Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), agente causal de la marchitez por Fusarium o Fusariosis de las musáceas, se reportó por primera vez en Australia, en 1874, y posteriormente, en 1890 se reportó en Panamá y Costa Rica (América); por lo que, se asume que este patógeno se dispersó desde estos dos países al resto de este continente (^{Ashby, 1913}; ^{Fish, 1970}). Existen tres razas de este patógeno que afectan plátanos y bananos: i) Raza 1 (FocR1), afecta a Musa textilis (abacá), bananos de los clones Gros Michel (AAA), Maqueño (AAB), Silk (AAB), Pome (AAB), Pisang Awak (ABB) e IC2 (AAAA); ii) Raza 2 (FocR2), afecta bananos de clones Bluggoe (ABB) y otros híbridos del genoma AAAA; y iii) la Raza 4 Tropical (FocR4T), es un patógeno agresivo en los cultivares Cavendish (AAA), como Dwarf Cavendish, Grand Nain y Williams, así como en los demás cultivares susceptibles a FocR1 y FocR2 (^{Su et al., 1986}; ^{Ploetz, 2005}). En México, esta enfermedad se reportó por primera vez en 1932 (^{Ploetz, 2018}); así mismo, ^{Florencio-Anastasio et al. (2022}) determinaron mediante un análisis filogenético que cuatro aislamientos de Foc obtenidos de muestras de los estados de Puebla y Michoacán se agruparon dentro del Clado VI de la clasificación propuesta por ^{Fourie et al. (2009}) y ^{Karangwa et al. (2018}). FocR1 ha provocado severas epidemias que impactaron en la industria bananera en América, cuya producción fue basada en la variedad Gros Michel, lo que provocó la desaparición de la mayoría de las plantaciones comerciales de esta variedad en el período de entre 1950 a 1960, provocando pérdidas económicas de hasta $2.3 mil millones de dólares (^{Dita et al., 2013}). En el Valle de Ulúa (Honduras) se perdieron 30,000 ha en el período de 1940 a 1960; mientras que en Surinam y Quepos (Costa Rica) se dañaron de 4,000 y 6,000 ha en un período de ocho y 12 años, respectivamente (^{Ploetz, 2000}).

En México, durante la década de 1960 y principios de 1970, cerca de 40,000 ha cultivadas con la variedad Gros Michel fueron arrasadas; tan solo en 1994 había alrededor de 4,000 ha de plátano Manzano, las cuales se redujeron a 1,260 ha, en 2004 (^{Orozco-Santos, 2013}) y para el ciclo 2020 se tenían establecidas 1,690 ha (^{SIAP, 2022}). Para contrarrestar las pérdidas económicas provocadas por FocR1, la solución a nivel mundial consistió en reemplazar aquellas plantaciones establecidas con Gros Michel por cultivares del subgrupo Cavendish, que representan más del 99 % del banano de exportación (^{Dita et al., 2018}). Por otra parte, se reportó por primera vez a FocR4T en Taiwán en 1989 (^{Ploetz, 2018}), para 2022 su distribución comprende Australia, Birmania, China, Colombia, Filipinas, India, Indonesia, Islas Mayotte (Francia), Israel, Jordania, Laos, Líbano, Malasia, Mozambique, Omán, Pakistán, Perú, Reino Unido, Tailandia, Taiwán, Turquía y Vietnam (^{Ploetz et al., 2018}; ^{Promusa, 2018}; ^{DOA. 2019}; ^{ICA, 2019}; ^{Aguayo et al., 2021}; ^{García-Bastidas et al., 2020}; ^{Özarslandan y Akgül, 2020}; ^{SENASA, 2021}).

