Artículos científicos

 

Fusarium mexicanum Agente Causal de la Malformación del Mango en Jalisco, México

 

Fusarium mexicanum Causal Agent of Mango Malformation in Jalisco, México

 

Isaí Betancourt Resendes¹, José Joaquín Velázquez Monreal², Juan Carlos Montero Castro³, Sylvia Patricia Fernández Pavía¹, Héctor Lozoya Saldaña⁴ y Gerardo Rodríguez Alvarado*¹

 

¹ Laboratorio de Patología Vegetal (LabPV), Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (UMSNH), IIAF, km 9.5 Carr. Morelia-Zinapécuaro, Tarímbaro, Michoacán, CP 58880, México. Correspondencia: * gra.labpv@gmail.com

² Campo Experimental Tecomán, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Km. 35 Carr. Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima, CP 28100, México.

³ Facultad de Biología, UMSNH, Cd. Universitaria, Morelia, Michoacán, CP 58060, México.

⁴ Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo, km. 38.5 Carr. México-Texcoco, Chapingo, Edo. de México, CP 56230, México.

 

Recibido: Febrero 08, 2012
Aceptado: Mayo 25, 2012

 

Resumen

La malformación es una de las enfermedades más importantes del mango en el ámbito mundial. Varias especies de Fusarium han sido identificadas como agentes causales de esta enfermedad. Recientemente, una nueva especie, F. mexicanum, fue descrita causando malformación en huertas de mango de la región centro occidente de México; sin embargo, esta especie no ha sido detectada en áreas productoras del Golfo de México. Durante los últimos años, se ha presentado un incremento en las huertas de mango que presentan malformación en Jalisco, un estado localizado al norte del área donde F. mexicanum ha sido detectado. El objetivo de este trabajo fue identificar el patógeno causante de la malformación floral y vegetativa en Jalisco. Análisis morfológico y genético de los genes β tubulina, EF-1 α, e histona H3, mostró que todos los aislados estudiados fueron F. mexicanum. Se confirmó que este patógeno es la especie principal causante de la malformación del mango en los estados localizados en la región del Pacífico central. Análisis filogenéticos mostraron que F. mexicanum pudiera estar presente como poblaciones clonales cuya dispersión pudo haber ocurrido por medio de la comercialización de plantas de vivero contaminadas. F. mangiferae, F. sterilihyphosum y tipo F. subglutinans, especies causantes de la malformación en otros países, no fueron detectadas en este estudio.

Palabras clave: cultivos tropicales, enfermedades fungosas, M. indica.

 

Abstract

Malformation is one of the most important diseases of mango worldwide. Several Fusarium species have been identified as causal agents of this disease. Recently, a new species, F. mexicanum, was described causing malformation in mango orchards located in the central western region of Mexico; however, it was not detected in producing areas along the Gulf of Mexico. During the last years, there has been an increase in mango orchards presenting malformation in Jalisco, a state located north of the area where F. mexicanum has been detected. The objective of this work was to identify the pathogen causing floral and vegetative malformation in Jalisco. Morphological and genetic analyses of the genes β tubulin, EF-1 α, and histone H3, indicated that all the isolates studied were F. mexicanum. This pathogen is confirmed as the main species causing mango malformation in those states located along the central Pacific region. Phylogenetic analysis showed that F. mexicanum may be present as clonal populations whose dispersal could have occurred through commercialization of contaminated plants from nurseries. F. mangiferae, F. sterilihyphosum and F. subglutinans type, species causing malformation in other countries, were not detected in this study.

Keywords: fruit crops, fungal diseases, M. indica.

 

El mango (Mangifera indica L.) es uno de los principales cultivos frutícolas en México. La producción en 2011 fue de 1,536,654.28 t de fruta. En México, Guerrero fue el mayor productor en el 2011, con 329,939 t. Los estados de Chiapas, Michoacán, Nayarit, Oaxaca, Sinaloa y Veracruz, obtienen cada uno más de 100,000 t por año. La superficie cultivada de mango en Jalisco es de 6,165 ha, las cuales generaron 56,552 t durante el 2011 (SIAP, 2013).

