La piña (Ananas comosus) es el tercer cultivo tropical más importante en todo el mundo (^{Sanewski et al., 2018}). Curvularia clavata es el agente causal de la mancha foliar en plantas de piña, con una incidencia de entre 35 y 58% en China (^{Zhong et al., 2016}). Curvularia eragrostidis causa pérdidas poscosecha en frutos de piña en Brasil (^{Ferreira et al., 2014}). Curvularia sp. causa mancha foliar en campos de cultivo de piña en Nicaragua (^{García-Osorio y Orozco-Gomez, 2016}). México es el 7° productor de piña (^{INEGI, 2019}) a nivel mundial. Recientemente, ^{Maldonado-Michel et al. (2021}) reportaron a C. eragrostidis como el agente causal de la mancha foliar de la piña en el estado de Colima (Pacífico Centro de México). Sin embargo, ese estudio carece de datos moleculares para una identificación precisa de las especies. También probaron la actividad antifúngica de los extractos de semillas de Swietenia humilis. No obstante, el manejo local regular de enfermedades fúngicas incluye fungicidas químicos, a pesar de que los principales efectos secundarios de estos productos están relacionados con daños a la salud humana, impacto ambiental severo y desarrollo de cepas resistentes (^{Heydari y Pessarakli, 2010}). Por lo tanto, existe la necesidad de evaluar métodos alternativos como el uso de agentes de control biológico (ACB) y extractos de plantas (EP), que han demostrado ser más seguros y eficientes (^{Cerqueira-Sales et al., 2016}) contra C. eragrostidis. En Colima, México, están disponibles algunos biofungicidas ACB y EP, pero no se han probado localmente y de manera adecuada. El objetivo principal de esta investigación fue identificar el agente causal de la enfermedad de la mancha foliar en piña y evaluar la efectividad in vitro de cinco productos biológicos comerciales contra C. eragrostidis.

Se tomaron muestras al azar de plantas con síntomas de mancha foliar en una plantación de piña (cv. MD2) en Tecomán, Colima, México (18° 47’ 41.3” N; 103° 51’ 26.9” O). Se recolectaron diez muestras en 2 hectáreas. El aislamiento fúngico se realizó de acuerdo con ^{Orozco-Santos et al. (2004}). Las hojas infectadas se cortaron, se lavaron con NaClO al 1% durante 3 min, se enjuagaron con agua destilada en autoclave y se secaron en papel de filtro estéril. El tejido vegetal desinfectado se molió en nitrógeno líquido y luego se liofilizó. Esto sirvió como inóculo en 400 mL de caldo Czapek agitado a 2 Hz a temperatura ambiente por 3 días. Posteriormente, se inocularon 50, 100 y 150 μL de cultivo en cajas de Petri con PDA y se incubaron a 31 °C durante 3 días. Las colonias individuales se transfirieron e incubaron durante 5 días y se usaron como inóculo para microcultivos en portaobjetos con PDA (^{Zhong et al., 2016}).

La identificación morfológica se realizó siguiendo a ^{Ferreira et al. (2014}), ^{Manamgoda et al. (2012}) y ^{Rocha-Santos et al. (2018}). Se utilizaron muestras de cultivos monoconidiales para la identificación molecular mediante la secuenciación de la región parcial ITS utilizando los cebadores ITS1 e ITS4 (^{White et al., 1990}). Las secuencias se inspeccionaron mediante cromatogramas utilizando el programa Sequencher™ v. 5.2.3. La secuencia curada se usó para consulta BLASTN en el GenBank de NCBI. Después se realizó un MegaBlast y se descargaron de GenBank 48 secuencias de Curvularia muy similares (Figura 1) y dos secuencias de grupos externos. Estas secuencias se alinearon usando el algoritmo CLUSTALW con parámetros predeterminados (^{Thompson et al., 2003}) y se editaron manualmente utilizando el paquete de software MEGA X (^{Tamura et al., 2013}). El análisis filogenético molecular consistió en un análisis filogenético de Máxima Verosimilitud (ML) con el modelo ^{Kimura de 2 parámetros G+I (Kimura, 1980}). Los huecos fueron tratados como deleciones parciales con un 95% de cobertura, utilizando un método heurístico NNI (intercambio del vecino más cercano, por sus siglas en inglés) para refinar la topología del árbol con 1000 réplicas de arranque. Los árboles se enraizaron utilizando Bipolaris maydis (=Cochliobolus heterostrophus) como clado hermano y Alternaria alternata como grupo externo (Manamgoda et al., 2012; ^{Tan et al., 2018}).

