Materiales y métodos

Sitios de colecta. Se colectaron en diferentes huertos de Michoacán frutos de aguacate con síntomas de aspecto corchoso que en campo son conocidos comúnmente como “roña típica” y “mancha púrpura” (Figura 1). Después de la colecta, los frutos se colocaron en bolsas de papel estraza (26 x 12.5 x 6.5 cm) para evitar la humedad y el desarrollo de hongos saprofitos.

Figura 1 Frutos de aguacate con síntomas conocidos en campo como roña típica (A) y mancha púrpura (B). 

Para la colecta de los frutos de aguacate, las áreas agroecológicas se dividieron de acuerdo con la altitud (metros sobre el nivel del mar; m.s.n.m.) que, según ^{Anguiano et al. (2007)} destacan tres tipos de climas para el desarrollo favorable de este cultivo y expresar su máximo potencial productivo: húmedo (entre 1,600 y 1,800 m.s.n.m.), semicálido subhúmedo (entre 1,200 y 1,600 m.s.n.m.) y templado subhúmedo (entre 1,900 y 2,300 m.s.n.m.) (Cuadro 1).

Aislamiento de los hongos. Los frutos de aguacate colectados en campo se lavaron con agua corriente y posteriormente se enjuagaron en agua destilada para eliminar contaminantes. Se tomaron lesiones frescas del epicarpio del fruto en fragmentos de 5 × 5 mm. Para la desinfección de los frutos, se utilizó la metodología propuesta por ^{Zhi Li et al. (2008)}, con algunas modificaciones. Los fragmentos del epicarpio de los frutos de aguacate se colocaron en hipoclorito de sodio al 6% durante 90 s, seguido de un enjuague con agua destilada estéril. Posteriormente, se realizó un segundo lavado con etanol al 70% durante 60 s y un último enjuague con agua destilada estéril. El tejido se colocó en toallas de papel esterilizadas para absorber la humedad. Una vez que los fragmentos del material vegetal se desinfectaron, se realizó la siembra en cajas Petri con medio de cultivo PDA, de manera equidistante, las cajas se sellaron con parafilm, se incubaron a 28 °C, con 80% de humedad, durante 72 h. Después de este tiempo, las cajas Petri se revisaron para observar el crecimiento de los hongos.

Identificación morfológica. Para la identificación de los aislamientos de los hongos se utilizaron las claves de ^{Barnett y Hunter (2006}). Para identificar a E. perseae se tomó como referencia la cepa ATCC 11190 de esta especie, la cual se encuentra depositada en el cepario de Miami, Florida, EUA y que fue facilitada por el Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C. (CIATEJ), Zapopan, Jalisco, México.

Identificación molecular. Los aislamientos purificados del hongo se trasladaron al CIATEJ para la extracción de ADN mediante la ruptura de la pared y membrana celular. La solución amortiguadora fue CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) para favorecer la lisis celular. Se utilizó cloroformo-alcohol isoamílico (en proporción 24:1) como disolvente orgánico y se centrifugó a 5,000 rpm durante 10 min para favorecer la desnaturalización y separación de proteínas. Se procedió con la precipitación del ADN y se verificó su calidad mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1.0 %.

La concentración del ADN genómico se cuantificó con un Nanodrop y se ajustó a 20 ng mL^-1. La amplificación del ADN se realizó mediante PCR, usando los iniciadores ITS-5/ITS-4, ITS1/ITS4, EF-1α F/ EF-1α R y Sph1F/Sph1R. Las amplificaciones de los productos de la PCR se verificaron por electroforesis con 5μL de muestra en un gel de agarosa al 1.5 %. La purificación de los productos de PCR se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante (Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega^®). Los fragmentos amplificados se enviaron al laboratorio de Macrogen (Seúl, Corea del Sur) para su secuenciación.

Las secuencias bidireccionales se alinearon con los programas Geneious prime v. 2021.0.3 (^{Kearse et al., 2012}) y MAFFT v.7.475 (^{Katoh y Standley, 2013}), se corroboraron en BioEdit (^{Hall, 1999}) con la finalidad de obtener una secuencia consenso y la secuencia obtenida se ensambló y comparó con las disponibles en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), usando la herramienta BLAST para secuencias altamente similares.

Para la identificación con BLASTn se consideró el porcentaje de cobertura y similitud, se consideraron valores ≥80% de cobertura y un rango de 97 a 100 % de similitud de la secuencia. Es decir, hasta 3% de divergencia de la secuencia para asignar una especie (^{Raja y Oberlies, 2017}).