La enfermedad malformación ocurre en la mayoría de las áreas productoras de mango y es considerada como la enfermedad más importante de este cultivo en el ámbito mundial (Kumar y Beniwal, 1992; Ploetz, 2007). Los síntomas característicos de la enfermedad incluyen la malformación de tejido floral y vegetativo. Los brotes malformados de las yemas apical y laterales presentan entrenudos acortados, y hojas pequeñas, quebradizas y angostas. Las inflorescencias malformadas presentan ejes primarios y secundarios muy ramificados, acortados y engrosados. El número de flores se incrementa dramáticamente, y son más grandes de lo normal. La malformación floral incrementa el número de flores masculinas, y las flores hermafroditas son estériles, o si son fertilizadas, posteriormente son abortadas (Ploetz, 2003).

Investigadores en India llevaron a cabo los postulados de Koch hace más de cuarenta años, demostrando que un hongo causaba la malformación del mango. El patógeno causante de ambas formas de malformación, floral y vegetativa, fue inicialmente identificado como F. moniliforme (Sin. F. verticillioides) Sheld. (Summanwar et al., 1966; Varma et al., 1974), posteriormente se le denominó F. moniliforme Sheldon var. subglutinans Wollenweb. y Reinking; y finalmente F. subglutinans (Wollwnweb. y Reinking) Nelson, Toussoun and Marasas (Ploetz y Freeman, 2009). Estudios en otras regiones productoras de mango confirmaron a un tipo de F. subglutinans como el ón en Egipto (Ibrahim et al., 1975), E.E.U.U. (Ploetz y Gregory, 1993), Israel (Freeman et al., 1999) y África del Sur (Manicom, 1989).

Britz et al. (2002) analizaron la morfología de cepas de Fusarium de árboles malformados en varias áreas productoras en el mundo, y determinaron la existencia de tres grupos diferentes. Información adicional de las secuencias de los genes histona H3 y β-tubulina para dos de esos grupos, indicaron que eran filogenéticamente distintos (Steenkamp et al., 2000). En base a los datos de morfología y filogenia, Britz et al. (2002) establecieron dos especies nuevas para los aislados de Fusarium asociados con la malformación del mango. La especie de 29 cepas de Egipto, Florida, Israel, Malasia y África del Sur correspondía a F. mangiferae Britz, Wingfield y Marasas. Este grupo de cepas es conspecífico con aislados que habían demostrado causar la malformación del mango (Steenkamp et al., 2000). La especie F. sterilihyphosum Britz, Marasas y Wingfield fue establecida inicialmente para los aislados asociados con la malformación del mango en África del Sur. Posteriormente, se demostró que F. sterilihyphosum estaba presente en Brasil (Zheng y Ploetz, 2002). Un grupo adicional morfológicamente diferente estaba presente en Malasia; sin embargo, no hay información filogenética ni de patogenicidad para este grupo (Britz et al., 2002). En China, F. proliferatum ha sido detectado causando malformación del mango (Zhan et al., 2010). Últimamente, F. mangiferae también ha sido reportado en China (Zhan et al., 2012) y España (Crespo et al., 2012). Adicionalmente, un linaje llamado F. tupiense ha sido reportado causando malformación del mango en Brasil y Senegal (Lima et al., 2009, 2012; Senghor et al., 2012). Análisis genético usando AFLPs y grupos de compatibilidad vegetativa de los aislados obtenidos en varias áreas productoras de mango en Brasil, detectaron la presencia de seis grupos genéticos, indicando una población diversa, genéticamente y geográficamente, la cual podría estarse reproduciendo clonalmente (Lima et al., 2009). Aunque hay numerosos estudios sobre esta enfermedad, aun se carece de información sobre la morfología, compatibilidad sexual, patogenicidad y toxigenicidad de las especies de Fusarium asociadas con la malformación del mango (Marasas et al., 2006).

