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Entre los hongos patógenos que afectan el cultivo de la uva de mesa, destaca Botrytis cinerea Pers.:Fr.[teleomorph: Botryotinia fuckeliana (Bary) Whetz.], ascomiceto causante de la pudrición gris. Este hongo afecta la producción de uva de mesa, tanto en la etapa de pre-cosecha como en post-cosecha, en un amplio rango de condiciones ambientales y de áreas geográficas (Williamson et al., 2007). El desarrollo de la pudrición gris durante la etapa de comercialización de la uva de mesa, afecta el valor de la fruta en el mercado, y es motivo de rechazo en el momento de revisión en las fronteras de los países importadores. Las condiciones de temperatura y humedad durante el transporte y/o almacenamiento en frío, favorecen el desarrollo de B. cinerea, ya que durante estas etapas la fruta alcanza su máxima concentración de azúcar, permitiendo que el hongo crezca vigorosamente, propagándose con facilidad entre los racimos de uva (Lichter et al., 2006). En el Noroeste de México el 90% de la producción de uva de mesa es exportada a mercados de Estados Unido, Europa y Asia. Para poder alcanzar estos mercados, la fruta es enviada en contenedores refrigerados (4±1 °C), tanto por tierra como por mar, debiendo soportar entre 14-25 días de transporte (Vázquez, 2011; Lichter et al., 2008).
El control de la pudrición gris bajo condiciones de transporte y almacenamiento en frío de uva de mesa, es mediante el uso de almohadillas liberadoras de dióxido de azufre (SO2), compuesto gaseoso que se difunde en el espacio del contenedor, impidiendo la germinación de las esporas del hongo (Sanzani et al., 2012). El uso de SO2, ocasiona blanqueamiento de las bayas (Milkota et al., 2010) y puede provocar reacciones de hipersensibilidad en consumidores (Ruiz-Moreno et al., 2015). Por estos motivos y aunado a la importancia comercial de la exportación de uva de mesa, se han hecho esfuerzos por encontrar alternativas al uso de SO2. De las diversas alternativas que se han presentado, las más aceptadas han sido aquellas, donde el componente activo proviene de origen natural (Tripathi et al., 2008). Entre las alternativas naturales, los compuestos de ajo han demostrado tener efecto fungicida (Perelló et al., 2013; Wallock-Richards et al., 2014). Particularmente, se ha atribuido esta bioactividad al compuesto alicina (Curtis et al., 2004), el cual es uno de los componentes más abundantes que se forma cuando el ajo es dañado mecánicamente. Otros compuestos azufrados derivados de ajo que también han demostrado tener efecto antifúngico son dialildisulfuro (DADS) y dialiltrisulfuro (DATS) (Tsao and Yin, 2001; Gándara-Ledezma et al., 2015). Una cualidad que hace atractivo el uso de los compuestos azufrados derivados de ajo, es su característica de ser volátiles, permitiéndoles tener bioactividad en la fase de vapor, facilitando la posibilidad de utilizarlos en forma gaseosa para el control de enfermedades. Este aspecto se hace relevante para la comercialización de la uva de mesa, donde la fruta después de su cosecha no debe entrar en contacto con sustancias líquidas (Codex Stan 255, 2007). En un trabajo previo se encontró que un extracto hidroalcohólico de ajo (EHA) fue capaz de inhibir in vitro la germinación de esporas de B. cinerea, en una magnitud similar a los compuestos alicina y dialiltrisulfuro (Gándara-Ledezma et al., 2015).
Tomando en consideración todos los aspectos antes mencionados, este trabajo se centró en evaluar el efecto de los compuestos volátiles emitidos por un extracto hidroalcohólico de ajo, alicina, dialildisulfuro y dialiltrisulfuro sobre la incidencia de la pudrición gris en racimos de uva de mesa inoculadas con B. cinerea, evaluados a la temperatura de transporte (4 °C) y de comercialización (25 °C).
