se asemejan a las tradicionalmente utilizadas en las reforestaciones (Figura 1c y 1d). La separación entre cepas tratamiento fue de 2.5 m y dispuestas en marco real.

Figura 1: Panorama del trabajo de campo. a) preparación del sustrato, b) perforación de cepas profundas con ahoyador, c) cepa profunda perforada, d) cepa testigo, e) cepas perforadas, f) plantas establecidas. 

Figure 1: Overview of the field work. a) substrate preparation, b) drilling holes with deep auger, c) view of a drilled hole, d) control treatment hole, e) drilled holes, f) planted trees. 

La plantación se realizó en julio del 2019 (Figura 1f) y se aplicaron riegos de auxilio cada cinco días para mantener el suelo a un contenido volumétrico de humedad aproximado de 60%, el cual se verificó con un equipo TDR 300 Fieldscout. Las especies arbóreas que se utilizaron fueron Pinus greggii Engelm. ex Parl. var. australis Donahue & Lopez, P. pseudostrobus Lindl. y P. ayacahuite Ehrenb. ex Schltdl. de dos años; P. leiophylla Schiede ex Schltdl. & Cham. y Psidium guajava L. de tres años. P. guajava se incluyó como especie de referencia por ser un árbol frutícola que tolera niveles más altos de salinidad (^{Qadir et al., 2008}). Las especies de pino se seleccionaron debido a que previamente se tenía la experiencia de haberlas establecido en áreas aledañas con menores valores de pH y CE. Mientras que, la edad de las especies varió debido a la disponibilidad de la planta en vivero. Se utilizaron 15 árboles de cada especie, de los cuales 10 se establecieron en cepas con sustrato alternativo (CSA) y cinco se plantaron directamente en el suelo salino sódico (SSS), en cepas testigos. Cada especie se distribuyó en una línea, las cuales se orientaron de tal forma que captaran la mayor variabilidad espacial del terreno, de acuerdo con mediciones preliminares de pH y CE (Figura 2).

Figura 2: Variabilidad espacial inicial de pH y CE en la parcela de estudio. Los contornos de cada variable se interpolaron con el método de la distancia inversa ponderada. Las imágenes se reprodujeron con la librería gstat del paquete R (^{R Core Team, 2020}). 

Figure 2: Initial spatial variability of pH and EC in the study plot. Contour of each variable were interpolated with the inverse distance weighted method. The images were reproduced with the gstat library of software R (^{R Core Team, 2020}). 

El sustrato alternativo con la que se llenaron las cepas tratamiento, consistió en una mezcla de suelo agrícola, tezontle y estiércol composteado de ovinos en una proporción 50-25-25 (Figura 1a), se utilizaron aproximadamente 336 kg de sustrato para rellenar las cepas y presentó un pH_1:5 de 8.7 y una CE_1:5 de 7.7 dS m^-1. El método del composteo consistió en un apilado en forma de bordo de 80 cm de altura y 15 m de largo, regado y volteando la pila cada 15 días. En las cepas testigo no se aplicó enmienda de suelo y se rellenaron con el mismo suelo salino excavado.

Muestreo de suelo y sustrato

Para describir las características edáficas iniciales del sitio se realizaron tres muestreos a cada 15 m en un transecto de 30 m. En cada muestreo se obtuvieron tres muestras de 0 - 0.10, 0.10 - 0.20 y 0.20 - 0.30 m de profundidad, en las que se analizó pH, CE, cationes y aniones en extracto de saturación (Cuadro 1) y en relación 1:5. Se determinó una alta presencia de Na⁺ _e y Cl^- _e en la parte central del terreno.

También se realizaron 22 muestreos de forma sistemática en marco real en el SSS donde se establecieron las cepas testigo y de las 50 CSA. En ambos casos las muestras fueron tomadas en los primeros 15 cm. Las muestras fueron secadas al aire en invernadero, se fragmentaron los agregados y se tamizaron a 2 mm. La medición del pH y CE se realizó con un medidor Hanna HI 255 utilizando una proporción suelo solución^-1 de 1:5. El pH se evaluó en tres tiempos: 100, 210 y 280 días. La CE se evaluó a los 100 y 280 días.