La malformación del mango también es un problema en huertas de mango en México; sin embargo, en los estados de Guerrero y Michoacán causa los daños más severos (Noriega, 1996; Noriega-Cantú et al., 1999; Vega-Piña y Miranda-Salcedo, 1993; Mora-Aguilera et al., 2003). En México, F. oxysporum ha sido reportado como el agente causal de la malformación de mango en Michoacán y Morelos, y F. subglutinans en Guerrero y Michoacán (Díaz y Romero-Cova, 1980; Vega-Piña y Miranda-Salcedo, 1993; Noriega, 1996; Noriega-Cantú et al., 1999). Recientemente, un taxón nuevo de Fusarium causando malformación del mango fue detectado en Colima, Guerrero, Michoacán y Morelos, México (Rodríguez-Alvarado et al., 2008; Otero-Colina et al., 2010). Este taxón es similar morfológicamente a F. sterilihyphosum; sin embargo, es filogenéticamente distinto de cualquier otro taxón de Fusarium descrito previamente causando la malformación del mango. El nombre de F. mexicanum Aoki, Freeman, Otero-Colina, Rodríguez-Alvarado, Fernández-Pavía, Ploetz y O'Donnell, sp. nov., ha sido asignado a este taxón nuevo (Otero-Colina et al., 2010; Rodríguez-Alvarado et al., 2013). Aun cuando se han realizado estudios sobre manejo integrado de esta enfermedad en México (Vega-Piña et al., 2004), continúa causando pérdidas económicas en las diferentes áreas productivas del país. En años recientes, ha habido un incremento en el número de árboles de mango afectados por esta enfermedad en varias áreas productoras en Jalisco. Determinar si F. mexicanum tiene una distribución más amplia en México que lo reportado previamente (Otero-Colina et al., 2010), y si otros taxones de Fusarium están involucrados con la malformación del mango en más áreas productoras, es importante para entender mejor a estos patógenos y los mecanismos por los cuales son diseminados. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue identificar las especies de Fusarium causando malformación del mango en huertos comerciales en Jalisco, un estado ubicado en la región productora de mango del centro occidente en México.

 

MATERIALES Y METODOS

Aislados de Fusarium. Quince muestras de tejido malformado floral y vegetativo de cinco árboles de mango del cultivar Tommy Atkins, fueron colectados en una huerta localizada en el municipio de La Huerta, Jalisco, durante mayo del 2007 (19.485°, -104.643333°). Tres panículas malformadas fueron muestreadas por cada árbol. La incidencia de la enfermedad en la huerta fue aproximadamente del 10 %. Las muestras fueron colocadas en bolsas de papel en una hielera de unicel y fueron enviadas durante la noche al Laboratorio de Patología Vegetal (UMSNH) en Morelia, Michoacán. En el laboratorio, las muestras vegetales fueron lavadas con detergente y enjuagadas con agua de la llave para remover insectos y suelo. Secciones pequeñas de tejido malformado fueron cortadas, desinfectadas superficialmente con hipoclorito de sodio al 10 % (Clorox, E.E.U.U.) por 5 min y enjuagadas tres veces con agua destilada estéril. El exceso de agua fue removido con toallas de papel estéril. Diez explantos de tejido por muestra fueron sembrados en cajas con PDA fresco a la mitad de la concentración (20 g agar, y 10 g dextrosa, disueltos en el líquido obtenido de la cocción de 125 g de papas blancas, y aforado a un litro con agua destilada) e incubados a 25 ^oC. El medio PDA contenía Ampicilina 0.27 g/L y Rifampicina 0.01 g/L. Puntas de hifas que emergieron de los explantos y crecieron en el medio, fueron transferidas a cajas que contenían medio Spezieller Nährstoffarmer Agar (SNA) y dos pedazos de papel filtro estéril, de 0.5 cm² (Whatman, E.E.U.U.) para inducir la esporulación (Leslie y Summerell, 2006).

