Materiales y métodos

Material vegetal. Hojas de guanábana (Annona muricata), gobernadora (Larrea tridentata), y hojasén (Flourensia cernua) se usaron para la extracción de polifenoles. Las hojas de guanábana de la marca “Frutas Nayarit” se adquirieron en un local de Saltillo Coahuila, México, mientras que las hojas de gobernadora y hojasén se recolectaron en el Campo Experimental de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN) en Buenavista, Coahuila, México, posteriormente, se seleccionaron las hojas sanas, eliminando aquellas que tenían daños o malformaciones, así mismo, se desecharon los contaminantes en las muestras. Después, las hojas fueron deshidratadas por 3 días a temperatura ambiente y 24 h en un desecador (NWT-5, Northwest Tchnology^®, Italy). A continuación, la materia prima fue molida en un molino Biobase, modelo MD-120, y el material vegetal en forma de polvo se tamizó utilizando mallas de 850 mm, número 20 (W.S. TAYLER^®) (^{Valdez-Guerrero et al., 2021}).

Preparación de extractos y extracción de fitoquímicos. Para la obtención de los extractos, se empleó agua destilada y mezclas de etanol/agua destilada (70/30 y 30/70), además se emplearon diferentes relaciones (m/v) masa (material vegetal) volumen (cantidad y concentración del solvente), específicamente se usaron las relaciones (m/v), 1:8, 1:12 y 1:16 acorde a la metodología de ^{Valdez-Guerrero et al. (2021}), con modificaciones menores. Las cinco (CA, CB, CC, CD y CE) soluciones producidas de cada material vegetal bajo estas condiciones (Cuadro 1) se colocaron en un reactor de vidrio (1 L) y simultáneamente se aplicaron los procesos ultrasonido y microondas en un equipo Ultrasonic Microwave Cooperative Workstation XO-SM 400, bajo los siguientes parámetros: Ultrasonic (Power Radio - 20, Ultrasonic on Relay - 10, Ultrasonic off Relay -3, Amplitude off Relay - 25 y Set Time - 20) y Microwave (Power Radio - 800, Display power - 0, Set Temp - 70°C y Holding Time - 5). Posteriormente, el extracto se filtró para remover el bagazo.

Purificación y fraccionado de polifenoles. La metodología de ^{Valdez-Guerrero et al. (2021}) se empleó para la separación cromatográfica de los extractos. Primeramente, los extractos se filtraron usando papel Whatman No. 41, después, se separaron mediante cromatografía en columna de intercambio iónico, usando como fase estacionaria 200g de amberlita (Amberlite XAD16N) y como fase móvil agua y etanol 96%. Luego se decantó la muestra en la columna empacada con la resina Amberlita^® XAD 16N (previamente activada con metanol durante 10 minutos) como fase estacionaria y agua (para eliminar compuestos hidrosolubles) y etanol (para recuperar el contenido polifenólico) como eluentes. Cabe mencionar que la columna fue resguardada de la luz para prevenir la fotosensibilidad de los compuestos de interés. La fracción acuosa se desechó una vez que su coloración fue clara, mientras que la fracción etanólica se colectó en un envase ámbar. Una vez obtenida la fracción etanólica, ésta se repartió en refractarios de vidrio, los cuales se secaron a temperatura ambiente (25- 30 °C), sin exponer a la luz durante 3 días. Finalmente se colectó el extracto seco de las cajas, en un frasco ámbar para su posterior análisis. A partir de este paso, los compuestos químicos de cada extracto seco se identificarán como grupo de polifenoles obtenido con alguna de las cinco (CA, CB, CC, CD y CE) soluciones de cada material vegetal (Cuadro 1).

Determinación de polifenoles hidrolizables. Los extractos en polvo se diluyeron en agua a un volumen de 400 µL. Posteriormente, se le agregaron 400 µL del reactivo Folin-Ciocalteu, dejándose reposar por 5 min. Después, se le añadieron 400 µL de Na₂CO₃ 0.01 M, dejándose reaccionar por 5 min. Por último, se le agregaron 2.5 mL de agua destilada y se leyó la solución a 790 nm en el Espectrofotómetro UV-Vis marca Biomate (^{Gómez-Martínez et al., 2020}).