La presencia de este patógeno en dos países de América (Colombia y Perú), incrementa el riesgo de su introducción a México (^{Florencio-Anastasio et al., 2022}). Aun cuando los bananos del grupo Cavendish son resistentes a las razas 1 y 2 (^{Su et al., 1986}), no existen cultivares de banano o plátano resistentes o productos químicos efectivos contra FocR4T (^{Cook, 2005}). Así mismo, se han propuesto algunos esquemas de control biológico basados en el uso de bacterias y hongos antagonistas contra las razas de Foc (^{Bubici et al., 2019}); por ejemplo, la bacteria Burkholderia cenocepacia 869T2 presentó 44.4% de inhibición in vitro, y redujo en 86.1% la incidencia de FocR4T en banano Cavendish en campo (^{Ho et al., 2015}). También Pseudomonas fluorescens y P. fluorescens WCS417 redujeron (83.4 y 87.4%, respectivamente) la severidad de FocR4T en banano Cavendish en invernadero. El uso de biofertilizantes basados en abono de cerdo en combinación con Bacillus amyloliquefaciens NJN-6 redujo 75% la incidencia de FocR4T en banano Cavendish en invernadero (^{Shen et al., 2015}), mientras que la misma bacteria disminuyó 68.5 % la incidencia de FocR4T en campo (^{Xue et al., 2015}). Por otra parte, B. amyloliquefaciens W19 redujo 42.8 y 44.4% la incidencia de Foc en dos campos de banano Cavendish (^{Wang et al., 2016}); además, B. subtilis N11redujo 82.1% la incidencia de FocR4T, mientras que la combinación de Paenibacillus polymyxa SQR21 + Trichoderma harzianun T37 redujo 64.3% la incidencia de FocR4T, en banana Cavendish (^{Zhang et al., 2011}). Las bacterias Paenibacillus sp. BSP.1.1, Serratia sp. AC35, Pseudomonas tolaasii P61, Bacillus pumilus BFIEST 4C, B. pumilus R44, B. pumilus A1, y Serratia liquefaciens CPA C53 inhibieron el crecimiento micelial in vitro de cinco aislamientos de Foc Raza “1 o 2” en 46.6, 26.6, 12.0, 11.9, 10.1, 9.7 y 4.9%, respectivamente (Florencio-Anastasio et al., 2022). Por lo anterior, la presente investigación evaluó el efecto in vitro de cinco bacterias antagonistas sobre el desarrollo micelial de FocR2, como hongo fitopatógeno modelo, dada su presencia en el país, para valorar su aplicación potencial en futuros esquemas de manejo fitosanitario, ante una eventual introducción de FocR4T a nuestro país.

Análisis filogenético. Con la finalidad de determinar la raza a la cual pertenecen los aislamientos evaluados en el presente estudio (Cuadro 1), se siguió la misma metodología reportada por ^{Florencio-Anastasio et al. (2022}), se realizó el análisis filogenético de la región IGS (Intergenic spacers) del rDNA amplificada con los iniciadores PNFo y PN22 (^{Edel et al., 1995}).

Aislamientos FocR2. Los aislamientos del hongo fueron donados por el Laboratorio de Micología del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA). Los cuales fueron aislados de plantaciones bananeras de Hueytamalco, Puebla (MIC17188; MIC17189; MIC17190), Tacámbaro, Michoacán (MIC17191) y Villa de Tututepec de Melchor Ocampo, Oaxaca (MIC17192), a partir de muestras de plantas individuales colectadas por el Programa Nacional de Vigilancia Epidemiológica Fitosanitaria (PVEF) para la vigilancia y detección oportuna de FocR4T. Las muestras colectadas consistieron en fragmentos de 5 x 1.5 cm de haces vasculares de plantas plátano con síntomas de amarillamiento.

Cepas bacterianas evaluadas. Para el bioensayo 1, se utilizaron las cepas bacterianas Bacillus subtilis (BASU), B. sonorensis (BASO), B. velezensis (BAVE), las cuales fueron proporcionadas por el Laboratorio de bacterias, Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria del SENASICA (Cuadro 2) para evaluar su efecto en el crecimiento micelial de tres aislamientos de FocR2 (MIC17188, MIC17191 y MIC17192) (Cuadro 1). Por otra parte, en el bioensayo 2, se utilizaron las cepas bacterianas Paenibacillus sp. BSP 1.1 y Serratia sp. AC 35, las cuales fueron proporcionadas por el Laboratorio de Microbiología, Postgrado de Edafología, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, para determinar su influencia en el crecimiento micelial de la cepa FocR2 CNRF-MIC17188 (número de accesión MN702818).

