Los hongos fitopatógenos han creado mecanismos de resistencia a los fungicidas sintéticos (^{Dooley et al., 2016}) y esto ha generado la búsqueda de nuevos agentes fungicidas. Además, los agentes fungicidas que se aíslan de fuentes naturales son especialmente valiosos (^{Mishra et al., 2010}). Los compuestos que ejercen acción fungicida en un sitio-objetivo son de interés porque afectan los procesos esenciales involucrados en el crecimiento de los hongos, específicamente aquellos que son necesarios para mantener la viabilidad celular del patógeno (^{Arroyo et al., 2016}).

La pared celular del patógeno es uno de los sitios-objetivo porque se trata de una estructura fundamental de la viabilidad y la patogenicidad de los hongos (^{Arroyo et al., 2016}). Los microorganismos antagonistas producen enzimas que degradan los componentes de la pared celular de otros microorganismos (^{Mouyna et al., 2013}). En consecuencia, los agentes que inhiben la síntesis de la pared celular fúngica deben ser muy selectivos (^{Balasubramanian et al., 2012}). La pared celular de los ascomicetos, basidiomicetos, deuteromicetos y algunos oomicetos está compuesta de 1,3-β-glucanos, 1,6-β-glucanasa, quitina y proteínas (^{Kagimura et al., 2015}) ordenados en una estructura multicapa. Los 1,3-β-glucanos son los polisacáridos más abundantes en la pared celular fúngica (^{Gastebois et al., 2010}; ^{Papaspyridi et al., 2018}). La reorganización estructural dinámica de la pared fúngica durante los cambios morfológicos, como el crecimiento celular (ramificación), la división celular y la germinación en hongos filamentosos o en la gemación en la levadura, son eventos morfogenéticos en los que las endo-β-1,3-glucanasas desempeñan un papel esencial en la síntesis de la pared celular (Gastebois et al., 2010; ^{Hartl et al., 2011}). Por todos estos importantes eventos morfogenéticos en los cuales los β-1,3-glucanos de la pared fúngica están implicados, una estrategia para descubrir agentes antifúngicos de origen natural, es la búsqueda de sustancias inhibidoras de endo-β-1,3-glucanasas como un sitio-objetivo específico de los hongos cuyas paredes celulares contienen β-glucanos, específicamente en el enlace β-1,3-glucano (Balasubramanian et al., 2012; ^{Mouyna et al., 2016}). Durante la búsqueda de sustancias antifúngicas en extractos vegetales que inhiben de manera selectiva la síntesis de la pared celular fúngica, con anterioridad se han reportado que los extractos crudos de Turnera diffusa inhiben de manera eficaz la actividad de la endo-1,3-β-glucanasa (^{Vargas-Arispuro et al., 2017}). Por tanto, el presente trabajo se concentró en la identificación de los componentes del extracto crudo de T. diffusa, que tiene un efecto inhibidor de la actividad de la endo-1,3-β-glucanasa. Para lograr este objetivo, se recolectaron hojas y tallos pequeños de T. diffusa (Passifloraceae) de poblaciones naturales en un sitio cercano a Tonichi, Sonora (28° 35’ 56” N, 109° 33’ 56” O).

Las muestras fueron identificadas en el Herbario Botánico de la Universidad de Sonora (México) y se depositó una de las muestras en el herbario. Las hojas y los tallos fueron separados y secados al aire a temperatura ambiente por dos semanas. Una vez seco (500 g de hojas o 300 g de tallos), fueron macerados en metanol (1 L), a temperatura ambiente (25 °C) por 7 días, en obscuridad. Los filtrados de cada extracto fueron evaporados a 40 °C bajo presión reducida (450 mmHg) hasta que se eliminó todo el solvente. El residuo viscoso que se obtuvo se denominó extracto crudo de hojas o extracto crudo de tallos de T. diffusa. El efecto del extracto crudo sobre la actividad de la endo-1,3-β-glucanasa (Trichoderma sp, SIGMA) se determinó utilizando laminarina (Laminaria digitata, SIGMA) mediante el procedimiento acoplado anteriormente descrito por ^{Vargas-Arispuro et al. (2017}). El procedimiento se realizó en 250 μL de una mezcla de reacción preparada con 100 mM de solución amortiguadora de potasio (pH 5.0), 0.5% (w/v) laminarina, 10 μL de endo-β-1,3-glucanasa (0.05 U) y 50 μL de extracto vegetal crudo (3 mg mL^-1) o de compuestos puros (10 y 25 mM). La reacción se corrió durante 40 min a 37 °C y luego se detuvo por ebullición por 5 min. La cantidad de azúcares reductores obtenida se midió con un espectrofotómetro (BioSpec-1601) a 540 nm. También se incluyeron los controles de la enzima y el sustrato. Se utilizó una curva de calibración con glucosa. Una unidad de la actividad enzimática se definió como la cantidad de la enzima que catalizó la liberación de 1 µmol de glucosa equivalente por minuto en las condiciones bajo las cuales se produjo la reacción. Para calcular la actividad de la enzima se utilizó la siguiente ecuación: unidades mL^-1 de enzima = (μM de glucosa liberada) (0.410) / (40)(0.01)(0.01), donde 0.410 es el volumen total de la muestra en mL; 40 es el tiempo de reacción en min; 0.01 es el volumen utilizado de la enzima en mL y 0.01 es el volumen ajustado del colorímetro en mL. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el método Bradford, con albúmina bovina como estándar.