Determinación de polifenoles condensados. En un tubo se añadieron 500 µL de muestra, después se le agregaron 3 mL de HCl-butanol al 10%, agitando muy bien la solución. Posteriormente, se le incorporaron a la solución, 100 µL del reactivo férrico, agitando vigorosamente la mezcla. Los tubos se traspasaron a un baño para someterlos a ebullición durante una hora, asegurándose que los tubos estuvieran perfectamente cerrados. Después, las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente (25-30 ^oC), y finalmente se leyeron a 460 nm en un Espectrofotómetro UV-Vis marca Biomate (^{Gómez-Martínez et al., 2020}).

Identificación de polifenoles. Primeramente, se pesaron 10 mg de cada extracto en polvo y se les disolvió en 1 mL de metanol, luego se sonicó por 5 min a temperatura ambiente, para posteriormente filtrar a través de membranas de 0.45 µm y depositar la muestra en viales para luego colocarlas en un equipo HPLC (marca Varian Prostar, modelo 330 con detector UV-visible de arreglo de diodos), acoplado a un detector de masas (marca Varian, modelo 500-Ms). Se empleó un flujo de 0.2 mL/min, una columna Denali C18 fase reversa (150 mm × 2.1 mm, 3μm, Grace, Albany, OR USA), así como un límite de detección de masas de 100 a 2000 m/z. Todos los experimentos fueron realizados en el modo negativo y [M-H] se empleó nitrógeno como gas nebulizador y helio como gas amortiguador. La fuente de iones tuvo los siguientes parámetros: voltaje de pulverización (5,0 kV), voltaje capilar (90,0 V), y temperatura (350 °C). Los datos fueron recolectados y procesados ​​usando el M.S. Workstation software (V 6.9). Las muestras se analizaron en primer lugar en modo de exploración completa adquirida en el rango m/z 50-2000. Los análisis MS/MS se realizaron en una serie de iones precursores seleccionados. Por último, los compuestos se compararon utilizando una base de datos de compuestos bioactivos (base de datos WorkStation versión 2.0, VARIAN, Palo Alto, CA, EE. UU.).

Aislamiento de hongos fitopatógenos. Los hongos fitopatógenos Fusarium solani y Alternaria alternata se aislaron de plantas enfermas (amarillamiento, encorvamiento de las hojas, roñas, pudrición en tallo y fruto). Del material enfermo, se cortaron trozos de 5 mm de material vegetal, posteriormente se desinfectó con NaClO al 2% por 1 min, después se sumergió en agua destilada estéril por 1 min dos veces, para finalmente colocarlos en cajas Petri con medio PDA (Difco^TM), las cuales se incubaron a 28±2 °C durante 7 días. Después de la germinación de cultivos monospóricos, los hongos con características de A. alternata y F. solani fueron purificados por medio de punta de hifa (^{Morales et al., 2007}). Para la determinación taxonómica de las especies, se realizó observaciones del crecimiento de las colonias fúngicas en el medio de cultivo para determinar la pigmentación, la forma y la velocidad del crecimiento de las colonias, la formación de esporodoquios y el número de septos en los conidios; la presencia de clamidosporas y la forma de conidias (micro y macroconidios). La identificación especifica se realizó bajo microscopio compuesto (10x, 40X y 100x) al observar laminillas con estructuras morfológicas y criterios taxonómicos propios de la especie, empleando las claves taxonómicas de ^{Simmons (2007}) para A. alternata, y de ^{Leslie y Summerell (2006}) para Fusarium solani.