Cultivos monospóricos y su preservación. Se obtuvieron cultivos monospóricos para todos los aislados que crecieron en medio SNA. Dos discos de 0.5 mm² de medio y micelio de cada uno de los aislados fueron colocados en tubos de vidrio de 10 mL que contenían 3 mL de agua destilada estéril. Los tubos fueron agitados brevemente para separar los conidios del micelio, se tomaron 30 µL de una suspensión de conidios y se dispersó en cajas que contenían agar agua al 2 %. Las cajas fueron incubadas a 25 ^oC en la oscuridad por 20 h. Los conidios germinados fueron observados con un microscopio estereoscópico, y se transfirieron individualmente a cajas con SNA y papel estéril, e incubadas bajo luz fluorescente fría y blanca con periodos de 12 h luz y oscuridad a 25 ^oC. Una vez que los cultivos cubrieron la mayor parte del medio en la caja, se agregaron 3 mL de glicerol estéril al 25 % para remover los conidios del micelio. Un mL de la suspensión de conidios se transfirió a cada uno de tres tubos criogénicos de 2 mL y se almacenaron a -70 ^oC. Todos los experimentos se empezaron usando alícuotas de las suspensiones de conidios almacenados en glicerol de cada aislado. Los cultivos fueron depositados en la Colección de Hongos del Laboratorio de Patología Vegetal, UMSNH.

Caracterización cultural y morfológica. Los aislados fueron incubados en cajas con PDA fresco (20 g agar y 20 g dextrosa, disueltos en el líquido obtenido de la cocción de 125 g de papas blancas, aforado a un litro con agua destilada) y en medio CLA (hojas de clave en agar agua al 2 %) (Leslie and Summerell, 2006) para estimular el desarrollo de los cultivos y los conidios. Los cultivos fueron incubados bajo las condiciones de luz mencionadas anteriormente. Después de 10 a 14 d de incubación los siguientes caracteres morfológicos fueron analizados: color, tipo de micelio, forma y tamaño, y número de septos de los macroconidios y microconidios, presencia de mono y/o polifialides, presencia de clamidosporas e hifas enrolladas estériles. Se tomaron mediciones de los caracteres morfológicos de 25 macroconidios y 25 microconidios, calculando rangos y valores de medias (Leslie and Summerell, 2006).

Pruebas de patogenicidad. Los aislados MXJAL-2, MXJAL-8 y MXJAL-11 fueron crecidos en cajas con CLA bajo luz blanca y negra a 25 ^oC por 15 d. Los conidios fueron colectados con agua estéril y diluidos a 2 x 10⁷ conidios por mL. La suspensión conidial fue usada para inocular yemas apicales y laterales en dormancia, de plantas de mango injertadas de dos años de edad, cultivar Haden, mantenidas en macetas de 50 cm de diámetro, en una área sombreada. Las inoculaciones de las suspensiones de conidios se llevaron a cabo de acuerdo a Freeman et al. (1999).

