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Introducción
El cultivo de maíz es de indudable importancia en México y en el mundo (González et al., 2016; Jiménez-Nevárez et al., 2018). Este cultivo de maíz es un alimento básico para millones de habitantes (Vera et al., 2019). Esta planta cuenta con excelentes características de valor nutritivo, su consumo se da de muy diversas formas en la alimentación de humanos y ganado (Zaragoza et al., 2019). Una forma de alimentación para ganado explorada recientemente es en forma de brotes o germinados (Mattioli et al., 2019). Se ha explorado que la calidad de brotes puede ser mejorada por la incorporación de nutrimentos durante su crecimiento. Estos elementos intervienen en el incremento de metabolitos secundarios como el contenido de fenólicos y la actividad antioxidante (Kestwal et al., 2011). Dentro de estos elementos está el azufre. La función del azufre en la nutrición es muy importante en el metabolismo primario y además participa en la síntesis de metabólitos secundarios (Sutar et al., 2017). La importancia de este elemento radica en que es precursor de la síntesis proteica y una deficiencia de éste reduce el rendimiento y calidad de los cultivos (Alfaro et al., 2006).
El lixiviado de vermicompost es considerado un abono líquido que contiene gran cantidad de nutrientes generados por la transformación de la materia orgánica (Zamora et al., 2017). Esta alternativa de fertilización además de que no afecta el rendimiento y calidad del cultivo, aporta los nutrimentos necesarios para el desarrollo del mismo (Preciado et al., 2011). La combinación de lixiviado y azufre ayudan al desarrollo de metabolitos secundarios como compuestos fenólicos y flavonoides, estos elementos contribuyen a que la planta resista al ataque de patógenos e insectos (Nawaz et al., 2018). Una de las características de los compuestos fenólicos es la de actuar como antioxidantes, ya que pueden eliminar radicales libres (Peñarrieta et al., 2014). La extracción de los compuestos fenólicos y flavonoides requieren de un proceso prolongado, causando en muchas ocasiones degradación y pérdida de la actividad antioxidante, por ello una alternativa es el empleo de la extracción asistida por ultrasonido (UAE) permitiendo una extracción en un corto periodo de tiempo y un mayor rendimiento en la extracción sólido-líquido; además de ser económica, simple y confiable (Annegowda et al., 2012). Por ello el objetivo del presente estudio fue cuantificar la concentración de compuestos bioactivos determinantes en la capacidad antioxidante de brotes de maíz utilizando lixiviado de vermicompost y azufre como fertilización.
Materiales y Métodos
Localización del experimento
El estudio se realizó en la Universidad Politécnica de Gómez Palacio, Durango, ubicada en carretera la Torreña km 0.820 (25° 38’ 19.83” N -103° 31’ 52.12” O) dentro del laboratorio de genética de la carrera de Ingeniería en Biotecnología.
Germinación de la semilla
La pre germinación se realizó en agua potable a temperatura ambiente durante 24 h. Se utilizó semilla de maíz (Zea mays L.) cv. Euros, de la empresa UNISEM. Este cultivar es un híbrido de ciclo vegetativo intermedio con un porcentaje de germinación del 90%. La semilla fue previamente lavada con hipoclorito de sodio a una concentración de 1 mL L-1. Posteriormente las semillas se escurrieron y se colocaron en charolas de poli estireno con medidas de 15 × 10 × 5 cm, con perforaciones en la parte superior para permitir la aireación. Las charolas se colocaron por espacio de tiempo de 6 h en oscuridad. Transcurrido ese tiempo se inició la etapa de crecimiento, durante la cual se aplicaron los tratamientos y tuvo una duración de 15 días. Durante el crecimiento de los brotes se realizaron riegos cada 3 h con agua, por medio de aspersión con una cantidad de 5 mL por aplicación. Los tratamientos se aplicaron en la etapa de crecimiento empleando la misma dosis de riego.
Tratamientos
Los tratamientos de fertilización utilizados fueron agua como control (A); Lixiviado (LX) agregando 10 mL de lixiviado por litro de agua; mezcla de lixiviado con azufre (LXS) agregando 10 mL de lixiviado y 3 mL de azufre por litro de agua y azufre (S) añadiendo 3 mL de azufre por litro de agua de acuerdo a las indicaciones de la etiqueta del producto (AZPERZUL®). Para determinar la dosis de compuestos en cada tratamiento se tomó en cuenta la composición química del agua de riego y del lixiviado (Cuadros 1 y 2). Las variables evaluadas fueron: contenido de fenoles totales (FNL), flavonoides totales (FLV) y capacidad antioxidante total (AOX).