Determinación preliminar de la concentración de polifenoles. Se realizó un ensayo preliminar para determinar el efecto de la concentración (6000, 8000 y 10000 ppm) de dos grupos de polifenoles (CD = m/v (1:8) y EtOH-70%, y CE= m/v (1:12) y EtOH-30%) de Larrea tridentata, sobre la inhibición micelial de Fusarium solani vs tres testigos, 1) sin polifenoles (negativo), 2) EtOH 70% (positivo) y 3) fungicida [Tecto^R 60 al 1%] (positivo). La evaluación se realizó bajo un diseño completamente al azar con tres repeticiones, utilizando cajas Petri de 100 x 20 mm con agar PDA (Difco^TM). A cada caja se le agregó por separado, 500 μL de cada concentración especificada de cada grupo de polifenóles (CD y CE) suspendidos en etanol al 70%, y se incluyeron los tres tratamientos testigo. Los polifenoles se extendieron por toda la superficie del agar con la ayuda de una varilla de vidrio adaptada al tamaño de la caja Petri. Se dejó en reposo durante 30 min, tiempo en el cual los polifenoles se absorbieron en el agar, y en seguida se colocó un disco de 0.5 cm de diámetro con micelio de F. solani (^{Berlanga-Padilla et al., 2011}). Las cajas se sellaron e incubaron a 25 °C, hasta que el micelio creciendo con el testigo negativo, cubrió totalmente la caja. En ese momento se midió el diámetro de la colonia de cada tratamiento (9 tratamientos). La disposición de las cajas de Petri en la incubadora permitió tener un diseño experimental completamente al azar. Dicho diámetro fue convertido a porcentaje de inhibición (ICM), en relación con el testigo 1 por la siguiente expresión matemática (^{Apolonio-Rodríguez et al, 2017}):

Donde dTa y dt representan el diámetro del crecimiento micelial del testigo 1 y de cada uno del resto de los tratamientos, respectivamente.

Después de analizar en el ensayo preliminar el efecto de concentración, se seleccionó la concentración de 8000 ppm para evaluar los grupos de polifenoles (CA, CB, CC, CD y CE) obtenidos de hojasén, gobernadora y guanábana. Las condiciones de siembra y de temperatura fueron similares a las empleadas en el estudio preliminar. Todos los grupos de polifenoles fueron evaluados contra F. solani y A. alternata; y se usaron como testigos para Fusarium 1) sin polifenoles (negativo), 2) EtOH 70% (positivo) y 3) fungicida [Tecto^R 60 al 1%] (positivo). Mientras que para Alternaria como testigo se empleó: 1) sin polifenoles (negativo) y 2) EtOH 70% (positivo). La variable de respuesta fue crecimiento micelial, convertido a porcentaje de inhibición de igual manera por la fórmula señalada anteriormente (ICM).

Análisis estadísticos. Los datos resultantes de todos los bioensayos fueron analizados utilizando el análisis de varianza, y la significancia se determinó con una probabilidad de (p<0.05), cuando fue necesario, las medias de los tratamientos se compararon utilizando la prueba de Tukey. Todos los análisis estadísticos se realizaron usando el software SAS (versión 9.0).

Resultados y discusión

Determinación preliminar de la concentración de polifenoles. El análisis de varianza no mostró diferencias (P< 0.00001) en la inhibición micelial entre las concentraciones dentro de cada uno de los dos grupos de polifenoles (CD y CE) obtenidos de gobernadora. Sin embargo, si se observó que la inhibición del crecimiento micelial fue diferente entre los dos grupos de polifenoles y entre estos grupos y el testigo negativo (Figura 1) (P< 0.00001). Se apreció que la inhibición micelial de Fusarium solani fue mayor cuando se usó el grupo de polifenoles CD (obtenido con una relación de m/v 1:8 y etanol al 70%), el rango de afectación en la respuesta del crecimiento micelial con el grupo de polifenoles CD varió entre 88 - 90 %. En contraste el grupo de polifenoles obtenidos con la relación m/v de 1:12 y etanol al 30% solo inhibió el crecimiento micelial entre 43-50%, mientras que el testigo positivo (Tecto 60® (tiabendazol) al 1%) solo inhibió el crecimiento micelial de F. solani en 27%.