Obtención de ADN. ADN fue obtenido usando un método de extracción sin usar solventes desarrollado por Mahuku (2004), con modificaciones. Quince µL de una suspensión de conidios en glicerol al 25 %, fueron inoculados en un matraz de 250 mL que contenía 100 mL de medio mínimo (Leslie and Summerell, 2006). Los cultivos fueron incubados a 25 ^oC por 10 d para obtener micelio. Los cultivos fueron filtrados a través de tela Miracloth (Calbiochem, E.E.U.U.) estéril, el micelio se enjuagó con 200 mL de agua destilada estéril, se drenó y dejó secar toda la noche a 4 ^oC. El micelio seco se molió en un mortero estéril con nitrógeno líquido y se transfirió a tubos de 1.7 mL, se almacenó a -20 ^oC hasta que se procesó. Quinientos µL de buffer de extracción TES (Tris-HCl 0.2 M [pH 8], EDTA 10 mM [pH 8], NaCl 0.5 M, SDS 1 %) y 1.25 µL de Proteinasa K (200 mg/mL) (Sigma, E.E.U.U.) se agregaron a cada tubo, se agitaron en un Vortex por 30 seg y se incubaron en un baño de agua a 65 ^oC por 30 min. Para precipitar las proteínas se agregaron 250 µL de acetato de amonio a cada tubo, se incubaron en hielo por 10 min, y se centrifugaron en una microcentrífuga (Eppendorf, E.E.U.U.) a velocidad máxima, a 4 ^oC por 15 min. El sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo, los ácidos nucleicos fueron precipitados agregando un volumen de isopropanol e incubados toda la noche a -20 ^oC. Los tubos fueron centrifugados como se mencionó, las pastillas fueron lavadas con 800 µL de etanol frío al 70 % y se secaron. Para remover los polisacáridos presentes en las muestras, el ADN fue eluido dos veces con extracciones repetidas usando 250 µL de TE (Tris-HCl 10 mM [pH 8], EDTA1 mM), cada vez se centrifugó a la velocidad máxima por 15 min para evitar los polisacáridos que estaban en el fondo del tubo. La solución de ADN fue transferida a un tubo nuevo que se mantuvo en hielo. Cinco µL de RNasa A (20 mg/mL) (Sigma, E.E.U.U.) se agregaron a la solución de ADN y se incubó a 37 ^oC por 60 min. El ADN se recuperó como se describió usando acetato de amonio e isopropanol. Las pastillas de ADN fueron resuspendidas con 50 µL de TE y se almacenaron a -20 ^oC.

PCR y secuenciación del ADN. Porciones de los genes nucleares factor de elongación de la traducción (EF-1 a, 15 aislados), β-tubulina (6 aislados), e histona H3 (5 aislados), fueron amplificados por PCR y secuenciados, para los aislados de Fusarium como se describió previamente (O'Donnell et al., 1998). Las secuencias de los oligonucleótidos del gen factor de elongación 1 alfa fueron EF-1 (ATGGGTAAGGARGACAAGAC) y EF-2 (GGARGTACCAGTG/CATCATGTT) (O'Donnell et al., 1998); para β -tubulina fueron T1 (AACATGCGTGAGATTGTAAGT) y T22 (TCTGGATGTTGTTGGAATCC) (O'Donnell et al., 2000a); y para el gen histona H3 fueron H3-1a (ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG) y H3 -1 b (GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT) (Glass and Donaldson, 1995). Las secuencias de nucleótidos que se obtuvieron en este trabajo fueron depositadas en GenBank con los números de accesión de JN176078 a JN176092 para el gen EF-1 α, de JN603664 a JN603669 para el gen histona H3, y de JN650539 a JN650543, y KC517069 para el gen β-tubulina. Cada reacción de PCR contenía 12.5 µL de PCR Master Mix (Promega ®, E.E.U.U.), 5 µM de cada uno de los oligonucleótidos, 5 µL de ADN (dilución al 10 %) y agua desionizada a un volumen final de 25 µL. Las condiciones de PCR en el termociclador (Eppendorf, Mastercycler Gradient, E.E.U.U.) fueron un ciclo inicial de desnaturalización a 95 ^oC por 4 min seguido por 35 ciclos de 95 ^oC por 1 min, 55 ^oC por 1 min y 72 ^oC por 2 min. Un paso final de elongación a 72 ^oC por 10 min finalizó las reacciones. El ADN amplificado en las reacciones de PCR fue purificado usando un kit comercial (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega, E.E.U.U.). Los productos de las amplificaciones fueron analizados en geles de agarosa al 1.5 % a 50 Volts por 90 min, teñidos con bromuro de etidio 0.5 µg/mL y fotografiados con un sistema Kodak DAS 290 (Eastman Kodak, E.E.U.U.). Las secuencias del ADN amplificado fueron obtenidas a través de una compañía comercial (Macrogen, Seúl, Corea del Sur).