Bioensayo 1. Inhibición in vitro de bacterias contra tres aislamientos de FocR2. Para este bioensayo se evaluó el efecto antagonista de las cepas bacterianas: BASU, BASO, BAZE (Cuadro 1), sobre el crecimiento micelial de los aislamientos MIC17188, MIC17191 y MIC17192 (Cuadro 2) utilizando la técnica propuesta por (^{Pineda-Mendoza et al., 2019}). Las bacterias se reactivaron en agar nutritivo (Merck®) Se establecieron cuatro tratamientos (tres bacterias más el testigo) con cuatro repeticiones cada uno. En los extremos de las cajas de Petri con medio PDA (Potato Dextrose Agar, Merck®), se colocó una asada (línea de 5 cm) de las cepas bacterianas de siete días de crecimiento. Las cajas fueron incubadas en oscuridad a 28 ± 2 °C por 24 h; posteriormente, se colocaron discos de agar de 7 mm de diámetro de cada aislamiento de FocR2, los cuales fueron removidos de los márgenes de los cultivos fúngicos de siete días de crecimiento, y se colocaron en el lado opuesto de cada caja, a 5 cm de distancia del crecimiento bacteriano. El testigo consistió en solo colocar discos del crecimiento fúngico en medio de cultivo PDA. Las cajas se incubaron nuevamente en oscuridad a 28 ± 2 °C; a los 3, 7, 10 y 14 días después de la siembra, se midió el radio de crecimiento micelial de cada aislamiento fúngico, se tomaron cuatro mediciones del crecimiento fúngico con un vernier, para calcular el porcentaje de inhibición se utilizó la formula reportada por ^{Landa et al. (1997}):

Porcentaje de inhibición R-rRx 100

Dónde, r es el radio de crecimiento del hongo en presencia de la bacteria y R es el radio de crecimiento del hongo sin la bacteria (testigo).

Bioensayo 2. Inhibición in vitro de Paenibacillus sp. (BSP 1.1) y Serratia sp. contra el aislamiento MIC17188 de FocR2 en tres tiempos de pre-inoculación. En este bioensayo se evaluó el efecto inhibitorio in vitro de las cepas bacterianas Paenibacillus sp. (BSP 1.1) y Serratia sp. (AC 35) juntas y separadas (Cuadro 1) contra el aislamiento MIC17188 de FocR2 (Cuadro 2), en estudios previos, dicho aislamiento presentó mayor ritmo de crecimiento in vitro (^{Florencio-Anastasio et al., 2022}), se evaluaron tres diferentes tiempos de pre-inoculación a 2, 4 y 7 días de pre-inoculación (DPI) en el medio de cultivo (pre-inoculación se refiere a la siembra de las bacterias en la caja de Petri previo a la siembra de los aislamientos del hongo, con la finalidad de que las bacterias produzcan y secreten metabolitos antifúngicos). Se utilizó el mismo procedimiento de inoculación descrito en el Bioensayo 1. Se colocó un disco de 7 mm del hongo en el centro de la caja de Petri y se colocaron asadas de 5 cm de las cepas bacterianas en extremos opuestos, de tal manera que el crecimiento bacteriano quedó separado inicialmente a 3 cm del hongo y a 6 cm entre sí. Se establecieron cuatro repeticiones por cada tratamiento, incluyendo el testigo el cual consistió de disco de 7 mm del hongo, y las cajas de Petri se incubaron nuevamente en oscuridad a 28 ± 2 °C. Se midió el radio de crecimiento micelial del aislamiento del hongo a los 2, 4, 6 y 7 días.