Medición de contenido de humedad relativa (CHR) en tejido vegetal y supervivencia

El CHR se registró a los 90 y 120 días adaptando la metodología propuesta por ^{Lugojan y Ciulca (2011)}. Se tomaron cuatro muestras de acículas vigorosas de 2.54 cm de largo para los pinos, considerando que estuvieran expuestas a la luz del sol. Para P. guajava se obtuvieron muestras circulares de 0.5 cm de diámetro de las hojas con una perforadora de oficina. Las muestras se colocaron en viales de plástico y se transportaron inmediatamente al laboratorio para minimizar las pérdidas de agua por evapotranspiración; se pesaron en una ultra micro balanza de alta precisión (Sartorius^® Mod. SE2) para obtener el peso fresco (Pf). Posteriormente en el mismo vial cada muestra se sumergió en agua destilada durante 72 h para después determinar el peso turgente (Pt). Después, las muestras se secaron en una estufa a 70 °C hasta alcanzar peso constante y se volvieron a pesar en la micro-balanza para obtener el peso seco (Ps). Finalmente, el CHR se calculó con la fórmula:

La supervivencia de las especies se monitoreó cada semana y se consideró planta muerta cuando más del 90% del follaje de los pinos presentó alguna lesión necrótica. En P. guajava debido a su característica de especie semi-caducifolia, se registraron como vivas aquellas que mantuvieran sus hojas o mostraran algún rebrote de hojas en el tallo.

Diseño y análisis estadístico del experimento

El diseño experimental se distribuyó como un arreglo en bloques al azar, definiendo como bloques las especies arbóreas y en cada bloque se tuvieron 10 repeticiones de CSA y cinco repeticiones por bloque en SSS, el árbol fue la unidad experimental resultando un total de 75 unidades.

Después de 280 días de observación, eventualmente todas las especies de pino murieron, aunque a diferente tasa y P. guajava sobrevivió en un 70%. Debido a esto el análisis estadístico se redujo a una comparación con pruebas de t y Mann-Whitney (dependiendo de la presencia de normalidad en los datos), cuando solo se comparó el SSS vs. CSA. Así también, dado que en todas las variables evaluadas los valores de SSS siempre fueron mayores respecto a CSA y mostraron una alta variabilidad, se realizaron comparaciones por Tukey y Dunn (dependiendo de la presencia de normalidad en los datos) solo entre los bloques de CSA y los valores de turgencia del tejido de follaje medido como contenido hídrico relativo (CHR).

Evaluación de las CSA respecto al SSS

En general, todas las variables mostraron valores significativamente menores (P< 0.05) en las CSA respecto al SSS (Cuadro 2). Llama la atención el alto contenido volumétrico de humedad del suelo SSS comparado con CSA (P < 0.05) lo que podría explicarse por la elevada concentración de sales (Cuadro 2). Los elevados valores de CE en el SSS ocasionaron una sobreestimación de los valores de humedad volumétrica registrados con el TDR (^{Inoue, Ahmed, Saito y Irshad, 2008}). Los pulsos generados por las varillas del TDR para la medición del CVH, están relacionados con las propiedades dieléctricas del suelo, debido a que los dipolos de las moléculas de agua ralentizan la propagación de la señal y al ser un instrumento de tipo reflectómetro de contenido de agua, presenta sensibilidad a la temperatura (^{Benor, Levy, Mishael y Nadler, 2013}) y a las características del suelo como: la textura, estructura y densidad del suelo (^{Tan, Wu, Huang, Wu y Zeng, 2017}). De esta forma, la sobreestimación del CVH en el SSS se debe también a las características mismas del sitio: su origen lacustre, presencia de arcillas con más del 30% y además de un hidromorfismo moderado (^{Luna-Guido et al., 2000}; ^{Segura-Castruita, Gutiérrez, Ortíz, y Gómez, 2000}).