Los compuestos activos en el extracto vegetal fueron purificados mediante técnicas cromatográficas. Para este procedimiento, cada uno de los extractos crudo (100 mg) se disolvió por separado en 5 mL de metanol para su análisis mediante cromatografía de capa fina preparativa (TLC), recubiertas con gel silica fluorescente 60 GF-254 (5 x 20 cm, 250 µm, EM, Science, Alemania) en las que se colocaron muestras de extracto vegetal crudo en metanol, fueron procesadas en diclorometano. La placa TLC se reveló con luz ultravioleta (UV) a 254 nm, y cada banda fue cuidadosamente separada de la placa. Los raspados se disolvieron en metanol, se filtró con papel filtro (Whatman N° 1) y se centrifugaron a 5,000 rpm por 10 min. Los filtrados recuperados fueron evaporados at 40 °C a presión reducida hasta que se eliminó todo el solvente. Una porción de cada fracción fue disuelta (1:1 p/v) en metanol para la evaluación enzimática. La fracción que retuvo los compuestos inhibidores, fue sometida proceso de purificación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (1260 AgilentTechnology, EE. UU), acoplado a un detector de arreglo de diodos (HP-1260, Germany), con una columna Nucleosil 120 C18 (250 x 4 mm, 5 μ, Cronus). La separación por HPLC se realizó utilizando un programa de gradientes con la fase móvil de ácido fórmico al 1% (solvente A) y acetonitrilo al 100% (solvente B) y comenzando con 80% de A en 40 min, 50% de A en 60 min, 10% de A en 80 min y 0% de A en 85 min. La tasa de flujo fue de 0.3 mL min^-1, la detección se llevó a cabo a 254, 280 y 320 nm, y se obtuvieron datos espectrales de 240 a 550 nm. Las subfracciones se recolectaron a 254 nm y se sometieron a un ensayo enzimático. Los compuestos activos se identificaron por comparación de espectro UV de compuestos puros de una base de datos de compuestos fenólicos.

La evaluación antifúngica de ambos extractos vegetales y los compuestos aislados se realizó en esporas de Botrytis cinerea (un hongo aislado de uva, número de accesión AY568636 del GenBank) cultivadas a 25 °C en un medio de papa-dextrosa-agar (PDA, Difco, Sparks, MD, EE. UU.) en cajas Petri de 9 cm de diámetro hasta la esporulación. La suspensión de esporas se preparó agregando 5 mL de agua estéril con 0.01% de Tween 20 a cada caja, y la superficie se raspó ligeramente con una varilla de vidrio para liberar las esporas. La suspensión agua-esporas fue filtrada sobre fibra de vidrio y el filtrado fue centrifugado a 5000 g por 15 min y ajustado a una densidad de 1 x 10⁴ esporas mL^-1, usando un hematocitómetro. El ensayo de germinación de esporas se realizó en tiras de micropocillos (Nalge, Nunc, Naperville, IL, EE. UU.). Con una pipeta, se agregó caldo Sabouraud dextrosa (SDB) (Difco, Sparks, MD, EE. UU.) (900 µL) que contenía fracciones de HPLC (50 y 100 mM) o agua (control) a cada pocillo de una tira de 8 pocillos por tratamiento. Se agregó la suspensión de esporas (100 µL) que contenía ~100±15 esporas de B. cinerea, el contenido de los pocillos se mezcló suavemente, y se incubaron a 25 °C. Las esporas germinadas en cada pocillo se cuantificaron mediante un examen microscópico hasta que las esporas control alcanzaron el 100% de germinación. Los bioensayos se realizaron cuatro veces. Los datos se sometieron a un análisis de varianza de una vía con el software NCSS versión 2007. Las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.01).