Figura 1 Porcentaje de inhibición del crecimiento de Fusarium solani por diferente concentración (ppm) de polifenoles de gobernadora (Larrea tridentata) obtenidos con diferentes relaciones m/v y concentraciones de etanol, y usando ultrasonido-microondas. Grupos de polifenoles CD obtenido con la relación m/v (1:8) y EtOH-70% y CE obtenido con la relación m/v (1:12) y EtOH-30%. Columnas con la misma letra no son diferentes de acuerdo con la prueba de rango múltiple de Tukey. 

Los resultados muestran que hay actividad biológica de los polifenoles obtenidos de hojas de gobernadora por ultrasonido-microondas contra el hongo F. solani, donde por el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial se formaron 4 grupos: un grupo formado por el testigo negativo (sin polifenoles), otro integrado por el testigo positivo (Tecto 60^® (tiabendazol) al 1%), y otro por los grupos polifenólicos CD y CE, lo cual coincide con lo reportado con ^{Peñuelas-Rubio et al. (2017}), quienes mencionan que el efecto inhibitorio del crecimiento fúngico por los extractos de L. tridentata, puede atribuirse a que las sustancias fenólicas presentes en los extractos, reaccionan con las enzimas fúngicas, volviéndolas catalíticamente inactivas. ^{Farag et al. (2011}), sugieren que los extractos con altas cantidades de polifenoles previenen el desarrollo de F. oxysporum debido a la reducción de los niveles de peroxidación lipídica. Por otra parte, en el presente estudio se apreció la inhibición en el crecimiento fúngico fue mayor con el grupo de polifenoles CD que cuando se usó el grupo CE, esto pude ser debido a la presencia de diferentes compuestos polifenólicos en cada extracto (^{Oufensou et al., 2020}).

Inhibición de Fusarium y Alternaria por polifenoles de gobernadora, hojasén y guanábana. Para Fusarium, el análisis de varianza mostró diferencias en la inhibición micelial de F. solani entre los dos grupos de polifenoles (CD y CE) obtenidos de gobernadora (L. tridentata) vs testigos (negativo y positivo (tecto-60^® y etanol-70%)) (Figura 2a). Se apreció que a 8000 ppm los polifenoles obtenidos con la relación m/v 1:8 y etanol 70% (CD), inhibieron el crecimiento micelial en 90 %, mientras que los polifenoles obtenidos con la relación m/v 1:12 y etanol 30%, y el testigo positivo (Tecto 60^® (tiabendazol) al 1%) solo inhibieron el crecimiento micelial en 50% y 27 %, respectivamente. Los resultados de este estudio coinciden con los reportados por ^{Peñuelas-Rubio et al. (2017}) quienes mencionan que extractos a 500 ppm y obtenidos por el sistema Soxhlet y etanol 70%, inhibieron F. oxysporum en un 98%, sin embargo, en el presente trabajo se necesitaron 8000 ppm de polifenoles para inhibir el crecimiento micelial en 90%, cuando los polifenoles se extrajeron con EtOH-70% y 50% cuando se usó EtOH-30%. En este estudio los polifenoles se extrajeron en 20 minutos usando simultáneamente ultrasonido-microondas, mientras que la extracción empleando Soxhlet tarda al menos 36 horas (^{Sepúlveda-Rincón et al., 2016}).

Figura 2 Inhibición micelial de Fusarium solani por diferentes grupos de polifenoles de a) gobernadora (Larrea tridentata), b) hojasén (Flourensia cernua) y c) guanábana (Anona muricata) a 8000 ppm obtenidos por ultrasonido-microondas vs testigos (negativo y positivo (tecto-60® y etanol-70%). Grupos de polifenoles CA obtenido con la relación m/v (1:16) y EtOH-70%, CB obtenido con la relación m/v (1:16) y EtOH-0%, CC obtenido con la relación m/v (1:8) y EtOH-0%, CD obtenido con la relación m/v (1:8) y EtOH-70%, CE obtenido con la relación m/v (1:12) y EtOH-30%. Columnas con la misma letra dentro de una misma grafica no son diferentes de acuerdo con la prueba de rango múltiple de Tukey. 

