Materiales y métodos

El experimento se realizó en el laboratorio de Parasitología Agrícola, Universidad Autónoma Chapingo, México.

Aislamiento y purificación. Se colectaron raíces y tallos de ocho árboles enfermos de naranja ‘Valencia’ en cuatro fincas ubicadas en el ejido San Pablo, municipio de Papantla, Veracruz, México; en las coordenadas 20° 27’ latitud N y 97° 11’ longitud W, a 45 msnm. En laboratorio, se cortaron trozos de 1 cm de longitud y se desinfestaron en una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto, se enjuagaron dos veces con agua estéril y se secaron con toallas de papel estériles. En condiciones asépticas, se colocaron seis trozos de tejido por muestra en cada caja Petri con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) (200 g papa, 15 g dextrosa, 20 g agar en 1000 mL de agua destilada) y se incubaron a temperatura ambiente por 24 h, bajo un régimen de 12 h luz / 12 h de oscuridad. Para la obtención de aislados puros, se transfirió un fragmento de micelio en el medio de cultivo Agua agar, y después de 24 h se tomaron pequeños trozos de medio que contenían puntas de hifas y se transfirieron en cajas Petri individuales con medio PDA.

Caracterización morfológica. Para identificar la especie de estudio, se usaron tres medios de cultivo estándares establecidos por ^{Leslie y Summerell (2006}), Carnation Leaf-piece Agar (CLA), Spezieller Nährstoffarmer Agar (SNA) y PDA. Se hicieron preparaciones semipermanentes con glicerina al 50% de ocho aislados del hongo y cinco repeticiones por aislado. Las estructuras se examinaron en un microscopio compuesto (Nikon SMZ800^®, EE. UU.) con cámara digital integrada, usando el objetivo de 40x para tomar fotografías, las cuales se analizaron con el programa Motic Imagen v. 3.0 (^{Motic Group, 2018}) para realizar la caracterización cualitativa (forma) y cuantitativa (largo por ancho) de 50 macroconidos, 50 microconidos y 20 clamidosporas por preparación. Los ocho aislados fúngicos presentaron las mismas características morfológicas, en consecuencia, se decidió trabajar con un solo aislado para posteriores estudios.

Prueba de patogenicidad. Para determinar el potencial infectivo del aislado fúngico en cítricos, se inocularon en tres variedades de 14 meses de edad: naranja ‘Valencia’ portainjerto ‘Volkameriano’ (T4), mandarina ‘Delicias’ portainjerto ‘Agrio’ (T5) y naranja ‘Valencia’ portainjerto ‘Agrio’ (T6), con sus respectivos controles negativos T1, T2, T3, con tres repeticiones cada uno, en un diseño experimental completamente al azar. Una vez montado el ensayo en invernadero, se procedió a realizar la inoculación por inmersión de raíces (Güler y Güldür, 2018; ^{Herman y Perl-Treves, 2007}): se extrajeron todas las plantas del sustrato tratando de hacer el menor daño posible; con agua común se lavaron las raíces, se indujeron heridas leves en las raíces con la ayuda de tijeras para crear la vía de ingreso del aislado de Fusarium, posteriormente las raíces de las plantas se colocaron por 24 h en una suspensión de conidios (1 x 10⁶ esporas mL^-1). Los controles negativos se sometieron al mismo método, pero sus raíces se sumergieron en agua estéril. Las plantas se colocaron individualmente en macetas con Peat Moss estéril (PRO-MIX FLEX), se mantuvieron en invernadero con una temperatura diurna y nocturna de 39 ± 2 °C y 15 ± 2 °C, respectivamente y humedad relativa del 40 - 83%. El crecimiento de los brotes vegetativos y la altura de la planta se registraron los días 1, 15, 60 y 110 días después de la inoculación. A los 110 días, se realizó la, purificación y descripción del microorganismo, para comprobar si éste correspondía al aislado de Fusarium sp. previamente inoculado y confirmar su patogenicidad. El aislamiento del hongo en el tejido vegetal se realizó por siembra directa en medio de cultivo PDA, según la metodología propuesta por ^{Leslie y Summerell (2006}), para cumplir con los postulados de Koch.

