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Antecedentes
La mortalidad en pacientes con pancreatitis aguda (PA) es elevada debido a falla multiorgánica y sepsis. Por lo tanto, en los últimos años se han publicado numerosos estudios experimentales centrados en el estrés oxidativo y las citoquinas que se piensa que desempeñan un papel en la fisiopatología de la enfermedad.1,2
Las especies de radicales libres producidas durante el metabolismo normal en el cuerpo o por varios factores externos pueden afectar los componentes intracelulares y extracelulares al dañar las funciones celulares. Las especies reactivas de oxígeno y las especies reactivas de nitrógeno se producen en el cuerpo y causan daños significativos.3 En el estado fisiológico normal existe un equilibrio entre la producción de estas especies y las concentraciones tisulares de antioxidantes en el organismo.3,4 Los estados antioxidante y oxidante totales están relacionados con este equilibrio. Las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno no solo tienen efectos tóxicos, sino también efectos beneficiosos sobre la función inmunitaria y las respuestas celulares. De igual forma tienen un papel importante en la patogénesis de la PA y están asociadas a su gravedad.5,6
El ácido ursólico (AU) es un triterpenoide tipo ursano que se encuentra en numerosas plantas como Sambucus chinensis, Glechoma hederacea, Eriobotrya japonica y Pyrola rotundifolia; cada vez se está empleando más para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos médicos debido a sus diferentes efectos farmacológicos.7 Se cree que muchos de los agentes propuestos en estudios experimentales acerca del tratamiento de la PA actúan por sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias.1,2 El AU ha demostrado ser un potente agente antioxidante y antiinflamatorio en numerosas investigaciones.8-10 Sin embargo, también puede ser beneficioso para el tratamiento de diversas condiciones asociadas a la PA como hiperglucemia, hiperlipidemia, infecciones bacterianas y virales y dolor severo debido a sus efectos antiproteasa, antimicrobianos, hipolipidémicos, hipoglucemiantes, analgésicos y protectores en varios órganos.7-12 Se ha informado que el AU ejerce sus efectos antiinflamatorios y analgésicos a través de la inhibición de la interleucina 1β (IL-1β), la interleucina 6 (IL-6), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), NFκB, iNOS y COX-2.8-13 Estos efectos son muy importantes en la prevención del daño orgánico en la PA.1,2
El presente estudio se realizó para investigar los efectos del ácido ursólico en la PA inducida por ceruleína.
Material y métodos
El estudio fue aprobado por el Comité Local de Ética para la Experimentación con Animales de la Universidad Dicle. En el estudio se utilizaron 32 ratas Wistar albinas, cada una con un peso de 200 a 250 g, las cuales se mantuvieron en ambientes alternados de 12 horas de luz y oscuridad en jaulas separadas y consumieron una dieta estándar para ratas. Las ratas permanecieron en ayuno 12 horas antes del estudio y solo se les permitió beber agua; se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos iguales:
Grupo 1 (grupo simulado): ratas a las que se les administró solución salina mediante inyección intraperitoneal cada hora, seis veces en total.
Grupo 2 (grupo de PA): a las ratas se les inyectó una dosis de 50 mg/kg de ceruleína cada hora por vía intraperitoneal, seis veces en total.14 Tres horas más tarde recibieron una inyección intraperitoneal de solución salina.
Grupo 3 (grupo de tratamiento): tres horas después de la última inyección intraperitoneal de ceruleína igual que el grupo 2, a las ratas se les inyectó por vía intraperitoneal 10 mg/kg de ácido ursólico disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO).
Grupo 4 (grupo de AU): a las ratas se les inyectó por vía intraperitoneal 10 mg/kg de ácido ursólico disuelto en DMSO.
Doce horas después de la última inyección de ceruleína, se aplicó anestesia y se tomaron muestras de sangre por punción cardíaca. Posteriormente las ratas fueron sacrificadas y se tomaron muestras de tejido.