Respecto a hojasén (F. cernua), el análisis de varianza mostró diferencias significativas en la inhibición del crecimiento micelial de F. solani entre los diferentes grupos de polifenoles vs el testigo negativo (Figura 2b). Los grupos de polifenoles (CA, CC, CD y CE) inhibieron en una mayor proporción que el testigo positivo (tecto-60^®). Se apreció que los grupos de polifenoles extraídos usando etanol como disolvente (CA, CD y CE) tuvieron mayor efecto inhibitorio en el crecimiento micelial, seguidos por los grupos de polifenoles obtenidos empleando agua (CB y CC). Así mismo, se observó que la eficiencia en la inhibición por los grupos polifenólicos extraidos con etanol, es proporcional a la relación m/v, es decir, los polifenoles con mayor relación m/v promueven más la inhibición fúngica. Mientras que los grupos de polifenoles extraídos con agua inhibieron de manera similar al testigo positivo (Tecto-60^®). En este sentido el grupo de polifenoles que más afectó la inhibición fue el obtenido con etanol al 70% en la relación m/v 1:16 (CA) con un valor superior a 60% de inhibición, seguido de los grupos de polifenoles CE y CD con 46.5 y 42.8%, respectivamente. Los polifenoles obtenidos empleando agua (CC y CB) presentaron un porcentaje de inhibición muy similar al testigo positivo (Tecto-60^®), con valores de 32% y 26 %, respectivamente.

Son escasos los estudios que involucran los extractos de F. cernua contra F. solani y en su mayoría se ha trabajado con F. oxysporum. Por otra parte, el porcentaje de inhibición en el crecimiento micelial observado con los grupos polifenólicos de F. cernua en este estudio, son mayores a lo reportado por ^{Gamboa-Alvarado et al. (2003}), quienes no encontraron ningún efecto inhibitorio del crecimiento de F. oxysporum en ninguna de las concentraciones de 4,000, 8,000, 12,000, 16,000 y 20,000 ppm del extracto. Esto puede ser explicado por el método (extracción Soxhlet) y disolvente (metanol) empleados por Gamboa-Alvarado et al. (2003), quienes utilizaron un sistema de extracción con una duración de 10 días, el cual resulta ser menos eficiente y efectivo que la tecnología de ultrasonido-microondas, que logra la extracción en 20 minutos y con una transferencia de masa más controlada y eficiente. Hay reportes de inhibición completa de Fusarium utilizando extractos de hojasén, sin embargo, estos reportes son contra F. oxysporum (^{Peñuelas et al., 2017}).

Para los grupos polifenólicos de guanábana (A. muricata) a 8000 ppm, el análisis de varianza mostró diferencias significativas entre los tratamientos (Figura 2c). Se apreció que los grupos de polifenoles CA y CB presentaron una mayor inhibición del crecimiento fúngico, el cual fue aún mayor que los testigos positivos (Tecto-60^® y etanol 70%). Además, se observó una mayor inhibición de F. solani con los polifenoles obtenidos con la relación m/v 1:16 sin importar si se obtuvo con etanol o agua. En este sentido, el grupo de compuestos polifenólicos CA promovió la mayor inhibición (43.7%) del crecimiento micelial de F. solani, dicho grupo de polifenoles fue obtenido por la relación m/v (1:16) y EtOH-70%, este efecto fue seguido por los grupos de compuestos polifenólicos CB y CD, con 36 y 27% de inhibición, respectivamente. Los grupos de polifenoles CE y CC, causaron un porcentaje de inhibición inferior al testigo positivo (Tecto-60^®), 23% y 21 %, respectivamente. Aunque, los polifenoles de guanábana mostraron un efecto inhibitorio contra F. solani superior al testigo positivo (Tecto-60^®), no se inhibió más del 50% el crecimiento de este hongo a la concentración de 8000 ppm, por lo que su potencial fungicida podría determinarse a mayores concentraciones (Figura 2c). No fue posible encontrar reportes acerca de las propiedades antifúngicas de polifenoles obtenidos de guanábana contra Fusarium solani, por lo que los resultados obtenidos en este trabajo no se pueden comparar.