Blast y análisis filogenético. Las secuencias consenso para todas las regiones amplificadas de cada aislado fueron obtenidas usando Pregap y Gap (Staden Package, 2002). Las secuencias fueron editadas manualmente en Gap y alineadas con otras secuencias de Fusarium usando el programa Mega 5.0 (Tamura et al., 2011), y posteriormente usadas en el programa BLASTN 2.2.25+ (Zhang et al., 2000) para determinar la identidad de los taxones en base a la similitud entre las secuencias, expresado como porcentaje de identidad de las secuencias.

Para confirmar los resultados del análisis Blast, se llevó a cabo un estudio filogenético usando las secuencias de los genes EF-1 α y β-tubulina. Solamente se utilizaron secuencias de esos genes para este estudio porque los datos preliminares mostraron una estructura filogenética adecuada para el objetivo de esta investigación (Cuadro 1). Además, las pocas secuencias de histona obtenidas mostraron bajo polimorfismo lo cual no habría producido un cambio sustancial en los resultados presentados en este estudio.

Como grupos externos se incluyeron secuencias de Fusarium de otros estudios (Cuadro 1). El alineamiento de secuencias se realizó con BIOEDIT (Hall, 2011). Las secuencias de diferentes regiones fueron fusionadas en una única matriz y de esa forma evaluada con análisis filogenéticos de parsimonia, bootstrap (PAUP* versión 4.0b; Swofford, 2002) y bayesianos (MrBayes 3.2; Ronquist et al., 2012). El análisis de parsimonia máxima se realizó con 3,000 repeticiones de adición al azar. El análisis bootstrap para estimar la estabilidad de los clados fue del tipo no paramétrico, usando una búsqueda heurística de 500 réplicas. Para seleccionar el modelo de evolución molecular se empleó jModelTest 2 (Darriba et al., 2012). El análisis bayesiano se realizó con 7,000,000 generaciones. El largo de las ramas se calculó como el promedio de las tasas de cambio de cada brazo de los árboles con mayores probabilidades posteriores.

 

RESULTADOS Y DISCUSION

Análisis cultural y morfológico. Tres tipos de colonias de hongos fueron observadas creciendo de los explantos en las cajas de cultivo dos días después de sembrarlas. Un tipo presentaba colonias creciendo sobre los explantos el cual correspondía típicamente a hongos contaminantes tales como Aspergillus y Penicillium. Un segundo tipo correspondía a un hongo de crecimiento rápido con micelio blanco y ausencia de estructuras reproductivas. El tercer tipo de colonias presentaba hifas largas con esporodoquios o conidióforos aéreos. Esas hifas producían abundantes macroconidios y micronidios en fiálides cortas típicas del género Fusarium. Esta es una característica importante para distinguir cepas de Fusarium asociadas con la malformación del mango durante los procedimientos de aislamiento (Rodríguez-Alvarado et al., 2008). Aproximadamente el 90 % de las colonias obtenidas de los diez explantos de cada muestra fueron del tercer tipo. Un aislado de cada muestra fue seleccionado para su posterior caracterización. Cultivos monospóricos de esos aislados produjeron micelio aéreo densamente flocoso, blanco, rosado blanco a violeta blanco en PDA. Las colonias produjeron pigmentación en el medio parcialmente oscura a violeta oscuro. Las clamidosporas no fueron observadas en los medios utilizados. En CLA los macroconidios presentaron de tres a cinco células, eran fusiformes, rectos a ligeramente curvos y mostraron una longitud promedio de 46.0 (µm y un rango de 35.4 - 57.8 µm. Los microconidios estaban en falsas cabezas en mono y polifialides, la mayoría sin septos y clavados a elipsoidales, mostraron una longitud promedio de 10.5 µm y un rango de of 7.9 - 14 µm. Las características culturales y morfológicas concuerdan con las observadas para F. mexicanum, un nuevo taxón descrito causando malformación del mango en Michoacán (Rodríguez-Alvarado et al., 2008; Otero-Colina et al., 2010). La variación detectada en F. mexicanum con respecto al tamaño del macroconidio (21.5 - 62 x 1.5 - 5 µm) dependía si el conidio era formado en conidióforos aéreos o en esporodoquios (Otero-Colina et al., 2010). F. oxysporum o tipos de F. subglutinans no fueron detectados entre los aislados obtenidos.