Análisis filogenético. Se realizó un análisis filogenético multilocus para los aislamientos identificados como E. perseae, utilizando las secuencias obtenidas con los iniciadores ITS5/ITS4 o ITS1/ITS4, SPh1 F/SPh1 R (LSU) y EF-1α F/ EF-1α R. Para este análisis se utilizaron secuencias de especies del género Elsinoe ya depositadas en la base de datos del GenBank^®. En el caso de los aislamientos obtenidos de “roña típica” se realizó un análisis basado en la secuenciación de los iniciadores ITS4/ITS5.

Una vez obtenidas las secuencias consenso, éstas se compilaron en formato FASTA. Después, las secuencias se alinearon con el programa MAFFT v.7.475 (^{Katoh y Standley, 2013}). Las secuencias de los genes LSU, EF-1α e ITS obtenidas de las cepas identificadas como E. perseae se concatenaron en el programa MESQUITE v.3.6 (^{Maddison y Maddison, 2016}). El análisis filogenético se basó en el algoritmo de inferencia bayesiana (BI) y previamente se determinó el modelo evolutivo en el programa JModeltest 2.1.7 (^{Nylander, 2004}).

Para el análisis filogenético de las cepas identificadas como Colletotrichum gloeosporioides se utilizó la secuencia obtenida con los iniciadores ITS5/ITS4, así como secuencias de especies homólogas y otras pertenecientes al mismo género obtenidas del GenBank. Para la ubicación de los aislamientos se utilizó el programa MrBayes 3.2.7 (^{Ronquist et al., 2012}) con un modelo evolutivo Jukes Cantor (JC) obtenido en el programa JModeltest 2.1.7 (^{Nylander, 2004}). Se consideraron 10,000 generaciones y se tomaron muestras de árboles cada 1,000 repeticiones. Se ejecutó bajo el modelo Markov Monte Carlo (MCMC) y el análisis se detuvo una vez que se obtuvo un promedio y la desviación estándar (se) de partición de frecuencias entre cadenas, menor a 0.01 (se = 0.0099). Se obtuvieron 22 árboles filogenéticos de los cuales se muestrearon 18, se descartó el 25 % de los árboles. El resto de los árboles filogenéticos se combinaron para calcular la probabilidad posterior y obtener un árbol consenso (^{Holder y Lewis, 2003}). Se utilizó como grupo externo a la especie C. boninense, cepa 126, perteneciente a otro complejo del mismo género.

Para la especie E. perseae se realizó un análisis filogenético multilocus para aportar mayor confiabilidad y soporte a la identificación de los aislados de este hongo. Se consideraron las secuencias obtenidas en esta investigación, las secuencias homólogas y de otras especies del mismo género que ocasionan daños similares en otras especies de plantas. Como grupo externo se utilizó al hongo Myriangium hispanicum que pertenece a la familia Myringiaceae. Las secuencias se obtuvieron de la base de datos del GenBank, según ^{Fan et al. (2017}). Una vez obtenidas las secuencias, se creó un archivo en formato FASTA. Las secuencias se alinearon con el programa MAFFT v.7.475 (^{Katoh y Standley, 2013}) para cada gen. La concatenación de los genes se realizó con el programa Geneious prime v. 2021.0.3 (^{Kearse et al., 2012}) y MESQUITE v.3.6 (^{Maddison y Maddison, 2016}). El modelo evolutivo se obtuvo con el software JModeltest 2.1.7 (^{Nylander, 2004}). El análisis filogenético se realizó mediante el algoritmo de IB con el programa MrBayes v. 3.2.7 (^{Ronquist et al., 2012}). Se consideraron 575,000 generaciones y se tomaron muestras de árboles cada 1,000 repeticiones. Se ejecutó bajo el modelo MCMC y el análisis se detuvo una vez que se obtuvo un promedio y desviación estándar de partición de frecuencias entre cadenas menor a 0.01 (de = 0.0097). Se obtuvieron 1,152 árboles filogenéticos de los cuales se muestrearon 864, se descartó el 25 % de los árboles muestreados. El resto de los árboles se combinaron para calcular la probabilidad posterior y obtener un árbol consenso (^{Holder y Lewis, 2003}).

Pruebas de patogenicidad. Para evaluar la patogenicidad, se utilizaron 25 plantas de aguacate (criollo, Hass, Flor de María, Méndez) de vivero de aproximadamente 18 meses de haber sido injertadas. Los frutos de aguacate se inocularon cuando tenían un tamaño de 6-9 cm de largo por 4-6 cm de ancho (etapa de llenado de fruto). Los aislamientos seleccionados para las pruebas de patogenicidad fueron las que tuvieron un porcentaje mayor de crecimiento de cada síntoma muestreado. Se inocularon hojas, ramas y frutos de cada planta de cada variedad.