MATERIALES Y MÉTODOS
Botrytis cinerea Pears
Botrytis cinerea se aisló de uvas infectadas variedad Flame seedless de un campo ubicado en la zona vitícola de Pesqueira, Sonora. La cepa se identificó por las características morfológicas y moleculares, tales como tamaño de los conidios, apariencia de la colonia y por la secuencia del ITS1-5.8S RNA-ITS2 (acceso AY568636). Para su crecimiento se utilizó como medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) y se mantuvo a 25 °C de 7 a 9 días en oscuridad (Tzortzakis et al., 2007). El hongo se resembró tomando un pequeño pedazo de micelio e inoculándolo sobre PDA a 25 °C de 7 a 9 días o hasta que el hongo alcanzó una esporulación suficiente para preparar una solución de 1x106 esporas/mL. La suspensión de esporas se preparó adicionando 5 mL de agua destilada conteniendo 0.01% de Tween 80 al 0.02% sobre la superficie de la placa con el hongo, se raspó con una varilla de vidrio, el líquido conteniendo las esporas del hongo se colectó y filtró sobre gaza para eliminar micelio y el filtrado fue centrifugado a 5000 x g. Las esporas colectadas fueron resuspendidas en agua estéril hasta lograr una concentración de 1x106 esporas/mL cuantificadas con un cámara de Neubauer de acuerdo con la metodología de Moo-Koh et al. (2014).
Extracto hidroalcohólico de ajo (EHA) y sus compuestos derivados azufrados (DADS, DATS y alicina)
El extracto se preparó a partir de ajo de la variedad “regional”, adquirido en el mercado local. Diez gramos de dientes de ajo, se licuaron con 14 mL de agua destilada durante 1 min a temperatura ambiente. El homogenado se centrifugó por 20 minutos a 15 000 x g a 4 °C, se adicionaron 6 mL de etanol al sobrenadante y se centrifugó nuevamente a 8000 x g por 20 min a 4 °C (Jansen et al., 1987). El sobrenadante representó el extracto hidroalcohólico de ajo. Los estándares con pureza por encima del 98% de alicina, dialil disulfuro (DADS) y dialil trisulfuro (DTS) se adquirieron en Neem Biotech (Cardiff, UK).
Evaluación in vitro del efecto de EHA, DADS, DATS y Alicina en el desarrollo de pudrición gris causada por Botrytis cinerea en racimos de uva
Los racimos de uvas de la variedad Flame seedless se recolectaron al momento de la cosecha en viñedos de la región de Pesqueira, Sonora. Los racimos se llevaron a 10 bayas por racimo, asegurándose que no presentaran síntomas visibles de pudrición gris causada por B. cinerea. Los racimos se desinfectaron sumergiéndolos durante 5 min en una solución de hipoclorito de sodio al 2% (v/v), posteriormente se enjuagaron con agua destilada estéril y se dejaron secar sobre papel absorbente a temperatura ambiente. A cada una de las bayas, se les hizo una herida por punción cerca del pedúnculo con un bisturí estéril. Después se asperjó sobre cada racimo 1 mL de la suspensión de 1x106 esporas/mL de B. cinerea preparadas en caldo dextrosa sabouraud (CDS). Los racimos inoculados se colocaron en cámaras de plástico de 50 cm3 (un racimo por cámara). Los racimos de uva se expusieron a los compuestos volátiles emitidos por el EHA, así como a los compuestos puros de DADS, DATS y alicina a las dosis que se muestran en los tratamientos que se presentan en el Cuadro 1. Los compuestos se impregnaron en almohadillas de celulosa (6 x 2 cm) previamente pegadas sobre la tapa de las cámaras. El tratamiento control consistió en la impregnación de una solución de agua-glicerol (1:2 v/v), ya que el glicerol fue utilizado como agente de retención, para controlar la liberación de los volátiles del emisor. Este compuesto fue incorporado a los tratamientos antes de la impregnación al emisor. La incidencia de la enfermedad se cuantificó cada dos días durante un lapso de 14 días, a 4 y 25 °C. Se cuantificaron el número de bayas de cada racimo con presencia de pudrición gris. Los resultados se presentan como incidencia de la enfermedad (porcentaje de bayas infectadas), calculada con la fórmula propuesta por Nally et al. (2012). Se prepararon tres repeticiones por tratamiento y la evaluación se realizó tres veces.