Las hifas enrolladas estériles son producidas por algunas de las especies de Fusarium que causan la malformación del mango, incluyendo a F. sterilihyphosum (Britz et al., 2002), F. mexicanum de Michoacán (Rodríguez-Alvarado et al., 2008) y Fusarium sp. de Brasil (Lima et al., 2009). Sin embargo, las hifas enrolladas estériles no fueron detectadas en algunos de los aislados de F. mexicanum analizados previamente (Otero-Colina et al., 2010). La formación de esta característica morfológica también es presentada por F. circinatum Nirenberg and O'Donnell emend. Britz, Coutinho, Wingfield and Marasas y F. pseudocircinatum O'Donnell and Nirenberg (Leslie and Summerell, 2006). Los quince aislados analizados en este estudio no mostraron la presencia de hifas enrolladas en CLA. Existe la posibilidad de que las hifas enrolladas pudieran ser producidas por estos aislados en otro medio. Las condiciones culturales tales como luz y temperatura pueden influir en la formación y variación en forma y tamaño de las estructuras morfológicas (Leslie and Summerell, 2006).

Pruebas de patogenicidad. Síntomas de malformación floral fueron producidos cinco semanas después de inocular plantas de mango separadamente con tres aislados de Fusarium sp., MXJAL-2, MXJAL-8 and MXJAL-11 (Figura 1). Las plantas inoculadas con MXJAL-8 mostraron malformación vegetativa ocho semanas después de las inoculaciones (Figura 1). Las cepas inoculadas fueron re-aisladas de los tejidos malformados, floral y vegetativo. Las plantas control inoculadas con agua no mostraron síntomas de malformación y Fusarium no fue aislado de esas panículas (Figura 1).

Análisis del ADN - Blast. Los quince aislados de Jalisco fueron divididos en dos grupos en base principalmente en las secuencias obtenidas del gen EF-1 α, al presentar bases diferentes en tres posiciones. Las secuencias de cada grupo mostró 100 % de similitud con secuencias de diversos aislados de F. mexicanum obtenidos en los estados de Michoacán y Morelos, México (Otero-Colina et al., 2010). Las secuencias de buena calidad para el gen de β-tubulina presentaron 100 % de similitud con secuencias de varios aislados de F. mexicanum obtenidos en los estados de Colima, Guerrero y Michoacán (Otero-Colina et al., 2010). Las secuencias para la región de histona H3 de los aislados varió en una posición. Similarmente a los resultados obtenidos para el gen factor de elongación, todos los aislados mostraron 100 % de similitud con secuencias de aislados de F. mexicanum obtenidos en el estado de Michoacán, México (Otero-Colina et al., 2010).