Por otro lado, la materia orgánica contenida en CSA favoreció una menor resistencia mecánica (P < 0.05), (Cuadro 2). Además de disminuir la resistencia mecánica a la penetrabilidad, el uso de esta enmienda ayuda a mejorar la distribución de macro y microporos, retener mayor humedad (^{Zhang, Horn y Hallet, 2005}), favorecer la infiltración y mejorar la efectividad de los riegos promoviendo el lavado de sales. A pesar de que la aplicación constante de riegos ayuda a disminuir la salinidad del suelo en la parte superficial, estas sales tienden a acumularse en las capas más profundas y en el caso de dejar de aplicar los riegos, las sales volverían a acumularse en la superficie por procesos de evapotranspiración del suelo y ascenso por capilaridad (^{Zouari et al., 2019}) El pH fue significativamente menor (P < 0.05) en CSA (8.99 ± 0.17), manteniendo la condición de alcalinidad en ambos casos.

pH en CSA

Debido a que el promedio del pH y la CE de las CSA en todos los bloques fue menor al SSS (P < 0.05), se realizaron comparaciones de medias solo entre las CSA con diferentes especies. La variación promedio del pH (0.42) y la CE (4.28 dS m^-1) en el SSS fue alta en los 280 días. El Cuadro 3 muestra que a los 100 y 210 días el pH de las CSA tuvieron menor variación (de 9 a 9.3) y se mantuvo por debajo de los niveles del SSS. A los 280 días el pH en las CSA también fue menor respecto al promedio del SSS en ese mismo periodo y se encontró una mayor variación en los valores de las CSA como en SSS (Cuadro 3). El pH en las CSA mostró una disminución como consecuencia de la materia orgánica presente en el sustrato (^{Li-Ping et al., 2015}; ^{Segura-Castruita et al., 2000}), a través de su descomposición y producción de ácidos orgánicos debido a la actividad microbiana presente en la fracción lábil (^{Tarchouna, Merdy, Raynaud, Pfeifer y Lucas, 2010}). Sin embargo, los valores aún se encontraron dentro del rango fuertemente salino (^{Ditzler, Scheffe y Monger, 2017}).

Los mayores niveles de pH encontrados en las CSA en los primeros 210 días podrían estar explicados por el agua de lluvia que contaminó las cepas con las diferentes sales presentes en el SSS del lugar y que a su vez propicio su lixiviación. El lavado de sales realizado por las lluvias y los riegos semanales, probablemente ayudaron a disminuir su concentración en la solución suelo de la capa superficial, sin embargo, dio lugar a que parte del sodio intercambiable se hidrolizara formando hidróxido de sodio, o se formara carbonato de sodio, generando un aumento en el pH del sustrato así como la dispersión de partículas del suelo salino sódico (^{Richards, 1954}). A pesar de que las lluvias y los riegos ayudan en el lavado de sales, se ha encontrado que estas prácticas también tienden a aumentar el pH cuando hay transporte superficial de suelo (^{Yu et al., 2010}; ^{Yin et al., 2022}). Estos procesos crearon un ambiente desfavorable para la entrada de agua en la parte superficial de las cepas ya que los SSS en épocas de lluvias generaban material fino, producto de la dispersión de partículas del suelo, que eran arrastradas hacia las cepas, se cementaban y posteriormente impedían el proceso de lixiviación hasta que se realizaba una práctica de roturación de la parte superficial. Por otro lado, a los 280 días los niveles de pH en las CSA tuvieron mayor variación y menores niveles respecto a los primeros 210 días. Esto se debe a que las lluvias ya habían cesado, y con ello cesó el aporte de agua con sales hacia las cepas; además, los riegos de apoyo promovieron la lixiviación mitigando el efecto de las sales.