Se realizaron dos tipos de inoculación: directa e indirecta. La primera consistió en realizar heridas en el epicarpio del fruto y en los tallos jóvenes con un alfiler entomológico del número 0. Posteriormente, se colocaron discos (≈ 1 cm de diámetro) de micelio de los hongos aislados sobre la herida, y se cubrió con algodón húmedo con agua destilada estéril y plástico “kleen pack”. En el método indirecto se realizaron pequeñas heridas a los frutos y a las ramas jóvenes, después se asperjó una suspensión con conidios, esporas y fragmentos de micelio a una concentración de 1 x 10⁶ propágulos mL^-1 que se preparó según Gilchrist Saavedra et al. (2005). Finalmente, las plantas se cubrieron con una bolsa de plástico a manera de cámara húmeda durante tres días. En las diferentes variedades se evaluó la incidencia del síntoma.

Los frutos inoculados se observaron cada semana, durante tres meses para detectar la presencia de los síntomas. Después se realizaron reaislamientos de los hongos para corroborar la identidad del patógeno.

Resultados y discusión

Identificación morfológica. De la siembra del tejido vegetal con síntoma de “roña típica” se obtuvieron 16 aislamientos diferentes, ocho se identificaron como posibles hongos fitopatógenos, los cuales corresponden a los géneros Colletotrichum, Pestalotiopsis, Fusarium, Curvularia, Alternaria, Leptosphaerulina, Cladosporium y Epicoccum. De éstos, el género Colletotrichum fue el más frecuente observándose su crecimiento en el 90% de las cajas, seguido de Pestalotiopsis en 40% de estas y el resto de los hongos no superó el 3%. Estos datos concuerdan con los trabajos de ^{Djeugap et al. (2015}), ^{Alfaro et al. (2017}) y ^{Becerra (2019}), quienes reportaron la presencia de especies del género Colletotrichum con mayor frecuencia en aislamientos del síntoma de la roña del aguacate.

Con base en los estudios realizados por Hernández y Gonzáles (2010) y ^{Pérez et al. (2016}), se descartaron las ocho especies restantes por su menor frecuencia de desarrollo de colonias (presencia en un máximo en tres cajas sembradas), así como por la identificación como hongos contaminantes para el caso de los géneros Aspergillus, Penicillium y Trichoderma.

En la identificación morfológica de la cepa con mayor frecuencia de crecimiento, se observó el desarrollo de colonias blancas con el centro gris, de textura algodonosa, con producción de masas conidiales de color naranja en el centro. Se caracterizó por ser una colonia de rápido crecimiento (en ocho días cubrió la caja Petri de 15 cm de diámetro). En sus características microscópicas, se observó micelio septado, conidios unicelulares alargados, casi cilíndricos con un ligero estrechamiento en el centro que da la apariencia de un septo y con extremos redondeados (Barnett y Hunter, 1998). Estas características coinciden con las referidas para el género Colletotrichum perteneciente al Phylum Ascomycota, Clase Hypocreomycetidae y Orden Glomerellales (Réblová et al., 2011) (Figura 2).

El segundo aislamiento con mayor porcentaje de crecimiento, Pestalotiopsis sp., desarrolló colonias blancas de micelio septado con un crecimiento rocetado. Además, se observó el desarrollo de cuerpos fructíferos de color negro que presentaron conidios multicelulares fusiformes (de 3 a 5 células) con tres flagelos apicales y uno basal (^{Barnett y Hunter, 2006}). Estas características coincidieron con las referidas para este género que pertenece al Phylum Ascomycota, Clase Sordariomycetes y Orden Xylariales (Réblová et al., 2011) (Figura 2).

Figura 2 A) Aislamientos del género Colletotrichum sp. que muestran el crecimiento algodonoso con alto contenido de formación en el centro de propágulos cerosos de color naranja a rosado. B) Formación de conidios hialinos, ovoides u oblongos de forma acortada con terminación circular uniforme de 25- 30 μm. C) Colonias de Pestalotiopsis sp. y desarrollo de cirrus color negro brillante y de forma irregular. d) Conidios con septos y tres flagelos. 