Prueba de sensibilidad a fungicidas in vitro. Se evaluaron cinco fungicidas a diferentes concentraciones: Clorotalonil (1, 5, 10, 100 y 300 mg L^-1), Benomil (1, 5, 10 y 100 mg L^-1), Tiabendazol (0.1, 1, 5, 10 mg L^-1), Bacillus subtilis (0.005, 0.05, 0.1 y 1 mg L^-1) y Procloraz (1, 5 y 10 mg L^-1), más un testigo negativo que consistió en medio PDA sin fungicida. Cada tratamiento consistió en tres repeticiones y se utilizó un diseño experimental completamente al azar. Para evaluar la eficacia de los fungicidas, se sembraron discos de 5 mm de diámetro de micelio con cinco días de edad en el centro de las cajas Petri con medio de cultivo PDA mezclado con la solución acuosa del fungicida correspondiente. Todas las cajas sembradas se etiquetaron, sellaron e incubaron a temperatura ambiente (26 ± 1 °C) en oscuridad continua, el diámetro del crecimiento micelial se midió cada 48 h, hasta que el testigo negativo cubrió totalmente la caja Petri. El porcentaje de inhibición del crecimiento radial del micelio se calculó con la fórmula de Abbot: (Testigo-Tratamiento)/Testigo x 100 (^{Miranda-Granados et al., 2018}).

Extracción de ADN, PCR y secuenciación. La extracción de ADN se realizó con el kit Plant DNeasy Mini Kit (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la PCR se utilizaron los iniciadores EF1-728F/EF1-986R, que amplifican un fragmento de 320 pares de bases (pb) (^{Carbone y Kohn, 1999}) y la mezcla de reacción se preparó en un volumen final de 50 µL, buffer de PCR IX, 2.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.8 µM de cada oligo, 0.04 U DNA polimerasa (Promega, EE.UU.) y 4 ng de ADN. La PCR se llevó a cabo en un termociclador C-1000 (Bio-Rad, EE.UU.), se realizó una desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, 35 ciclos de 95 °C por 30 s, 54 °C por 30 s, 72 °C por 1 min; y una extensión final de 72 °C por 10 min. Los productos amplificados se verificaron por electroforesis en gel de agarosa al 1%. El gel se analizó con luz ultravioleta con un transiluminador M-26X usando un sistema de imágenes GelDoc-ItTM 300 (UVP, EE.UU.). Los fragmentos amplificados se purificaron mediante el protocolo de DNA clean & concentrator^TM-5 (Zymo Research, EE. UU.). Dichos fragmentos de ADN purificados se mandaron a secuenciar a la empresa Macrogen^®.

Árbol filogenético. Para confirmar la identidad del patógeno, se realizó el ensamble de las secuencias sentido y antisentido con el software MEGA X 10.0.5 (^{Kumar et al., 2018}). La secuencia consenso obtenida se comparó con aquellas registradas en el Basic Local Alignment Search Tools (BLAST) del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Para realizar el árbol filogenético e identificar el clado donde se agrupa la secuencia consenso (Fusarium sp. aislado Veracruz), se descargaron del GenBank las secuencias del factor de elongación de traducción 1 alfa (TEF-1ɑ) del complejo de especies de Fusarium solani, F. oxysporum y F. citricola que afectan al cultivo de cítricos (^{Liu et al., 2020}; ^{Sandoval-Denis et al., 2018}; ^{Yaseen y D’Onghia, 2012}), así como las secuencias que tuvieron mayor similitud con la especie en estudio (Cuadro 1). Se utilizó como grupo externo a la especie Colletotrichum truncatum (KM818513). El alineamiento múltiple de secuencias se realizó con MUSCLE. El árbol filogenético se obtuvo mediante el método de Maximum Likelihood (ML) con 1500 repeticiones de bootstrap, basado en el modelo de Kimura de dos parámetros y distribución gamma. El modelo utilizado se obtuvo mediante una prueba de modelos con el software MEGA X.