Figura 1 Análisis filogenético molecular de especies de Curvularia basado en el método de Máxima verosimilitud y utilizando el modelo Kimura de 2 parámetros (G+I). Se muestra el árbol con el logaritmo de probabilidad más alto (-1962.89). El porcentaje de árboles en los que los taxones asociados se agruparon se muestra junto a las ramas, según 1000 réplicas de arranque. El número de accesión se indica en cada taxón. Los nombres de taxones marcados con * son material ex-tipo. El país de origen de los aislamientos está entre paréntesis. 

El Cuadro 1 muestra los detalles de los biofungicidas comerciales. Se evaluaron cuatro dosis con distintas concentraciones: 1.0, 0.5, 0.25 y 0.125% (v/v o p/v) en 20 mL de PDA + biofungicida. Los productos sólidos se expresaron en mg L^-1 y los líquidos en mL L^-1. Las cajas de Petri con PDA suplementadas se prepararon de dos formas: 1) a base de EP y 2) a base de ACB. Los productos de EP (System Max®/Sedric 4X®) se agregaron al PDA antes de la solidificación y después se sembraron en cajas de Petri. Los productos ACB se mezclaron en el PDA y se vertieron 20 mL en cajas de Petri. En cada placa de Petri se inoculó un disco de 9 mm de diámetro del hongo patógeno de 7 días de edad y se incubó a 29 °C durante 10 días.

La tasa de crecimiento diario (TCD) se calculó midiendo el diámetro de la colonia del patógeno cada 24 horas durante 5 días usando la fórmula TCD = [(R1-R0)/(T1-T0)], donde R1 y R0 es el crecimiento del diámetro de la colonia (mm) y T1 y T0 es el tiempo (días) (^{Bahekar et al., 2017}). La inhibición del crecimiento micelial del patógeno (% ICM) se calculó como % ICM = [(C - T)/C] x 100%, donde C = diámetro de crecimiento del control (mm) y T = diámetro de crecimiento del tratamiento (mm) (Bahekar et al., 2017). Se calcularon las concentraciones efectivas media y noventa (CE₅₀ y CE₉₀) mediante un análisis Probit en SAS 9.0 (^{Manzo-Sánchez et al., 2018}). El diseño experimental consistió en un diseño completamente al azar con arreglo factorial combinatorio, siendo A la marca del producto biológico y B las diferentes dosis de cada producto. Cinco productos biológicos, cuatro dosis cada uno, y un control (sin producto). Cada tratamiento tuvo seis repeticiones, con un total de 126 unidades experimentales. El análisis de datos de TCD se llevó a cabo con ANOVA y comparación de medias utilizando la diferencia mínima significativa (DMS), con P=0.05. El porcentaje de datos de ICM se transformó utilizando la ecuación de arcsen (% ICM)^½ para obtener una distribución aproximadamente normal y someter a análisis más tarde. La CE₅₀ se calculó con un análisis Probit. Finalmente, se realizó un análisis de regresión lineal (Y=mX+b) entre la concentración del producto (X) y el porcentaje de ICM (Y).