Cuadro 1 Tratamientos utilizados para la evaluación in vitro de la incidencia de pudrición gris en racimos de uva de mesa a 4 y 25 °C.
Evaluación de efecto sinérgico entre DADS, DATS y alicina, en desarrollo de pudrición gris causada por Botrytis cinerea en racimos de uva
Para determinar un posible efecto sinérgico entre los compuestos DADS, DATS y alicina, se preparó una mezcla que contenía 20 µL de cada compuesto y 90 µL de glicerol. La mezcla se homogenizo con agitación suave y se mantuvo sobre baño frío hasta su aplicación sobre el emisor. Los tratamientos aplicados se muestran en el Cuadro 2. Para determinar el efecto de la mezcla de compuestos en la incidencia de la pudrición gris sobre los racimos de uvas, se utilizó el mismo procedimiento descrito para los compuestos independientes.
Diseño experimental y análisis estadístico
Para la evaluación de los compuestos independientes, se aplicó un diseño completamente al azar con 5 tratamientos y tres repeticiones y para la evaluación de la mezcla de compuestos, se aplicó un diseño experimental completamente al azar con 3 tratamientos y tres repeticiones. En ambos experimentos, la unidad experimental fue un racimo de10 bayas, y la variable respuesta fue el número de bayas con presencia de pudrición gris, utilizando la ecuación de Nally et al., 2012, para determinar el porcentaje de incidencia de la enfermedad. Los datos de porcentajes de incidencia de la pudrición gris se transformaron a y = arsin (sqrt (y/100)). Los datos fueron procesados en un análisis de varianza con un factor y en caso de significancia se realizó una comparación de medias con la prueba de Tukey-Kramer (P≤ 0.05) con el programa estadístico NCSS (Number Cruncher Statistical System, 2007).
RESULTADOS
Efecto de EHA, DADS, DATS y Alicina en el desarrollo de pudrición gris causada por Botrytis cinerea en racimos de uva
El efecto de los volátiles emitidos por el extracto hidroalcohólico de ajo y DADS, DATS y alicina sobre el desarrollo de la pudrición gris en racimos de uva de mesa, evaluado durante 14 días después de la aplicación de los tratamientos, se muestra en la Figura 1, donde se observa que los volátiles emitidos por el T2 (EHA), mantuvieron un control sobre el desarrollo de la pudrición gris en las uvas, tanto a 4 °C como a 25 °C. Los tratamientos T3, T4 y T5 evaluados a 25 °C (Figura 1B), solamente el T4, presentó efecto similar (p≤0.05) al EHA sobre el desarrollo de la pudrición gris. Los racimos bajo el tratamiento T3, presentaron un 70% de la incidencia de la pudrición gris y con el T5, la incidencia de la enfermedad se presentó igual (p≤0.05) que el control, alcanzando el 100% al día 10 de los 14 que se mantuvo la evaluación.
El efecto de los tratamientos evaluados a 4 °C mostró que T2, T3 y T4, presentaron un control sobre el desarrollo de la pudrición gris (Figura 1A), y aunque T5 permitió un 10% de la incidencia de la enfermedad, el análisis estadístico resultó igual (p≤0.05) que T2, T4 y T5. Particularmente es destacado el efecto de los tratamientos evaluados a 4 °C, donde los primeros 8 días solamente en el tratamiento T5 se presentó el 5% de la incidencia de la pudrición gris, cuando el control ya presentaba un 30% de la enfermedad.