Diseño experimental y análisis estadístico. Para cada ensayo se estableció un diseño experimental completamente al azar y se realizaron por separado, para evitar posibles efectos cruzados por compuestos volátiles producidos por bacterias antagonistas. Los datos de inhibición se analizaron con el paquete estadístico SAS para Windows (SAS Institute Inc, 2002), realizando un análisis de varianza y la prueba de comparación de medias de Tukey (α ≤ 0.05).

Análisis filogenético. El análisis BLAST de las secuencias consenso de los aislamientos MIC17188, MIC17189, MIC17190 (Hueytamalco, Puebla) y MIC17191 (Tacámbaro, Michoacán) permitió confirmar la identidad de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 2 con 100 % de cobertura y agrupadas con la raza dentro del Clado VI propuesto por ^{Fourie et al. (2009}) y ^{Karangwa et al. (2018}) (Figura 1).

Figura 1 Análisis filogenético de cuatro aislamientos de Fusarium oxysporum f. sp. cubense (MIC17188, MIC17189, MIC17190, MIC17191) de Puebla y Michoacán, México. 

Bioensayo 1. Inhibición in vitro de bacterias contra tres aislamientos de Foc R2. La cepa bacteriana BASU fue la que provocó la inhibición mayor del desarrollo micelial de los tres aislamientos de FocR2, con un 55.1% en promedio, a los 14 días de la confrontación. Por su parte, las cepas BAVE y BASO mostraron un porcentaje de inhibición promedio de 45.8 y 21.7%, respectivamente (Cuadro 3; Figuras 2 y 3).

Figura 2 Inhibición in vitro de Bacillus subtilis (BASU), B. sonorensis (BASO), y B. velezensis (BAVE) contra los aislamientos MIC17188, MIC17191 y MIC17192 de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 2, a los 14 días de evaluación. A) Crecimiento micelial, y B) Porcentaje de inhibición. Medias+Error estándar. n=4. 

Figure 3 In vitro mycelial growth of the isolates MIC17188, MIC17191 and MIC17192, of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 2 in the presence of Bacillus subtilis (BASU), B. sonorensis (BASO) and B. velezensis (BAVE) bacteria, at 3, 7, 10 and 14 days of evaluation. Means + Standard error. n=4. 

Bioensayo 2. Inhibición in vitro de Paenibacillus sp. (BSP 1.1) y Serratia sp. contra el aislamiento MIC17188 de FocR2 en tres tiempos de pre-inoculación. A los 7 días de evaluación, la cepa bacteriana Paenibacillus sp. BSP 1.1, por si sola tuvo el mayor efecto inhibitorio en el crecimiento micelial del aislamiento MIC17188 a los 4 y 7 DPI de 75.9 y 80.1%, respectivamente, seguido de la combinación de Paenibacillus sp. BSP 1.1 + Serratia sp. AC35 cuya inhibición fue de 52.7 y 75.5%, respectivamente; Mientras que la cepa bacteriana Serratia sp. AC35 presentó valores de inhibición del 46.8 y 52.3% en las mismas fechas de pre-inoculación (Cuadro 4; Figura 4).

Figura 4 Inhibición in vitro de las bacterias Paenibacillus sp. (BSP 1.1) y Serratia sp. (AC35) contra el aislamiento MIC17188 de Fusarium oxysporum f. sp. cubense a tres tiempos de inoculación bacteriana (dos, cuatro y siete días). A) Crecimiento micelial, y B) Porcentaje de inhibición. A los siete días de evaluación. Medias + Error estándar. n=3. 