El aislado mostró características morfológicas macro y microscópicas coincidentes con Curvularia eragrostidis, como una colonia gris algodonosa (7.7 cm, 5 días de incubación) que se tornó negra aterciopelada con bordes regulares. Conidios elipsoidales, distoseptados, de 21.6-24.9 × 11.6-13.3 µm. Conidióforos marrones, agrupados y septados. El micelio se compone de hifas septadas oscuras. El análisis filogenético molecular de especies de Curvularia, basado en el método de máxima verosimilitud, agrupó la secuencia con la anterior con alto apoyo estadístico, confirmando la identidad del aislado estudiado como C. eragrostidis. Como era de esperar, el material chino es ligeramente diferente de los aislamientos de Malasia, Indonesia y México. El subclado más cercano de C. eragrostidis incluye C. intermedia, C. pseudointermedia y C. brachyspora (Figura 1). Todas las secuencias fueron agrupadas dentro del género monofilético Curvularia con alto apoyo estadístico, separadas de Bipolaris maydis, un clado anamórfico hermano, un resultado que coincide con ^{Manamgoda et al. (2012}) y ^{Tan et al. (2018}).

El crecimiento diario de C. eragrostidis fue afectado por los productos biológicos, con diferencias altamente significativas (P≤0.0001, Cuadro 2). La TCD del grupo control fue de 1.6 cm día^-1, mientras que Tonka® mostró la tasa de crecimiento más baja con las cuatro concentraciones evaluadas, con una TCD media de 0.015 cm día^-1, que es 106.6 veces menor que la del grupo control. La actividad de BioFungus Clean® tuvo un efecto similar en las tres primeras concentraciones (1.0, 0.5 y 0.25%) con una media de 0.082 cm día^-1. SystemMax® y Sedric 4X® solo redujeron la TCD de C. eragrostidis a partir de una concentración de 0.25% con 1.47 y 0.27 cm día^-1; sin embargo, al 1.0% (0.048 cm día^-1), la reducción fue estadísticamente igual entre Tonka®, Biofungus Clean® y BliteFree®, con 0.02, 0.04 y 0.021 cm día^-1, respectivamente. El%ICM logró diferencias significativas (P≤0.0001) a los 5 días después de la inoculación. Sedric 4X® mostró el mayor porcentaje de inhibición al 1% de concentración (86.8%), 2.5 veces mayor que System Max® y 1.3 veces mayor que BliteFree® (63.7%) a la misma concentración. Este valor fue significativamente mayor (P≤0.0001) que las demás concentraciones del mismo producto (Cuadro 3). Por otro lado, Tonka® fue efectivo en todas las concentraciones, sin diferencias estadísticas (P≤0.2657) entre las cuatro dosis, con un promedio de 68.97% de inhibición. De manera similar, Biofungus Clean® tuvo el mismo efecto de inhibición (P≤0.0871) en todas las concentraciones, con una inhibición 1.2 veces menor que Tonka®. BliteFree® registró la tasa de inhibición más alta (P≤0.0002), con 63.7% a la concentración más alta, mientras que las concentraciones más bajas produjeron reducciones de 55.8 y 58.6%. En contraste, System Max® tuvo un pobre efecto contra C. eragrostidis, 5.1 veces menor que Tonka® (0.125%). El grupo control tuvo un crecimiento micelial radial de 7.7 cm. La Figura 2 muestra los resultados de los ensayos de inhibición con cuatro dosis de los cinco productos después de 5 días.

Figura 2 Crecimiento micelial de Curvularia eragrostidis en PDA suplementado con cinco dosis de productos biológicos. 

Tonka® logra un CL₅₀ de 0.008%, que fue el valor más bajo en comparación con el resto de los tratamientos, 32.2 veces menor que Sedric 4X® (0.260%) y 449.8 veces menor que System Max® (3.59%) (Cuadro 4). Sin embargo, BliteFree® y BioFungus Clean® también mostraron buenos valores con 0.015 y 0.017%, respectivamente. En la CE₉₀, el mejor resultado fue nuevamente para Tonka® con 0.040%, 9.7 veces menor que BioFungus Clean® y 4.9 veces menor que BliteFree®. El análisis de regresión lineal entre los porcentajes de inhibición y las dosis del producto (Figura 3) indicó una alta correlación entre las concentraciones de System Max® (r=0.86, P≤0.0001) y Sedric 4X®, (r=0.69, P≤0.0001), y sus porcentajes de inhibición, con diferencias muy significativas. Por el contrario, BliteFree® mostró una baja correlación entre la concentración y la inhibición (r=0.40, P≤0.0008). Por otro lado, Tonka® y BioFungus Clean® no mostraron diferencias estadísticamente significativas (P≤0.1191 y P≤0.0939, Cuadro 4).