Síntoma de “mancha púrpura.” Del tejido vegetal con síntoma de “macha púrpura”, se obtuvieron 25 aislamientos, en los cuales las colonias con mayor frecuencia fueron las de crecimiento en estroma tipo viscoso y cerebriforme, lento crecimiento de 0.35 mm por día, con elevaciones en el centro, con gran variabilidad de formas y colores naranjas claro, amarillo claro, que con la edad se oscurecieron tornándose rojos cafés rojizos, algunas de apariencia afelpada, micelio aéreo y humedad en el centro, con presencia de micro y macro conidios que fueron de los 3-14 micras y micelio turuloso, estas fueron identificadas morfológicamente como Elsinoe sp., ya que estas características concuerdan con lo expuesto por ^{Hyde et al. (2013)}, como características del género Elsinoe. También se identificó con crecimientos esporádicos (1-2%) a Colletotrichum sp. y Alternaria sp, (Figura 3).

Figura 3 A) Variabilidad en color y forma de crecimiento de los aislados de E. perseae. B) micelio turuloso. C) y D) conidios de 3-14 micrometros. 

Identificación molecular. Mediante la amplificación de los iniciadores ITS5/ITS4 se identificó a C. gloeosporioides; sin embargo, para Pestalotiopsis sp. los resultados de la secuenciación no fueron concluyentes (Cuadro 2). Por otro lado, mediante la secuencia de los genes LSU, EF-1α e ITS se identificó a E. perseae (Cuadro 3). Las secuencias de nucleótidos identificadas se depositaron en la base de datos del GenBank (Cuadro 4).

Análisis filogenético de los aislamientos obtenidos de frutos de aguacate con síntomas de “roña típica”. El árbol filogenético agrupó seis clados, además del grupo externo, de los cuales dos agrupan en su totalidad a la especie C. gloeosporioides, donde se encuentra la cepa identificada en el presente estudio. Esto corrobora la identidad de los aislamientos obtenidos en el presente estudio como C. gloeosporioides (Figura 4).

Figura 4 Árbol filogenético bayesiano para el complejo Colletotrichum gloeosporioides, reconstruido utilizando los iniciadores ITS5/ITS4. En color rojo se muestra el aislamiento obtenido en este trabajo. La barra indica la sustitución por sitio. En los nodos se ejemplifica la probabilidad posterior (PP). Se utilizó como grupo externo C. boninense, aislamiento 126, perteneciente a otro complejo del género. 

Análisis filogenético de las cepas aisladas de frutos de aguacate con síntoma de “mancha púrpura”. El árbol filogenético bayesiano agrupó a más de 14 clados, además del grupo externo. Las secuencias obtenidas de las cepas identificadas morfológicamente como E. perseae se agruparon con las cepas depositadas en el GenBank con la misma especie, lo que corrobora la identidad de las cepas aisladas del síntoma de “mancha púrpura” como E. perseae y soporta el origen monofiletico de esta especie (Figura 5).

Pruebas de patogenicidad. Se inoculó con Pestalotiopsis sp. y C. gloeosporioides para evaluar el síntoma de “roña típica”; y con aislamiento identificado como E. perseae para evaluar el síntoma de “mancha púrpura”.

Pestalotiopsis sp. El síntoma que ocasionó el hongo identificado como Pestalotiopsis sp., fue necrosis seca que avanzó por el tallo hasta la base de la rama y provocó la momificación de los frutos en plantas de las variedades Hass y Flor de María. Los síntomas menos severos se encontraron en las plantas criollas y las de la variedad Flor de María, ocasionando una necrosis parcial con grietas verticales, estos síntomas concuerdan con lo reportado por ^{Tamayo (2007}), como secamiento de ramas y mancha foliar.

Figure 5 Bayesian phylogenetic tree for species of the genus Elsinoe, reconstructed using assembled sequences of primers ITS1/ITS4, ITS5/ITS4, EF-1 α F/EF-1 α R, Sph1 F/Sph1 R. Red text indicates the isolations obtained in this work. The bar indicates substitution per site. Nodes exemplify the posterior probability (PP). Myriangium hispanicum, aislamiento CBS 227.59, which belongs to another family of the same genus, was used as an external group. 

Autores como Morales et al. (2009), han aislado a Pestalotiopsis versicolor de frutos de aguacate con síntomas de antracnosis y a Pestalotiopsis sp. de frutos con síntomas de roña del aguacate. Sin embargo, a pesar de que la cepa de Pestalotiopsis sp. inoculada reprodujo una corchosis, no se replicó el síntoma típico de roña observado en campo, por lo que se descarta a Pestalotiopsis sp. como el agente causal de la roña típica.

Se han reportado especies de Pestalotiopsis sp. como patógenos de algunas variedades de aguacate y otros frutales como mango, manzana, plátano y uva. Sin embargo, se desconocía con exactitud los daños que puede causar este hongo en el fruto de aguacate (^{Zhang et al., 2003}; ^{Djeugap et al., 2015}). En las pruebas de patogenicidad, realizadas en el presente estudio se comprobó que Pestalotiopsis sp. puede ocasionar una necrosis seca total del fruto, hasta dejarlo momificado, y en ramas provoca necrosis con agrietamientos corchosos. Estos síntomas son diferentes a los reportados para la roña típica.