CE en CSA

La CE promedio en CSA (< 3.16 dS m^-1) fue menor (P < 0.05) que en SSS durante los 280 días. En los primeros 100 días, los riegos solo se mantuvieron en las CSA que tenían árboles vivos lo que permitió la lixiviación continua de sales, mientras que, en aquellas donde ya no había árboles el riego no fue aplicado y la salinidad aumentó. Esto se presentó en las CSA de los P. pseudostrobus (especie que sobrevivió por menos tiempo) las cuales tuvieron altos niveles de CE a los 100 días como consecuencia de ser regadas por menor tiempo debido a que ya no había árboles que regar (Cuadro 3). A partir de estos resultados los riegos programados se aplicaron en las CSA ya sea que tuvieran árboles o no con la finalidad de no incrementar la variabilidad estadística en los bloques de acuerdo con los resultados obtenidos de los análisis de suelos. La CE en las CSA a los 280 días fue menor que a los 100 días y con menor variabilidad, lo cual puede ser efecto de los riegos de apoyo que permitieron el lavado de sales. Estudios demuestran que la aplicación de riegos en suelos salino sódicos ayudan en el lavado de las sales aún utilizando aguas salobres, pero en mayor proporción (^{Yin et al., 2022}).

Durante los 280 días del experimento el SSS presentó alta variabilidad en la CE con niveles desde 1.6 hasta 17.22 dS m^-1. Esta variación espacial y temporal es consecuencia de la disminución de la humedad en el suelo y la alta evapotranspiración (^{de Vos et al., 2016}; ^{Tomar y Gupta, 1985}). En los suelos del ELT la evaporación potencial supera en aproximadamente tres veces los 550 mm de precipitación (^{Rojas-Oropeza et al., 2010}). Esta desproporción en el balance hídrico influye en la supervivencia y desarrollo de los árboles, y se suma a otros factores que impiden su establecimiento en condiciones de estrés salino. Algunos pueden ser: su establecimiento en áreas con escaza cobertura vegetal, con exposición a altas temperaturas, presencia de suelos alcalinos y por consecuencia el desequilibrio nutrimental de la planta (^{Torres-Rojo, 2021}). En sitios con características ambientales similares (2000 mm año^-1 de evapotranspiración, altas concentraciones de carbonatos y cloruros de sodio en el suelo), se ha encontrado que la concentración de sales puede variar de 0.78 - 10.02 dS m^-1, dificultando el desarrollo y supervivencia de árboles utilizados para rehabilitación (^{Oba et al., 2001}).

Los riegos de auxilio y la precipitación mitigaron en parte los efectos de las sales. Sin embargo, el exceso de arcillas, carbonatos y sodio provenientes del SSS que eran arrastrados por las lluvias, creaban una costra en la parte superficial e impedían la infiltración del agua a partes más profundas (^{Gupta et al., 2008}; ^{Kovda, Yaron, Shalhevet, Szaboles y Darab, 1973}), afectando así, las propiedades físicas y principalmente la conductividad hidráulica del suelo (^{Suarez, Wood y Lesch, 2006}). Esto provocaba una acumulación de sales en la zona radical que perjudicaba el desarrollo de las raíces de los árboles (^{Akeroyd, Tyerman, Walker y Jolly, 1998}; ^{Sánchez-Bernal et al., 2020}), por lo cual se tenían que realizar prácticas de laboreo en las CSA para romper la parte sellada y mejorar la estructura.

Contenido hídrico relativo

El CHR de las cinco especies estudiadas se determinó a los 60 días y a los 120 días. En esta última fecha sólo se evaluaron P. guajava, P. ayacahuite y P. leiophylla, ya que P. greggii y P. pseudostrobus no sobrevivieron (Cuadro 4). Al momento de ser evaluadas las diferentes especies de pino, el CHR de sus acículas se encontraba dentro de un límite promedio mínimo de hidratación (≤ 76%) (^{Fan, Blake y Blumwald, 1994}; ^{Wang et al., 2012}). Se ha encontrado que en distintas especies de pino sin estrés salino (Pinus bungeana Zucc. ex Endl. y P. banksiana Lamb) cuando su CHR es < 75% sus acículas comienzan a tener fuga de electrolitos, disminuye su contenido de clorofila, pierden turgencia y la planta comienza a realizar un ajuste osmótico que le permite tolerar la deshidratación y ajustarse a condiciones de estrés por sequía (^{Fan et al., 1994}; ^{Wang et al., 2012}).