Figura 3 Regresión lineal entre la inhibición del crecimiento micelial (%) de Curvularia eragrostidis y las dosis de los productos biológicos. A) Sistema Max®; B) Sedric 4X®; C) Tonka®; D) BioFungus Clean® y E) BliteFree®. 

La enfermedad de la mancha foliar causada por C. eragrostidis es una enfermedad emergente de la producción de piña en Colima, México (^{Maldonado-Michel et al., 2021}). El presente estudio corrobora morfológica y molecularmente la identidad del agente causal. En América del Sur, C. eragrostidis ha sido reportado como patógeno vegetal en plantas de piña por ^{Ferreira et al. (2014}), con características similares a las identificadas en el presente estudio. Se han utilizado extractos de plantas para controlar patógenos vegetales en agricultura biológica y orgánica. ^{La-Torre et al. (2014}) evaluaron la eficiencia in vitro de Mimoten®, un extracto de Mimosa tenuiflora (80.0%), contra Alternaria alternata y Botrytis cinerea. La inhibición máxima obtenida fue de 19.2% y 14.1%, respectivamente, a dosis máximas (1.0%). No hay reportes del uso de M. tenuiflora contra C. eragrostidis. System Max®, usado en el presente estudio, contiene M. tenuiflora, pero complementado con extracto de Quercus sp. y ácido gálico, lo que aumentó la inhibición hasta 34.6%. La actividad antibacteriana y antifúngica de los extractos de Quercus han sido probados antes. ^{Söhretoglu et al. (2007}) probaron extractos metanólicos de cuatro especies de Quercus contra bacterias gram (+) y (-) y tres bacterias Candida spp. Los extractos fueron más efectivos contra los hongos que contra las bacterias. En hongos filamentosos, ^{Yeo et al. (2008}) probaron Q. mongolica en extractos acuosos, metanólicos y etanólicos contra Botrytis cinerea, siendo el extracto acuoso más efectivo. El ácido gálico y otros compuestos fenólicos se han probado como antifúngicos contra patógenos humanos y vegetales.

En Trichophyton rubrum, el ácido gálico (50.0 μg mL^-1) redujo la actividad de la enzima esterol 14α-desmetilasa P450 (CYP51) y de la enzima escualeno epoxidasa, alterando la membrana fúngica (^{Li et al., 2017}). En el presente estudio, Sedric 4X®, extracto de Y. schidigera mostró 86% de inhibición en la concentración más alta. ^{Wulff et al. (2012}) evaluaron el efecto del extracto de Y. schidigera contra C. lunata de sorgo, no se logró inhibición (0%) cuando se utilizó una concentración de 10.0% (v/v) del extracto de Y. schidigera. Estas plantas son ricas en saponinas, que pueden alterar las membranas celulares y tienen un efecto tóxico sobre los hongos. ^{Maldonado-Michel et al. (2021}) probaron hexano, acetato de etilo, diclorometano y metanol para extractos de Swietenia humilis contra este aislado de C. eragrostidis, siendo el acetato de etilo, a 500 mg L^-1, el más efectivo con 68.0% de ICM. Los principales metabolitos secundarios de S. humilis son los limonoides, un tipo de triterpenoides que se encuentran en las semillas (^{Ovalle-Magallanes et al., 2015}).