Colletotrichum gloeosporioides. Las enfermedades causadas por Colletotrichum sp. incluyen la antracnosis, podredumbre de frutos y flores, la mancha foliar, entre otros tipos de pudriciones; afecta a una amplia gama de cultivos, entre los que destaca el aguacate (^{Freeman et al., 1998}; ^{Silva y Ávila, 2011}). Al ser un hongo de rápido crecimiento, puede entrar como patógeno secundario al aprovechar las lesiones que provocan otros hongos como E. perseae. ^{Zentmyer (1984}) describió que Colletotrichum sp. es incapaz de entrar directamente en el fruto y generalmente se establece en las lesiones del fruto causadas por Cercospora sp. o E. perseae. Por lo tanto, es posible que Colletotrichum sp. se encuentre como un hongo oportunista.

Las pruebas de patogenicidad para la cepa identificada como C. gloeosporioides reprodujeron síntomas similares a la roña del aguacate, lo que comprueba que otros patógenos pueden estimular la producción de capas de corcho como lo describieron ^{Cruz et al. (2006}). Las plantas inoculadas con la cepa identificada como Colletotrichum sp. presentaron en el fruto un síntoma inicial de manchas necróticas que al crecer formaron grietas de aspecto corchoso, similares a las descritas por ^{Everett et al. (2011}) y ^{Fan et al. (2017}) ocasionadas por E. perseae. En tallos se observaron síntomas de necrosis con grietas longitudinales, similares a los reproducidos por Pestalotiopsis sp.; mientras que, en ramas tiernas y pedúnculo, el síntoma fue similar a lo descrito por Everett et al. (2011) como roña del aguacate.

Elsinoe perseae. El aislamiento identificado morfológicamente como E. perseae, se obtuvo de frutos con el síntoma de “mancha púrpura”. Se reprodujeron los síntomas iniciales, los cuales son comúnmente encontrados en campo, semejante a los reportados por ^{Morales (2017}) y a su vez las lesiones iniciales coinciden con lo reportado por Jenkins en 1934 como la roña del aguacate (^{Everett et al., 2011}; ^{Fan et al., 2017}), por lo que es sinónimo de la mancha purpura descrita por Morales (2017). Esto demuestra que estos nombres comunes son sinónimos y están asociados al mismo agente causal. Se observaron lesiones circulares pequeñas o con borde irregular de color oscuro a violáceos. Se evaluó durante dos meses y al final de la evaluación las lesiones alcanzaron un tamaño máximo de 5 mm. Se realizó un reaislamiento de los síntomas producidos en los frutos y se obtuvieron aislamientos que coincidieron morfológicamente con las cepas inoculadas (Figura 6).

Figura 6 Síntomas en frutos inoculados con: A) Elsinoe perseae, B) Pestalotiopsis sp. y D) Colletotrichum gloeosporioides.  

^{Everett et al. (2011}) y ^{Fan et al. (2017}) relacionan a Elsinoe perseae como agente causal de la roña del aguacate. Otra situación, es la identificación errónea del síntoma de esta enfermedad en campo ya que en los muestreos de este trabajo se comprobó que otros patógenos, plagas y daños mecánicos pueden provocar corchosis en el pericarpio del fruto como mecanismos de defensa (^{Cruz, 2006}). Por lo que, la caracterización e identificación del síntoma es de suma importancia para realizar un manejo integrado adecuado de esta enfermedad.

Conclusiones

Se obtuvieron 16 aislamientos diferentes, los cuales corresponden a los géneros Colletotrichum, Pestalotiopsis, Fusarium, Curvularia, Alternaria, Leptosphaerulina, Cladosporium y Epicoccum asociada al síntoma de “roña típica”

Colletotrichum gloeosporioides no reprodujo síntomas idénticos a la “roña típica” en las pruebas de patogenicidad ya que la corchosis producida penetró al mesocarpio. Mientras que, Pestalotiopsis sp. reprodujo antracnosis descendente y momificación de los frutos.

Se obtuvieron 25 aislamientos del síntoma de mancha púrpura que correspondieron al género Elsinoe.

El hongo identificado como E. perseae inicialmente reprodujo manchas irregulares de color marrón a violáceas que al crecer y unirse formaron una corchosis limitada al epicarpio, síntomas asociados a la enfermedad conocida como “mancha púrpura”.

Se corrobora la presencia de E. perseae en Michoacán.