Preparación de extractos
Para cuantificar las variables FNL, FLV y AOX los brotes fueron deshidratados a temperatura ambiente (30 ± 2 °C) extendiendo en papel secante a la sombra durante 15 días. La muestra seca se pulverizó en licuadora (Hamilton beach® 58160-mx), y almacenó en tubos de ensaye de 15 mL para su posterior extracción. Después se prepararon extractos mezclando 1 g de muestra seca en 10 ml de metanol, posteriormente se realizó extracción de compuestos por medio de ultrasonificación (Ultrasonics®) sometiendo las muestras a ondas de sonido con intensidad de onda de 20 KHz por 2 min. Seguido de este procedimiento el sobrenadante fue retirado de los tubos y fue almacenado en tubos Eppendorf a -20 °C hasta ser analizados.
Cuantificación de FNL
Para la cuantificación del contenido de fenoles totales se utilizó el método de Folin-Ciocalteu utilizado por Ramírez et al. (2019) tomando 50 μL de extracto, se mezcló con 3 mL de agua destilada seguido de 250 μL de reactivo de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich®, St. Louis MO, EE.UU.), la mezcla se agitó en vórtex durante 10 s. Se añadieron 750 μL de carbonato de sodio (20% p/v) a los tres min posteriores de reacción y se agitaron durante 10 s, enseguida se agregaron 950 μL de agua destilada, se agitó nuevamente y se dejaron reposar las muestras durante dos horas en oscuridad para la reacción química correspondiente. Pasado este tiempo las muestras se leyeron a 765 nm en un espectrofotómetro Genesys® (USA) 10 UV. La curva de calibración fue realizada en base a ácido gálico como estándar (0 - 1000 mg L-1) y los resultados se presentaron en mg de ácido gálico equivalente por g de muestra en peso seco (mg AGE g-1 PS).
Cuantificación de FLV
La determinación del contenido total de flavonoides se llevó a cabo bajo la técnica utilizada por Baba y Malik (2015) 50 μL de extracto se aforaron hasta 1 mL con metanol, se mezclaron con 4 ml de agua destilada y 0.3 mL de solución de NaNO2 al 5%; después se añadieron 0.3 mL de solución de AlCl3 al 10% incubando durante 5 min. Posteriormente, 2 mL de solución de NaOH al 1 M fueron añadidos y el volumen final de la mezcla fue aforado a 10 ml con agua doblemente destilada. La mezcla se dejó reposar durante 15 min para posteriormente medir la absorbancia a 510 nm. El contenido total de flavonoides fue calculado a partir de una curva de calibración, y el resultado fue expresado como mg de quercetina equivalente por g de muestra en peso seco (mg QE g-1 PS).
Cuantificación de AOX
El análisis de capacidad antioxidante se realizó según lo indicado por Domínguez y Ordoñez (2014) utilizando como radical 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS+ Sigma-Aldrich®, USA.). El ensayo se realizó con 10 μL de muestra y 990 μL del radical ajustado. Pasados 30 min de reacción se lee la absorbancia (734 nm) por espectrofotometría. La curva de calibración se realizó usando Trolox (6-hydroxy-2, 5, 7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) como agente antioxidante, y el resultado fue expresado como micromoles equivalentes en Trolox por gramo de muestra en peso seco (µmol TE g-1 PS).
Para las variables contenido de fenoles totales, flavonoides totales y capacidad antioxidante total, se realizó análisis de varianza (SAS Instituto, 2004) y comparación de medias mediante DMS (P ≤ 0.05) en los casos en los que se encontró diferencia estadística significativa.