Se ha reportado la inhibición completa (100.0%) de la germinación de esporas de C. lunata usando extractos orgánicos de Cinnamomum zeylanicum a la concentración más baja (50 μg mL^-1) y actividad fungicida completa a la concentración más alta (500 μg mL^-1), pero los extractos acuosos no fueron eficientes (^{Mishra et al., 2009}). Por otro lado, ^{Akinbode (2010}) evaluó in vitro la eficacia de extractos acuosos de hojas de Gliricidia sepium, Tithonia diversifolia, Phyllanthus amarus y Morinda lucida para controlar C. lunata. Al 100% de concentración, todos los extractos suprimieron el crecimiento del patógeno.

Por otro lado, BliteFree® logró una inhibición de 55.6-67.7% contra C. eragrostidis. Estos resultados son similares a los reportados por ^{Evangelista-Martínez (2014}), quien evaluó Streptomyces spp. contra Curvularia sp., logrando un 55.0% de inhibición del crecimiento del patógeno vegetal. ^{Wonglom et al. (2019}) confrontaron C. lunata aislada de Brassica rapa con S. angustmyceticus (NR8-2), logrando una inhibición del 69.0%. Los mecanismos de antagonismo de Trichoderma spp. contra patógenos vegetales incluyen antibiosis, micoparasitismo, resistencia inducida de la célula huésped, competencia por nutrientes y nicho (^{Ghazanfar et al., 2018}). ^{Tekade et al. (2017}) evaluaron T. viride y T. harzianum contra C. lunata, logrando 60.8 y 50.7% de inhibición, respectivamente, en 7 días a 27 °C. Estos resultados son similares a los obtenidos con BioFungus Clean®, que provocó una inhibición del 54.8% contra C. eragrostidis después de 5 días. Bacillus spp. es uno de los géneros más estudiados como ACB ya que las presencias que comprende presentan una actividad bioquímica diversa contra patógenos de plantas (^{Layton et al., 2011}). Se ha informado que Bacillus spp. induce defectos en la membrana celular y muerte celular en las hifas fúngicas, cuando la membrana celular se destruye, el núcleo y el protoplasto se exudan. Entre los metabolitos secundarios secretados por Bacillus spp., se han reportado proteínas antimicrobianas con componentes activos como paeonol, palmitato de etilo y ácido oxálico, que son capaces de inhibir la esporulación y el crecimiento micelial en hongos patógenos de plantas (^{Ku et al., 2021}).

^{Basha y Ulaganathan (2002}) evaluaron la cepa BC121 de Bacillus, productora de quitinasa, contra C. lunata, registrando una inhibición de hasta 60.0%. Las imágenes del microscopio electrónico de barrido mostraron una clara lisis de hifas y degradación de la pared fúngica. ^{Orberá-Ratón et al. (2012}) probaron cinco aislados de rizosfera de B. subtilis contra C. lunata, registrando una inhibición de hasta 61.0% (SR/A-1), y contra Curvularia gudauskasii, logrando una inhibición de hasta 71.0% (SR/B-16). Los autores observaron vacuolización, formación de bulbos, hinchazón de hifas, crecimiento e inhibición de la formación de conidios. Sin embargo, otras cepas han mostrado resultados diferentes. Por ejemplo, ^{Fleitas-Centurion y Grabowsky-Ocampos (2015}) evaluaron Bacillus sp. (500 uL) contra Curvularia sp., registrando 31.0% de inhibición. Los valores reportados anteriormente son heterogéneos, como ocurrió en el presente estudio con BioFungus Clean® y Tonka®.