Para Alternaría alternata se aplicaron los cinco grupos de polifenóles obtenidos de hojasén (F. cernua) y de guanábana (A. muricata). El análisis de varianza mostró diferencias significativas entre estos grupos de polifenoles vs el testigo negativo (Figura 3 a y 3b). Es decir, los grupos de polifenoles obtenidos a partir de hojasén y de guanábana, afectaron el crecimiento micelial con valores entre 51 y 58% de inhibición, en contraste al testigo negativo. Los resultados de este ensayo fueron inferiores a los reportados por ^{Guerrero et al. (2007}), quienes mencionaron que los extractos de hojasén causaron un 81.6-82.0% de inhibición del crecimiento micelial de A. alternata, sin embargo, estos autores utilizaron solventes como metanol: cloroformo (1:1) y hexano, respectivamente, este último siendo de naturaleza polar y alcalina, características que lo convierten en un solvente muy eficiente, sin embargo también es altamente inflamable, dañino para el ambiente y tiene efectos sobre la salud de quien respire o esté en contacto directo con este compuesto (^{Pan et al., 2017}), esto mismo ocurre con el cloroformo, siendo útil su enlace C-Cl para la polarización y síntesis de moléculas orgánicas y con el metanol, gracias a su capacidad de remover agua de las soluciones en síntesis o en procesos de separación (^{Sridhar et al., 2011}; ^{Ashurst y Nappe, 2022}), siendo los tres compuestos, opciones destacables para la extracción, sin embargo sus inconvenientes a la salud y el ambiente no son comparables con las del etanol y agua, usados en este trabajo, debido a que son baratos, son eficientes en la extracción de compuestos, no representa un daño a las personas o al ambiente, además, el etanol puede ser producido por fermentación, y es altamente volátil (Baümler et al., 2016). ^{Guerrero et al. (2007)}, también reportan una inhibición de 80.3% a 2,000 ppm, utilizando etanol como disolvente de extracción. Las diferencias de estos resultados con los obtenido en el presente estudio, pueden ser explicadas por la metodología de obtención de los extractos, cantidad de moléculas con actividad fungicida, afinidad de los polifenoles con el disolvente empleado, polaridad y tipo de disolvente empleado, temperatura en el proceso de obtención, y formas de recuperación (^{Gómez-Martínez et al., 2020}).

Figura 3 Inhibición micelial de Alternaria alternata por 5 grupos de compuestos polifenólicos a 8000 ppm de a) hojasén (Flourensia cernua) y b) guanábana obtenidos por ultrasonido-microondas. Grupos de polifenoles CA obtenido con la relación m/v (1:16) y EtOH-70%, CB obtenido con la relación m/v (1:16) y EtOH-0%, CC obtenido con la relación m/v (1:8) y EtOH-0%, CD obtenido con la relación m/v (1:8) y EtOH-70%, CE obtenido con la relación m/v (1:12) y EtOH-30%. Columnas con la misma letra dentro de la misma gráfica, no son diferentes de acuerdo con la prueba de rango múltiple de Tukey. 

Con todos los grupos polifenólicos de guanábana (A. muricata) obtenidos mediante ultrasonido-microondas se apreció una inhibición (entre 55 y 61%) del crecimiento micelial de A. alternata en comparación al testigo negativo (Figura 3b). A la fecha, no se encontraron reportes acerca de las propiedades antifúngicas de polifenoles obtenidos de guanábana contra A. alternata. Los valores de inhibición fúngica in vitro observados en este estudio son prometedores (^{Vitola y Pérez, 2016}).

Figura 4 Actividad antifúngica de diversos grupos de compuestos polifenólicos a 8000 ppm obtenidos con diferentes relaciones m/v y porcentaje de etanol contra Fusarium solani y Alternaria alternata. Grupos de polifenoles CA obtenido con la relación m/v (1:16) y EtOH-70%, CB obtenido con la relación m/v (1:16) y EtOH-0%, CC obtenido con la relación m/v (1:8) y EtOH-0%, CD obtenido con la relación m/v (1:8) y EtOH-70%, CE obtenido con la relación m/v (1:12) y EtOH-30%. 