En P. guajava el CHR que presentó a los 60 días fue el más elevado de todas las especies (Cuadro 4) mientras que a los 120 días disminuyó un 18.6% respecto al inicio. El alto CHR registrado a los 60 días puede deberse tanto a las condiciones ambientales dada a la alta disponibilidad de agua por los riegos y las lluvias, como por un ajuste interno para hacer frente a la presencia de sales. Se ha encontrado que el contenido hídrico en hojas de P. guajava y Tamarindus indica L. tiende a incrementarse como una respuesta al aumento de NaCl en sus hojas hojas (^{Gebauer, El-Sidding, Salih y Ebert, 2004}; ^{Rai, Jaiswal y Jaiswal, 2010}). Así como, contribuir en la disminución del potencial osmótico de las hojas, permitiéndole a la planta mantener la turgencia celular mediante la continua absorción de agua (^{Mbarki et al., 2018}).

Por otro lado, la disminución del CHR a los 120 días responde a los factores de estrés que estuvieron presentes durante ese tiempo (disminución de la temperatura, de la precipitación y presencia de granizadas). En algunas especies caducifolias se ha encontrado que después de aplicar un estrés hídrico en plantas el CHR tiende a disminuir: Cordia dodecandra A.DC. pasa de 71.6 a 26.1%; Piscidia piscipula (L. Sarg.) de 68.74 a 19.44%; y, Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit de 56.9 a 11.9% (^{Luna-Flores, Estrada, Jiménez y Pinzón, 2012}). Así también, en especies como Schinus terebinthifolius Raddi, Ehretia latifolia Loisel. y Fraxinus uhdei (Wenz.) Lingelsh. el CHR varía con las condiciones ambientales presentando CHR < 70% cuando las temperaturas son altas (26 °C) y las precipitaciones bajas (1.5 mm), mientras que cuando las condiciones ambientales son contrarias el CHR > 85% (^{Pimienta-Barrios, Robles y Martíez, 2012}). En otros estudios donde se han incrementado las concentraciones salinas de 4 a 12 dS m^-1 en plántulas de Melia dubia Cav., el CHR disminuyó, así como el contenido de clorofila, la tasa de fotosíntesis, la concentración interna de CO₂ y la transpiración, indicando que el estrés salino induce cambios en los procesos fisiológicos de la planta (^{Kumar, Banyal, Singh, Yadav y Sharma, 2021})

Supervivencia

Después de 280 días de establecer la plantación, de todos los pinos, solo un árbol de P. pseudostrobus en SSS sobrevivió. Resultados similares fueron encontrados al establecer Pinus halepensis en suelos salinos con pH de 8.4, en donde el 100% de las plantas murieron debido a que no toleraron las condiciones de alcalinidad moderada (^{Zouari et al., 2019}). A pesar de que el genero Pinus es poco tolerante a condiciones de alcalinidad, se ha encontrado que existen especies de este género que pueden sobrevivir en condiciones de baja alcalinidad, por ejemplo, P. pseudostrobus (^{Sigala-Rodríguez, González y Jiménez, 2015}) y P. greggii Engelmann ex Parlatore var. australis (^{Reyes-Esteves, López, Velasco y Jiménez, 2022})

Los pinos que toleraron por más tiempo la salinidad fueron P. leiophylla y P. ayacahuite, el inicio de su mortandad en cepas con sustrato se registró a los 112 y 126 días, mientras que en condiciones directas de SSS, la supervivencia de P. leiophylla se prolongó por más tiempo (133 días) que P. ayacahuite (35 días) (Figura 3). Se ha encontrado que en condiciones de invernadero P. leiophylla llega a tolerar concentraciones de hasta 150 mM de NaCl reduciendo significativamente su biomasa radical y, a su vez, desarrolla nuevos rebrotes en la parte baja del tallo (^{Jimenez-Casas y Zwiazek, 2013}), lo cual fue observado en la parte baja y media de las plantas. Niveles similares de tolerancia se han encontrado en Pinus silvestris L. que llega a tolerar hasta 117.5 mM de NaCl (^{Rzepka-Plevneš, Kulpa y Charkot, 2006}).