Figura1. Efecto de los volátiles emitidos por EHA, DADS, DATS y alicina sobre el progreso de la pudrición gris en racimos de uva de mesa, evaluados a 25 y 4 °C, durante 14 días. Los valores son la media de tres repeticiones de 10 bayas cada una. Barras verticales representan la desviación estandar (n=3). Letras iguales no son estadísticamente diferentes entre si de acuerdo con Tukey-Kramer para P≤0.05. El experimento se repitió tres veces.
La eficacia de los tratamientos evaluados para inhibir el desarrollo de la pudrición gris en los racimos de uva de mesa se muestra en el Cuadro 3. Donde se observa que el T2 mostró el mejor control de la enfermedad durante 14 días en ambas temperaturas evaluadas. Seguido por el tratamiento T4 que mantuvo el control de la enfermedad por 8 y 12 días más que el control a 25 y 4 °C, respectivamente.
Efecto sinérgico de una mezcla de DADS, DATS y Alicina en el desarrollo de pudrición gris causada por Botrytis cinerea en racimos de uva
La mezcla de DADS, DATS y alicina presentó un efecto similar (P≤0.05) al EHA en el desarrollo de la pudrición gris en racimos de uva (Figura 2). La evaluación a 4 °C, mostró que tanto el EHA como la mezcla de compuestos, inhibieron por 14 días el desarrollo de la enfermedad (Figura 2A), mientras que la evaluación a 25 °C, mostró que únicamente el EHA mantuvo control del desarrollo de la enfermedad durante los 14 días. La mezcla de DADS, DATS y alicina, presentó 9% de incidencia de pudrición gris al día 10, permaneciendo ese valor hasta el día 14 que se mantuvo la evaluación.
Figura 2 Efecto sinérgico de una mezcla de DADS, DATS y alicina sobre el progreso de la pudrición gris en racimos de uva de mesa, evaluados a 25 y 4 °C, durante 14 días, comparada con el EHA y su control. Barras verticales representan la desviación estandar (n=3). Letras iguales no son estadísticamente diferentes entre si de acuerdo con Tukey- Kramer para P≤0.05.
DISCUSIÓN
Debido al creciente interés por encontrar alternativas de ocurrencia natural al uso de SO2 para el control de la pudrición gris en uva de mesa (Parafati et al., 2015), se planteó la evaluación de los volátiles que emite un extracto de ajo (EHA) y tres de sus principales componentes como DADS, DATS y alicina, (Iciek et al., 2009) en el control de la pudrición gris en uva de mesa. Tanto el EHA como DADS, DATS y alicina, han demostrado ser bioactivos en la fase de vapor (Curtis et al., 2004; Gándara-Ledezma et al., 2015;), facilitando la posibilidad de utilizarlos en forma gaseosa para el control de B. cinerea, causante de la pudrición gris en racimos de uva, donde este fruto, por normas regulatorias para su comercialización, no debe entrar en contacto con sustancias líquidas después de haber sido cosechada (Codex Stan 255, 2007). Varios trabajos se han publicado sobre el efecto antibacteriano y antifúngico de extractos de ajo evaluados en medios líquidos (Harris et al., 2001; Durairaj et al, 2010). Sin embargo, son pocos las publicaciones de evaluaciones en forma volátil de los compuestos del ajo. En trabajos publicado por Curtis et al. (2004) y Gándara-Ledezma et al. (2015), se demostró el potencial antimicrobiano de los derivados de ajo aplicados en forma volátil. En el presente estudio, esos resultados se extienden al control de la pudrición gris, al demostrar que los compuestos volátiles que emite el EHA, DADS y DTS presentaron una marcada reducción de la incidencia de esta enfermedad en racimos de uva de mesa (Cuadro 3, Figura 1). La efectividad del EHA y los compuestos azufrados en reducir la pudrición gris, fue mejor cuando se evaluó a bajas temperatura (4 °C) (Figura 1A), siendo de particular relevancia para el objetivo de este estudio, ya