En términos generales, se puede mencionar que la metodología de extracción empleando simultáneamente ultrasonido-microondas es eficiente para obtener compuestos con propiedades antifúngicas al menos para los patógenos Alternaria alternata y Fusarium solani, ya que la inhibición del crecimiento micelial a 8000 ppm superó el 50% en ambos fitopatógenos en contraste al testigo negativo, en este caso, el 16% de los grupos de polifenoles evaluados presentaron una tasa de inhibición superior o igual a 50% en F. solani, y un 90.9% de los grupos de polifenoles presentaron una tasa de inhibición superior o igual a 50% en A. alternata (Figura 4). Lo anterior, significa que solo 3 grupos de polifenoles (CD, CE y CA) a 8000 ppm tienen compuestos polifenólicos con capacidad de inhibición micelial (entre 50-90%) en F. solani, siendo estos los obtenidos de L. tridentata y F. cernua con la relación m/v y disolvente de 1:8 / EtOH-70% (CD) y 1:12 / EtOH-30% (CE) para la primera especie vegetal, y 1:16 / EtOH-70% (CA) para la segunda. Se puede observar que en los tres grupos de polifenoles (CA, CD, y CE) fue usado el etanol como disolvente en 70, 70 y 30 %, respectivamente, sin embargo, las diferencias en la inhibición fúngica pudieran estar asociadas a la cantidad de material vegetal utilizado, ya que en el caso de la gobernadora, los grupos polifenolicos más eficientes fueron aquellos donde se usó el etanol a mayor concentración (70%), y la mayor cantidad de biomasa vegetal (125 g L^-1), y respecto a hojasén, se observó que la mayor eficiencia ocurre inversamente a la biomasa vegetal utilizada, menor biomasa (62.5 g L^-1), mayor efecto inhibitorio (Figura 2). Por otro lado, también se observa que el crecimiento micelial de A. alternata es inhibido por todos los grupos de polifenoles evaluados, sin importar la relación m/v y el tipo de disolvente (Figura 4).

Figura 5 Concentración de polifenoles totales (condensados e hidrosolubles) obtenidos con las diferentes relaciones m/v y porcentaje de etanol; a) Polifenoles de gobernadora, b) Polifenoles de hojasén. 

Las diferentes relaciones m/v y concentraciones de los disolventes empleados en la extracción permitieron obtener cantidad diferentes de polifenoles totales (condensados e hidrosolubles) en mg por gramo de material vegetal. En la Figura 5 se observa que con la relación m/v 1:16 /EtOH-70% (CA) se logró recuperar la mayor proporción de ambos tipos de polifenoles, en ambas especies vegetales. Sin embargo, los grupos de polifenoles de gobernadora que tuvieron el más alto grado de inhibición del crecimiento micelial de F. solani fueron aquellos obtenidos con las relaciones m/v 1:8/EtOH-70% (CD) y 1:12/ EtOH-30% (CE). Mientras que cuando se usó hojasén, la más alta inhibición coincide con uno de los grupos que presento mayor cantidad de polifenoles (CA). Por otro lado, todos los grupos de polifenoles mostraron similar nivel de inhibición en el crecimiento micelial de A. alternata, por lo tanto, no importo la relación m/v y disolvente en el grado de inhibición micelial.