^{Sunpapao et al. (2018}) enfrentaron a C. oryzae contra S. hygroscopicus, T. harzianum y una especie endofítica de Trichoderma (V76-12). Este fue el tratamiento más efectivo para reducir la mancha foliar de plántulas de palma aceitera, con 85.71% de ICM. La formulación de Tonka® consta de tres consorcios de especies: un hongo (T. harzianum), una especie de Bacillus (B. subtilis) y una actinobacteria (S. lydicus). Estos resultados son interesantes, ya que BioFungus Clean® tiene cuatro especies, dos bacterias (B. subtilis y B. thuringiensis) y dos hongos (T. harzianum y T. viride). Esta situación sugiere que es más eficiente una composición más diversa en términos filogenéticos, bioquímicos y ecológicos que un alto número de microorganismos estrechamente relacionados. Esto es coherente con el concepto de suelos supresores, en los que las enfermedades de las plantas no se desarrollan incluso con la presencia de un patógeno vegetal en un huésped susceptible y en condiciones favorables. Los patógenos pueden o no establecerse, persistir, causar poco o ningún daño, o la enfermedad puede manifestarse, pero desaparecer con el tiempo, lo que se atribuye ampliamente a los microbiomas del suelo. La supresión general depende de una gran diversidad y abundancia de microorganismos compitiendo por espacio y recursos, mientras que la supresión específica depende del efecto directo de individuos o grupos de microorganismos sobre el ciclo de vida de un patógeno (^{Raaijmakers y Mazola, 2016}).

La investigación de microorganismos con potencial como ACB es un desafío porque el comportamiento in vitro puede ser prometedor, pero la aplicación en tierras agrícolas da como resultado fluctuaciones en la efectividad. La producción de metabolitos es un fenómeno común en las relaciones antagónicas. Sin embargo, su síntesis conlleva un costo energético que debe ser compensado con los beneficios y que puede ser influenciado por sustancias tóxicas y la proporción de cepas. Por ejemplo, el antagonismo bacteriano aumenta con las similitudes del metabolismo de la fuente de carbono (^{Russel et al., 2017}). Podemos diferenciar los microorganismos en cepas productivas y sensibles que interactúan según la diversidad microbiana y su entorno (^{Kelsic et al., 2015}). La producción de metabolitos y sus procesos relacionados disminuyen la tasa de crecimiento. A pesar de ello, las cepas productivas aumentan frente a las sensibles, incluso con bajas tasas de crecimiento. La fuente de carbono no es un problema cuando las cepas se cultivan in vitro. Sin embargo, en las tierras agrícolas la materia orgánica fluctúa según el tipo de suelo y de su manejo. Asimismo, el uso de fungicidas y bactericidas afecta a los microorganismos nativos. Además de estudiar la diversidad de microorganismos del suelo para desarrollar productos biológicos, otra alternativa es el diseño de comunidades sintéticas de microorganismos “syncoms”. Estos consorcios altamente diversos resultan más cercanos a las comunidades naturales, con mayor complejidad y resiliencia (^{Rábago-Aguilar et al., 2020}).

El presente estudio proporciona los valores de CE₅₀ de cinco biofungicidas contra C. eragrostidis. Los valores de CE₅₀ indican la cantidad de biofungicida requerida para inhibir el 50% del crecimiento fúngico. No existen muchos reportes de la CE₅₀ de productos biológicos o biorracionales contra especies de Curvularia. El presente estudio proporciona estos valores, que son útiles para definir las dosis a evaluar en condiciones in situ. En un estudio previo, ^{Kumar et al. (2020}) evaluaron la actividad antifúngica del aceite esencial de Cedrus deodara contra C. lunata, Alternaria alternata y Bipolaris spicifera, reportando valores de EC₅₀ de 2.22, 3.71 y 4.8 μL/mL para cada hongo, respectivamente. Por su parte, ^{García-Ordaz et al. (2021}) reportaron los valores de CE₅₀ de fungicidas químicos contra C. eragrostidis. Los valores más bajos se registraron con System Cu®, Mancozeb® 80 WP y Tecto® 60 con 0.024, 0.066 y 0.076%, respectivamente. Se deben realizar más estudios para probar la CE₅₀ en condiciones de campo en la producción de piña.

En conclusión, el hongo asociado a la enfermedad de la mancha foliar en plantas de piña correspondió a Curvularia eragrostidis según los análisis morfológicos y moleculares. Tonka® fue el mejor biofungicida contra C. eragrostidis, según la CE₅₀. Mientras que Sedric 4X® logró el mayor% de ICM en la dosis más alta estudiada (1.0%).