La capacidad de inhibición in vitro de las cepas bacterianas BASU, BAVE y BASO consideradas en este trabajo, no se había determinado previamente contra ningún patógeno; estas cepas inhibieron el crecimiento miceliar de tres cepas de FocR2, en 40.87% en promedio, siendo las más efectivas BASU (55.1%) y BAVE (45.8%), en tanto que BASO mostró la menor efectividad (21.7%). Existen reportes donde indican que varias cepas bacterianas de B. subtilis ejercen inhibición in vitro hacia F. oxysporum y a la vez reducen la incidencia de FocR1 cuando se inoculan en vitroplantas de banana variedad Red banana (AAA) en condiciones de invernadero ya sea solas o en combinación con Pseudomonas fluorescens Pf1 (^{Rubio-Tinajero et al., 2021}; ^{Kavino y Manoranjitham, 2018}). De igual forma, la efectividad de B. subtilis se ha evaluado en ensayos in vivo, con base en su capacidad de reducir la incidencia de F. oxysporum en tubérculos de Dioscorea villosa (^{Khan et al., 2017}). En particular algunas especies de B. velezensis han mostrado cierta efectividad en la reducción de la incidencia de F. oxysporum en plántulas de banano, en condiciones de invernadero (^{Cao et al., 2018}), y de manera especial la incidencia de FocR4T en plantas de banano Cavendish var. Brazil (^{Huang et al., 2019}). Lo anterior concuerda con lo reportado por ^{Segura-Mena et al. (2021}) quienes mencionan que la utilización de bacterias benéficas/antagonistas son parte de prácticas de manejo del suelo para reducir la incidencia y severidad de enfermedades causadas por Fusarium.

Los resultados obtenidos sugieren que B. subtilis y B. sonorensis podrían ser potencialmente evaluadas en invernadero y posteriormente en campo, para en un futuro también ser consideradas como parte de un programa de manejo contra FocR2 y contra FocR4T, ante una eventual introducción de este último; ya sea mediante prácticas de bacterización de vitroplantas de plátano antes de su establecimiento en campo o en la elaboración de formulaciones de biofertilizantes que se podrían aplicar una vez que el cultivo está establecido en campo, como ya ha sido reportado por ^{Kavino y Manoranjitham (2018}) y ^{Huang et al. (2019}).

Respecto a la inhibición del crecimiento micelial de FocR2 MIC17188, un estudio previo, demostró que las cepas bacterianas Paenibacillus sp. BSP1.1 y Serratia sp. AC35 ejercieron una inhibición de 45 y 27% cuando se preinocularon un día antes de la confrontación fúngica (^{Florencio-Anastasio et al., 2022}); en el presente trabajo, esta inhibición se incrementó hasta 80.1 y 52.3%, respectivamente, cuando las bacterias se preinocularon in vitro, siete días antes de la confrontación, lo que sugiere que entre más tiempo tengan las bacterias para establecerse en el medio de cultivo, mayor será el efecto inhibitorio. Lo anterior, da consistencia a lo sugerido por ^{Caballero-Hernández (2011}) al recomendar la protección de plantas de banano con bacterias antagonistas aplicadas siete días antes de la inoculación del patógeno.

Además, la cepa Paenibacillus sp. BSP1.1 también ha sido eficaz para inhibir el crecimiento micelial de Rhizoctonia sp. (^{Pineda-Mendoza et al., 2019}), esta cepa bacteriana es atractiva para su utilización biotecnológica como parte de un programa de manejo integrado para el biocontrol de Foc, debido a alto porcentaje de inhibición contra cinco aislamientos de Foc Raza “1 o 2” (^{Florencio-Anastasio et al. 2022}). Además, esta bacteria produce auxinas e índoles, y solubiliza fosfatos, por lo que se considera un buen promotor del crecimiento vegetal y mejora la germinación de semillas y el crecimiento de plantas de Capsicum annum (^{Angulo-Castro et al., 2018}; ^{Pineda-Mendoza, 2015}; ^{Pineda-Mendoza et al., 2019}). Por lo tanto, Paenibacillus sp. BSP1.1 potencialmente puede utilizarse en programas de control biológico como “práctica de bacterización” una semana antes de su establecimiento en campo para inducir mayor protección a vitroplantas de plátano y banano