La actividad inhibitoria del crecimiento micelial pude estar dada más por los compuestos polifenólicos presentes en cada grupo que por las cantidades de polifenoles hidrolizables o condensados, la diferencia en el perfil de compuestos polifenólicos encontrados en cada grupo (Cuadros 2 y 3) están dados por la relación m/v, afinidad de los polifenoles con el disolvente empleado, polaridad y tipo de disolvente empleado, temperatura en el proceso de obtención, y formas de recuperación (^{Gómez-Martínez et al., 2020}). En el grupo de polifenoles CD obtenido de gobernadora se observaron mayor número de compuestos polifenólicos, que en el grupo CE; algunos compuestos que están en el grupo CD se han reportado que tienen efecto antimicrobiano o antioxidante como el epirosmanol, el cual es el resultado de la oxidación del ácido carnósico y que posee una alta capacidad antioxidante, además de la detección de moléculas con actividades no solo altamente antioxidantes sino que también antimicrobianas como el rosmadiol (^{Quintana et al., 2019}; ^{Ávila et al., 2011}). También en el grupo de polifenoles CD se encontró apigenina, un compuesto el cual ha sido descrito como uno de los flavonoides más abundantes que poseen una relación positiva entre su consumo y la baja en la mortalidad debido al cáncer de estómago y a que tiene además una actividad antiviral y antibacterial (^{Álvarez y Orallo, 2003}), mientras que, catequina presentan un alto potencial antioxidante y tiene capacidad de entrecruzarse con muchas proteínas, lo que le confiere actividad antimicrobiana, posiblemente dañando los lípidos y proteínas citoplasmáticos microbianos (^{Rahardiyan, 2019}). Además, se ha mencionado la actividad antifúngica de la catequina contra hongos fitopatógenos (^{Istúriz et al., 2019}). Por otra parte, se ha reportado que procianidina C1 tiene capacidad de inhibir el crecimiento microbiano a través de la inhibición de enzimas extracelulares, privación de sustratos microbianos esenciales, desintegración de la membrana externa bacteriana y afectar negativamente el metabolismo microbiano (^{Dasiman et al., 2022}). En la comparación de los grupos de polifenoles CA y CB obtenidos de hojasén, el grupo CA además de contener apigenina también cuenta con ácido rosmarínico el cual tiene capacidad de destruir células y proteínas bacterianas e inhibir la actividad de la Na+/K+ -ATP-asa en las células (^{Zhang et al., 2021}). El grupo de polifenoles CA también contiene nepetin, el cual puede disminuir la virulencia de diversos patógenos al unirse a la proteína caseinolítica peptidasa P (ClpP), mediante la unión de este polifenol a los aminoácidos Ser-22 y Gln-47 de la proteína CLpP (^{Shisong et al., 2022}) y quercetina, el cual es un flavonoide aprobado por la FDA con que cuenta con capacidades antimicrobianas al dañar la membrana celular, modificar la permeabilidad de la membrana, inhibir tanto síntesis de ácidos nucleicos como de proteínas, reducir la expresión de factores de virulencia, inducir disfunción mitocondrial y prevenir la formación de biopelículas (^{Nguyen et al., 2022}). Se ha reportado la actividad de la quercetina contra hongos fitopatógenos como Penicillium expansum (^{Sanzani et al., 2009}). La actividad antifúngica de compuestos polifenólicos ha sido de interés gracias a su baja toxicidad y efímera persistencia en el ambiente, siendo de utilidad en la agricultura orgánica (^{López et al., 2019}).

Conclusiones

En el presente estudio se logró extraer compuestos polifenolicos a partir de hojas de gobernadora, hojasén y guanábana, en muy corto tiempo (20 minutos) utilizando simultáneamente métodos (ultrasonido-microondas) y disolventes (agua y etanol) amigables con el medio ambiente. Dependiendo del material vegetal, la relación m/v, el disolvente y su concentración se lograron extraer diferentes compuestos polifenólicos. El grupo de polifenoles CD extraído de gobernadora mostro niveles de inhibición del crecimiento micelial de F. solani de 90%. Mientras que el crecimiento micelial de Alternaria alternata fue inhibido en un 50-60% por los grupos de polifenoles obtenidos de hojasen y guanábana. En el perfil de grupo de polifenoles CD obtenido de gobernadora se encontraron diversos compuestos polifenólicos reportados por tener actividad antioxidante y antimicrobiana entre los que destacan: epirosmanol, rosmadiol Apigenina, catequina, procianidina C1.