Diseño experimental y análisis estadístico. A partir de los datos obtenidos, se realizó un análisis de varianza para las variables de altura de la planta y porcentaje de inhibición en el crecimiento micelial con el diseño experimental completamente al azar, así como una comparación múltiple de medias Tukey (P≤0.05) para variables cuyo efecto fue significativo, en el cual se usó el paquete estadístico SAS 9.0 (^{SAS Institute, 2002}).

Resultados y discusión

Identificación morfológica. Se aislaron ocho aislados, los cuales presentaron un borde circular, micelio de color blanco y anaranjado, con un diámetro de 2.6 cm de tres días de crecimiento en medio PDA. En medio CLA se observaron macroconidios con dos a tres septos, con el lado dorsal más curvo que el ventral y midieron de 16-30 x 3-6 μm. Los microconidios presentaron entre cero y un septo, de forma oval, de 9-17 x 3-5 μm. En medio CLA, las clamidosporas midieron 6-10 x 6-10 μm y se formaron esporodoquios de color amarillo pálido (Figura 2). De acuerdo con las características culturales y morfológicas aquí observadas, los ocho aislados corresponden al género Fusarium (^{Leslie y Summerell, 2006}). Asimismo, los aislados fúngicos presentaron las mismas características morfológicas, en consecuencia, se decidió trabajar con un solo aislado para posteriores estudios.

Prueba de patogenicidad. Diez días después de la inoculación, todas las plantas que estuvieron en contacto con la suspensión de esporas exhibieron síntomas de marchitez en los brotes vegetativos. ^{Sandoval-Denis et al. (2018}) reportaron que Fusarium sarcochroum causa muerte regresiva en ramas de limón y mandarina, en Italia y España. Por otra parte, las plantas inoculadas presentaron escaso crecimiento en el sistema radical y en el haz vascular se observó una coloración marrón o café rojizo oscuro. Lo cual concuerda parcialmente con lo reportado por ^{Hannachi et al. (2015}) quienes observaron una reducción de crecimiento y número limitado de raíces en plantas de cítricos inoculados con Fusarium oxysporum f. sp. citri, tres semanas después de la inoculación. A partir de tejido de raíz con necrosis vascular, se logró aislar el hongo y cumplir con los postulados de Koch (Figura 3).

Los tratamientos no inoculados de naranja ‘Valencia’ portainjerto ‘Volkameriano’ (T1), mandarina ‘Delicias’ portainjerto ‘Agrio’ (T2) y naranja ‘Valencia’ portainjerto ‘Agrio’ (T3), tuvieron una altura de 103 a 112 cm a los 110 días después de la inoculación, mientras que los tratamientos inoculados (T4, T5 y T6) presentaron una altura entre 85 y 93 cm, esto significó una reducción del 16.9 al 17.4% de la altura respecto a los tratamientos no inoculados (Figura 4). De acuerdo con los resultados, se concluyó que el patógeno tiene la capacidad de afectar el crecimiento de los cítricos. Lo cual concuerda con lo reportado por ^{Baysal-Gurel y Cinar (2015}) para árboles de pomelo infectados con F. oxysporum, los cuales mostraron un reducido vigor y clorosis en el follaje.

Figura 2  Fusarium sp. aislado de naranjo ‘Valencia’ (Citrus sinensis). A) Crecimiento de Fusarium sp., en medio SNA, B) en medio CLA, C) en PDA, D) macroconidios, E) microconidios y F) clamidosporas. 

Figura 3 A) Sistema radical de plantas de naranja ‘Valencia’ portainjerto ‘Volkameriano’ no inoculado (izquierda) vs naranja ‘Valencia’ portainjerto ‘Volkameriano’ inoculado con Fusarium sp. (derecha), B) necrosis en el sistema vascular en la planta inoculada, C) recuperación del aislado inoculado en cítricos y D) microconidios del aislado recuperado. 