Figura 3: Supervivencia de las especies en CSA y en SSS. 

Figure 3: Species survival in CSA and SSS. 

El inicio de muerte de planta para P. greggii y de P. pseudostrobus en CSA y SSS ocurrió en el día 35 del experimento. La supervivencia en P. greggii fue de 0% mientras que en P. pseudostrobus fue de 6% (solo una de 15). La súbita y baja supervivencia de estas especies reflejó su sensibilidad a partir de pH > 9. Esta condición de alcalinidad permanente en la solución suelo de la zona radical, generó el amarillamiento de las acículas debido a la baja disponibilidad de Fe para las plantas (^{López-López y Estañol-Botello, 2007}). En todos los pinos estuvo presente esta condición, sin embargo, en P. pseudostrobus y P. greggii se presentó de forma más acentuada y continuó con la necrosis de la punta de las acículas hasta llegar a la parte del tallo. El comportamiento de P. pseudostrobus en el gradiente salino más bajo (pH = 8.45 y CE = 2.22 dS m^-1) puede indicar una máxima tolerancia a tales condiciones a través de la reasignación de nutrientes a partes esenciales de la panta para su supervivencia (^{Landis, 2005}). Así también, se ha encontrado que esta especie ha logrado establecerse en pH = 7.8, CE = 0.121 dS m^-1 y tener una supervivencia de 52.9% (^{Sigala-Rodríguez et al, 2015}).

Hasta los 280 días P. guajava tuvo 70% de supervivencia, la mayor de todas las especies evaluadas (Figura 3). Resultados similares se han encontrado en reforestaciones de Kenia con suelos salino-sódicos (pH = 7.5 - 8.4, CE = 0.78- 10.02 dS m^-1, y altas concentraciones de NaCl, Ca y carbonatos), donde la supervivencia de Acacia nilotica (L.) Delile fue de 78.1%, Cordia sinensis Lam. 60.3%, Dobera glabra (Forssk.) Juss. ex Poir. 66.6% y Salvadora persica L. 75.8% (^{Oba et al., 2001}). Mientras que en suelos similares pero en India las especies que presentaron los mayores porcentajes de supervivencia fueron Acacia auriculiformis A. Cunn. ex Benth. con 63%, A. nilotica 71%, Casuarina equisetifolia L. 69% y Tamarix articulata Vahl. 81% (^{Tomar y Gupta, 1985}).

La supervivencia de P. guajava puede deberse a la capacidad de desarrollar una tolerancia osmótica que le permite absorber iones del medio y acumular solutos orgánicos en sus tejidos (^{Läuchli y Grattan, 2012}). En P. guajava y T. indica se ha reportado que después de ser tratadas con soluciones de NaCl, todos sus tejidos tienden a acumular Na⁺ y Cl^- (^{Gebauer et al., 2004}; ^{Rai et al., 2010}) y sus niveles de prolina aumentan desarrollando un ajuste osmótico que les permite tolerar la salinidad (^{Woodward y Bennett, 2005}; ^{Rai et al., 2010}).

Otro factor que pudo haber ayudado en la supervivencia de P. guajava, P. leiophylla y P. ayacahuite por más tiempo fue la presencia de la materia orgánica presente en el estiércol de bovino aplicado en el sustrato. Esto generó condiciones favorables al inicio para que las raíces se establecieran, y aunque con el tiempo el sustrato adquirió características similares a su medio circundante, la materia orgánica ayudó a disminuir la acumulación de Na⁺ en las raíces, permitiendo tolerar por más tiempo la condición de estrés en las raíces. ^{Li-Ping et al. (2015)} encontraron que enmiendas con estiércol aplicadas en suelos salinos disminuyeron la acumulación de sodio en las raíces de Salicornia europea L. e incrementaron el contenido de K⁺ tanto en las raíces como en el tallo.