Análisis filogenético. El alineamiento de EF-1 α fue de 646 posiciones con 6 gaps informativos, mientras que el de β-tubulina fue de 513 posiciones con un gap. El modelo de sustitución nucleotídica que mejor ajustó a EF-1 α fue el GTR (Rodriguez et al., 1990), en cambio para la β-tubulina ajustó mejor el HKY (Hasegawa et al., 1985). El análisis de parsimonia de los datos combinados produjo 46 árboles de máxima parsimonia, con índice de consistencia de 90 y de retención de 91. El consenso estricto de estos árboles retiene 12 clados, en cambio el análisis bayesiano conserva 14 agrupamientos. En la Figura 2 se presentan las agrupaciones resueltas por ambos análisis. Todas las muestras de aislados de Jalisco y los Fusarium mexicanum se encontraron como un grupo monofilético (96 % bootstrap, 100 % probabilidad posterior), mostrando dos agrupamientos internos adicionales. Cercanamente relacionados al clado Mexicano están los aislados de Fusarium sp. NRRL 25346 del Perú y el NRRL 26756 de África del Sur. Otro grupo monofilético incluye a todos los Fusarium sp. de Brasil y los F. sterilihyphosum (100 % bootstrap, 100 % probabilidad posterior), a su vez agrupados en sus respectivos linajes. Los grupos antes mencionados conforman un gran clado que excluye a F. magiferaey demás grupos externos (Figura 2).

La combinación de las secuencias brinda una resolución aceptable de las relaciones, como se esperaba con base en los resultados de otros estudios (O'Donnell et al., 2000b; Lima et al., 2009). Las relaciones cercanas de los aislados de Fusarium de Jalisco y de F. mexicanum que ha sido demostrada en el análisis cultural y morfológico en este estudio, es confirmada con la obtención del clado que los unen con altos valores de apoyo estadístico, proveyendo evidencia sólida de su monofilia. La estructura adicional encontrada en esta agrupación no produce agrupamientos exclusivos de los aislamientos de Jalisco o de F. mexicanum, por lo que no se puede argumentar que son especies diferentes. En cambio, esto podría indicar que están ocurriendo cambios recientes en el material genético, los cuales se están expandiendo de forma clonal.

Este estudio confirmó la prevalencia de F. mexicanum en los estados productores de mango en la región centro occidente de México. Previamente, había sido detectado en Colima, Guerrero y Michoacán (Rodríguez-Alvarado et al., 2008; Otero-Colina et al., 2010), estados situados en la costa del Pacífico, siendo Jalisco el siguiente estado hacia el norte. Estos resultados sugieren que F. mexicanum está bien establecido en esta región y ha sido probablemente diseminado a través de material vegetal contaminado de viveros en esos estados, ya que esta especie ha sido detectada en plántulas (datos no mostrados). La malformación del mango es también común en las áreas productoras del Golfo de México; sin embargo, esta especie no ha sido detectada en huertas de mango en esa región (Otero-Colina et al., 2010). Como se sugirió, el origen geográfico de F. mexicanum podría estar localizado en la región centro occidente de México. Otras especies de Fusarium reportadas como agentes causales de la malformación del mango en otros países, F. mangiferae (Steenkamp et al., 2000) y F. sterilihyphosum (Zheng and Ploetz, 2002; Lima et al., 2009) no han sido detectados en México. F. subglutinans (Vega-Piña y Miranda-Salcedo, 1993; Noriega-Cantú et al., 1999) ha sido reportado en México en el pasado; sin embargo, no fue detectado en este trabajo o en estudios previos (Rodríguez-Alvarado et al., 2008; Otero-Colina et al., 2010). Una implementación más estricta de medidas fitosanitarias es necesaria para prevenir una mayor diseminación de este patógeno en más áreas productoras de mango en México. Debido a lo restrictivo del muestreo estos resultados pueden requerir estudios futuros que incluyan otras regiones, variedades y etapas fenológicas.

 

CONCLUSIONES

F. mexicanum fue identificado como el agente causal de la malformación del mango en Jalisco. El análisis filogenético mostró que F. mexicanum pudiera estar presente como poblaciones clonales en áreas productoras de mango en México.

 

AGRADECIMIENTOS. Agradecemos al Dr. Raúl Rodríguez Guerra (INIFAP, Celaya, Guanajuato) el proveer hojas estériles de clavel para el medio CLA. Este trabajo fue financiado con un apoyo para Investigación en Ciencia Básica de CONACYT, México por medio del Proyecto No. 84578 a G. Rodríguez-Alvarado.

 

LITERATURE CITED

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