Prueba de sensibilidad a fungicidas. El análisis de varianza mostró diferencias significativas en los tratamientos. Los tratamientos que inhibieron el crecimiento micelial fueron, tiabendazol, B. subtilis y procloraz (Cuadro 2). Tiabendazol inhibió 100% del crecimiento micelial a partir de 5 mg L^-1. Lo cual es similar a lo reportado por ^{Yossen y Conles (2014}) quienes detectaron con tiabendazol un 99.8% de eficacia en el control de F. oxysporum a 4 mg L^-1 en condiciones in vitro. B. subtilis presentó 100% de inhibición a partir de 1 mg L^-1 y ^{Romero-Velázquez et al. (2015}) encontraron que B. subtilis inhibió 100% a F. oxysporum a partir de 0.01 mg L^-1. La diferencia encontrada en la sensibilidad a B. subtilis en este estudio y la reportada por Romero-Velázquez et al. (2015), puede deberse a las cepas de B. subtilis utilizadas en los estudios, los hongos pertenecen a diferentes especies de Fusarium o el aislado de esta investigación puede presentar resistencia a B. subtilis (^{Bardin et al., 2015}), aunque es preciso realizar más estudios para corroborar dichos supuestos.

Figura 4 Altura de las plantas de cítricos inoculados con Fusarium sp., a los 110 días después de la inoculación. T1, T4: naranja ‘Valencia’ portainjerto ‘Volkameriano’; T2, T5: mandarina ‘Delicias’ portainjerto ‘Agrio’; T3, T6: naranja ‘Valencia’ portainjerto ‘Agrio’. Medias con letras distintas son estadísticamente diferentes (Tukey, P≤ 0.05). 

Estudios similares han encontrado que los aislados de B. subtilis producen sustancias como el amoníaco y ácido indol acético (IAA) que inhiben el crecimiento micelial de F. oxysporum (^{Mohammed et al., 2019}; ^{Sharifi y Ramezani, 2003}). Procloraz inhibió 92% del crecimiento micelial a partir de 10 mg L^-1. Estos resultados concuerdan con lo reportado por ^{Song et al. (2004}), donde encontraron que los fungicidas más efectivos para inhibir el crecimiento micelial de F. oxysporum fueron procloraz y carbendazim. Resultados similares mostraron que procloraz inhibió 100% a F. oxysporum en condiciones in vitro a una concentración de 100 - 1000 mg L^-1 (^{Romero-Velázquez et al., 2015}). Mientras que, en condiciones de campo, ^{Amini y Sidovich (2010}) demostraron que la aplicación de 10 mg L^-1 de bromuconazole y procloraz, redujeron completamente la severidad ocasionada por F. oxysporum f. sp. lycopersici, agente causal de la marchitez vascular en jitomate.

Identificación molecular y árbol filogenético. Búsquedas en BLASTN usando secuencias parciales TEF1 del aislado patogénico, generó 98.7% de similitud con F. polyphialidicum (No. de accesión GQ425229). El árbol filogenético arrojó cuatro linajes altamente contrastantes, de los cuales, tres correspondieron al complejo especies de F. oxyporum, F. citricola y F. solani, actualmente conocidos como agentes patógenos de cítricos (^{Liu et al., 2020}; ^{Sandoval-Denis et al., 2018}; ^{Yaseen y D’Onghia, 2012}). Mientras que el cuarto linaje agrupó a Fusarium sp. aislado Veracruz, F. polyphialidicum y Fusarium cf. concolor (Figura 5).

Figura 5 Árbol filogenético basado en la comparación de las secuencias del TEF-1ɑ de especies de Fusarium . Maximum Likelihood (ML) con 1500 repeticiones de bootstrap, basado en el modelo de Kimura de 2 parámetros y distribución gamma. El aislado de estudio es Fusarium sp. aislado Veracruz. Entre paréntesis se indican los números de acceso de las secuencias registradas en la base de datos del NCBI. 

Conclusiones

De acuerdo con la caracterización morfológica, la identificación molecular y las pruebas de patogenicidad, se confirma a Fusarium sp., posiblemente F. polyphialidicum como agente causal de la marchitez vascular de los cítricos en Papantla, Veracruz. Los síntomas que presentaron los árboles de cítricos infectados fue marchitez de brote apical, retraso de crecimiento, disminución de cantidad de raíces y necrosis del sistema vascular. Las tres variedades de cítricos fueron afectadas por el patógeno. Los fungicidas con mayor eficacia para inhibir el crecimiento micelial fueron tiabendazol (100%), B. subtilis (100%) y procloraz (92%) bajo condiciones in vitro.