que B. cinerea, se desarrolla vigorosamente a bajas temperaturas (- 0.5 °C) (Lichter et al., 2006), dispersándose con facilidad sobre la uva de mesa durante el transporte y almacenamiento en frío (Crisosto et al., 2012). El efecto de la alicina sobre la incidencia de la pudrición gris, mostró un resultado opuesto en las dos temperaturas evaluadas, presentando un efecto similar al control (p≤0.05) a 25 °C y un efecto similar al tratamiento más efectivo (EHA) (P≤0.05) a 4 °C. Este comportamiento de la alicina puede estar relacionado a la inestabilidad térmica, donde a mayores temperaturas se volatiliza rápidamente al no estar en un medio líquido (Chong et al., 2015), perdiendo su actividad antifúngica, lo cual fue demostrado por Curtis et al. (2004) quienes evaluaron el efecto de la alicina obtenida de un extracto de ajo aplicado de forma volátil sobre bacterias y hongos, observando que la actividad antimicrobiana de la alicina se perdía conforme se incrementaba la temperatura, mientras que a 4 °C la actividad se mantuvo constante. La actividad antifúngica de los extractos de ajo ha estado correlacionada con el contenido de alicina (Singh et al., 2001). Sin embargo, en este trabajo los volátiles de DATS resultaron mejo que alicina en el control de la pudrición gris, donde DATS retrasó el inicio de la enfermedad en 12 días a 4 °C y 8 días a 25 °C (Cuadro 3), y solamente el EHA mantuvo el control de la enfermedad durante 14 días en ambas temperaturas evaluadas (Cuadro 3). La efectividad del EHA se ha atribuido a su contenido de compuestos azufrados (alicina, DADS y DATS) (Fujisawa et al., 2008), los cuales pueden estar actuando de manera sinérgica, como fue posible comprobarlo en este estudio (Figura 2), al evaluar una mezcla de DADS, DATS y alicina, la cual mantuvo control del desarrollo de la pudrición gris en los racimos de uva evaluados a 4 °C, mientras que a 25 °C la reducción de la enfermedad fue del 94% comparada con su control. La mezcla de DADS, DATS y alicina, presentó mejor efecto sobre la incidencia de la enfermedad, que los componentes individuales evaluados a las mismas condiciones de temperatura y concentración (Figuras 1 y 2).
Aunque existen reportes en la literatura de agentes activos para el control de la pudrición gris como el de Muñoz y Moret (2010) y Tripathi et al. (2008), quienes utilizaron quitosano y metil acibenzolar, aceites esenciales, respectivamente, estos compuestos fueron evaluados en medios líquidos y en contacto directo con el hongo. La fortaleza de este estudio es la efectividad en el control de la pudrición gris mostrada por los compuestos derivados de ajo al ser aplicados en forma gaseosa, que de acuerdo con Martinez et al. (2007), los agentes antifúngico, cuando son aplicados en forma gaseosa, presentan menor efectividad que cuando la misma dosis es aplicada en forma líquida. Aun con los buenos resultados obtenidos en la reducción de la incidencia de la pudrición gris en uva de mesa, los compuestos azufrados requieren de mayores evaluaciones para ser propuestos como agentes fungicidas, particularmente, estudios que incluyan diferentes rangos de dosis en pruebas de mayor escala. También son necesarias las evaluaciones organolépticas para asegurar la ausencia de notas de sabor conferidos por los compuestos azufrados a los frutos.
CONCLUSIONES
El dialiltrisulfuro y un extracto hidroalcohólico de ajo emiten volátiles que son capaces de conferir protección a los racimos de uvas contra la pudrición gris causada por B. cinerea durante 14 días evaluados a 4 y 25 °C. Este potencial, abre la posibilidad de su utilización como una alternativa a los fungicidas tradicionales para el control de enfermedades poscosecha.