Resultados y Discusión
Contenido de fenoles totales (FNL). El contenido de compuestos presentó diferencia significativa en los tratamientos (P ≤ 0.05). El mejor tratamiento fue la combinación de lixiviado con azufre con un valor superior al 70% con respecto al control (Figura 1). De acuerdo a estudios realizados anteriormente por Najafian y Zahedifar (2015), las fertilizaciones utilizadas para los tratamientos de este estudio contribuyeron al aumento de compuestos antioxidantes ya que el uso de macronutrientes como el azufre (S) aumentan la concentración de distintos compuestos ya que trabajan en sinergia con estos para combatir a las reacciones con O2 que generan oxidación. Zhou et al. (2013) observaron un aumento en el contenido fenólico en los brotes de rábano tratados con azufre en comparación con el control coincidiendo con los valores obtenidos en este estudio. Estos resultados son similares a los hallazgos que indican que la aplicación de azufre es un método efectivo para mejorar el contenido fenólico en brotes de crucíferas (Kestwal et al., 2011). Con respecto al potencial del uso de lixiviado como fertilización orgánica para la concentración de compuestos bioactivos, Preciado et al. (2015) encontraron que la aplicación de este aumenta en un 29.3% el contenido de fenoles totales en comparación a la solución inorgánica aplicada en frutos de melón. De acuerdo con los autores, ello puede atribuirse al bajo contenido nutricional de la misma. También la aplicación de lixiviado de vermicompost incremento el contenido fenólico y la capacidad antioxidante de los frutos de tomate en el estudio realizado por López et al. (2016) en el cual los valores encontrados fueron mayores en comparación a los diferentes tratamientos utilizados.
Flavonoides (FLV). En cuanto al contenido total de flavonoides presentes en los brotes de maíz se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos (P ≤ 0.05). Los tratamientos en los cuales se utilizó lixiviado y azufre por separado como fertilizante para el crecimiento de los brotes mostraron resultados similares entre sí. Sin embargo, cuando ambos fertilizantes fueron combinados en el tratamiento la concentración de flavonoides aumentó un 64% en comparación con el tratamiento control (Figura 2). De acuerdo a lo obtenido por Sytar et al. (2018), en el análisis de flavonoides de brotes de trigo con valores entre 0.4-0.8 mg g-1 son inferiores hasta en un 50% de concentración. No obstante, los brotes de trigo no fueron tratados con ningún tipo de fertilización. A diferencia de los resultados obtenidos en el estudio con hojas de pimienta, donde los valores del contenido de flavonoides fueron superiores en más del 45% cuando el fertilizante utilizado fue lixiviado con vermicompost en comparación al tratamiento fertilizado con roca de sulfuro (Luján et al., 2017). Además, como se mencionó anteriormente el uso de azufre en combinación con lixiviado mostro ser el mejor tratamiento, probablemente se atribuya a la disponibilidad inmediata, la composición de ácidos húmicos y otras sustancias biológicamente activas, las cuales regulan el crecimiento vegetal favoreciendo así al crecimiento y el metabolismo secundario de las plantas (Preciado et al., 2014).
Capacidad antioxidante total (AOX). Los valores promedio obtenidos para el tratamiento lixiviado-azufre, azufre y lixiviado superan al control en un 61, 28 y 22% respectivamente en la concentración de compuestos antioxidantes totales (Figura 3). Resultados similares con respecto a AOX han sido reportados por Xiang et al. (2017) para brotes de maíz dulce germinados bajo condiciones de luz y oscuridad con valores entre 40 956-5518 μmol TE 100 g-1 en peso seco. Los autores mencionan que la concentración de compuestos antioxidantes aumenta con los días de germinación. Esos resultados también coinciden con Aremu et al. (2015) y Singh et al. (2014) quienes reportan que los efectos estimulantes presentes en lixiviado a menudo se han atribuido a la presencia de elementos minerales, ácido húmico y compuestos similares los cuales influyen en el crecimiento de las plantas al aumentar la absorción de aniones y cationes, la síntesis de proteínas y la acción de las enzimas del metabolismo de los nitratos, así como al mejorar la absorción de macro y micro nutrientes.
En un estudio realizado anteriormente con brotes de brócoli, col y rábanos se demostró que la fertilización con S incrementa la actividad antioxidante en relación al incremento de la dosis, obteniendo valores más altos cuando la cantidad de azufre es mayor (Kestwal et al., 2011), Estos últimos resultados coinciden con lo establecido por Burguieres et al. (2007) donde la calidad promotora de la salud de los brotes se puede mejorar al complementar los medios de crecimiento con varios nutrientes durante la germinación incrementando el contenido fenólico total y la actividad antioxidante.
Conclusiones
El contenido fenólico total, el contenido total de flavonoides y la capacidad antioxidante aumentaron con el uso de la combinación de lixiviado-azufre durante el crecimiento de los brotes de los germinados de maíz alcanzando los niveles más altos de compuestos activos. Los germinados de maíz suplementados con azufre en conjunto con el lixiviado de vermicompost son modelos adecuados para la biofortificación debido a que tienen alta capacidad de absorción, transporte y biotransformación para obtener fitoquímicos que incrementan el valor nutracéutico; por ello, podría promoverse como un método potencial para mejorar las propiedades funcionales de los brotes.