El efecto de los extractos vegetales crudos sobre la endo-1,3-β-glucanasa fúngica se muestra en la Figura 1. El extracto de tallos mostró mayor inhibición de la actividad enzimática que el extracto de hojas. Por tanto, se separó el extracto crudo de los tallos, mediante cromatografía de capa fina preparativa, y se obtuvieron cuatro fracciones (Cuadro 1). Después de evaluar el efecto de las fracciones sobre la enzima, se determinó que los compuestos inhibidores de la enzima fueron retenidos en la fracción 2 (Cuadro 1). El efecto inhibitorio de esta fracción contra la endo-1,3-β-glucanasa fúngica mostró el mismo porcentaje de inhibición que el del extracto crudo de los tallos (Figura 1).

Con base en estos resultados, se separaron los compuestos de la fracción 2 mediante HPLC. Quince de los compuestos identificados fueron clasificados como compuestos fenólicos. La evaluación del efecto de cada compuesto aislado sobre la actividad de la endo-1,3-β-glucanasa fúngica reveló que solo dos compuestos, identificados como luteolina y apigenina, evaluados a 25 mM, inhibieron la enzima fúngica en 60 y 89%, respectivamente. Los otros 13 compuestos no tuvieron efecto sobre la actividad de la enzima fúngica (Cuadro 2). La apigenina y la luteolina mostraron efectos inhibitorios sinérgicos sobre la actividad de la enzima, y cuando se evaluaron juntas a la misma concentración mostraron 100% de efecto inhibitorio de la enzima con respecto al control (Cuadro 2). En estudios anteriores se ha reportado que la actividad antifúngica de algunos extractos de plantas se debe al contenido de compuestos inhibidores endógenos de tipo fenólicos (^{Kaushik et al., 2015}); algunos de estos compuestos inhiben la actividad de las celulasas. La endo-1,3-β-glucanasa es miembro de este grupo de enzimas (^{Takeda et al., 2015}; ^{Menget et al., 2016}).

Figura 1. Efecto de los extractos crudos de hojas y tallos de Turnera diffusa en la actividad fúngica de la endo-1,3-β-glucanasa evaluado a 3 mg mL-1, expresado como porcentaje de inhibición con respecto al control (media ± SD, n=6). 

El potencial fungicida de las flavonas se calculó con base en el efecto que produjeron sobre la germinación de esporas de B. cinerea. Los resultados muestran que la apigenina inhibió completamente la germinación de esporas a una concentración de 100 mM, en tanto que la luteolina inhibió 90% de la germinación de esporas a la misma concentración (Figura 2). Estos resultados se correlacionan con el efecto de las flavonas sobre la inhibición de la actividad de la endo-1,3-β-glucanasa fúngica (r= 0.98) (Cuadro 2) y, por tanto, es posible inferir que la apigenina tiene un mayor efecto fungicida que la luteolina. ^{Szewczyk y Zidorn (2014}) y ^{Sarris et al. (2013}) reportaron el aislamiento de apigenina de un extracto de T. diffusa en el que identificaron la apigenina como un compuesto activo que protege contra la ansiedad. Asimismo, ^{Willer et al. (2019}) reportaron que encontraron luteolina y apigenina en 24 compuestos fenólicos aislados de T. diffusa y que la apigenina tenía actividad estrogénica. La apigenina es reconocida en la medicina tradicional y alternativa porque tiene diversas actividades farmacológicas (^{Si et al., 2009}), como la inhibición de la enzima 17-β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (^{Choi y Kim, 2009}; ^{Hasegawa et al., 2013}). No existen reportes publicados sobre el efecto inhibidor de la apigenina en enzimas endo-1,3-β-glucanasa fúngicas; por tanto, el presente trabajo constituye el primer reporte sobre esta actividad. Con base en los resultados de esta investigación, se concluye que el compuesto fenólico de apigenina aislado de extractos de tallos de T. diffusa inhibe la enzima endo-1,3-β-glucanasa fúngica y, en consecuencia, disminuye la germinación de esporas de B. cinerea.

Figura 2. Efecto de la apigenina y luetolina aisladas de Turnera diffusa sobre la germinación de esporas de Botrytis cinerea, expresado como porcentaje de germinación con respecto al control (media ± SD, n=12). Los asteriscos indican diferencias significativas (prueba de Tukey p≤0.1)