Todos los animales fueron anestesiados con 50 mg/kg de clorhidrato de ketamina intramuscular (Ketalar®, Pfizer, Estambul) y 5 mg/kg de clorhidrato de xilacina (Rompon®, Bayer, Şişli, Estambul) en condiciones asépticas. Una vez aplicada la anestesia y colocados los animales en decúbito supino, se procedió al rasurado de la pared anterior del abdomen y antisepsia con povidona iodada, luego se abrió el abdomen y se tomaron muestras de tejidos pancreático, hepático y pulmonar.
Análisis bioquímico
Las muestras de sangre obtenidas para el análisis bioquímico se almacenaron en hielo y se enviaron al laboratorio correspondiente inmediatamente después de la punción cardíaca. Se centrifugaron a 3000 rpm durante tres minutos para separar las muestras de suero y se almacenaron congeladas a −80 °C para el análisis de amilasa sérica, IL-1β, IL-6, capacidad antioxidante total (CAT), actividad oxidante total (AOT) y TNF-α.
Medición de la capacidad antioxidante total
La CAT de las muestras de suero se determinó mediante un método de medición automatizado desarrollado por Erel.15 Se midió con un kit comercial de prueba del estado antioxidante total (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Turquía). El ensayo se calibró con una solución estándar antioxidante estable. Los resultados se expresaron en equivalente milimolar de Trolox/L.
Medición de la actividad oxidante total
Para medir la AOT se utilizó un kit comercial (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Turquía). El ensayo se calibró con peróxido de hidrógeno y los resultados se expresaron en equivalente micromolar de peróxido de hidrógeno/L.16
Medición de IL-6, IL1-β y TNF-α
IL-6 (kit IL-6-EASIA, DIAsource), IL-1β (kit IL1-b, DIAsource) y TNF-α (kit TNF-α-EASIA, DIAsource) se estudiaron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (método ELISA).17
Evaluación histopatológica
Las muestras de tejido de páncreas, hígado y pulmón obtenidas para el examen patológico se fijaron en recipientes que contenían formol tamponado a 10 %. Se siguieron los métodos clásicos de laboratorio y las muestras se incluyeron en bloques de parafina y se tomaron secciones con un espesor de 5 μm en el portaobjetos. Se tiñeron con hematoxilina-eosina y fueron examinadas con microscopio óptico. Los hallazgos histopatológicos fueron evaluados por un patólogo que desconoció la distribución de los grupos.
Las secciones de páncreas fueron evaluadas por edema, hemorragia, grado de inflamación y necrosis de células acinares. Los criterios definidos por Schmidt et al. se utilizaron para clasificar la lesión pancreática.18 En la evaluación de la lesión pulmonar se utilizó la siguiente puntuación: 0 a 7, fibrosis; 0 a 3, inflamación; 0 a 2, hemorragia. El daño hepático se evaluó por hipereosinofilia citoplasmática, picnosis nuclear, vacuolización citoplasmática, sangrado, infiltración de neutrófilos, necrosis con desintegración de los cordones hepáticos y pérdida de los bordes intercelulares, con una puntuación de 0 a 3.19,20
Análisis estadístico
Los valores obtenidos durante el estudio se analizaron utilizando el programa informático SPSS (Statistical Program for Social Science, Chicago, Illinois, Estados Unidos). Las comparaciones entre todos los grupos se realizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y las comparaciones binarias mediante la prueba U de Mann-Whitney. En todos los análisis se determinó p < 0.05 para indicar la significación estadística.
Resultados
Los niveles de amilasa sérica en los grupos de PA y tratamiento fueron significativamente más altos que en los demás (p < 0.05). Además, los niveles séricos de IL-1β, IL-6 y TNF-α fueron significativamente más altos en el grupo de PA en comparación con el grupo de tratamiento (Figura 1). Los resultados de los análisis bioquímicos de los grupos se muestran en la Tabla 1.
Figura 1 Comparación de los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α entre los grupos de PA y de tratamiento. PA: pancreatitis aguda.
Tabla 1 Resultados bioquímicos de los grupos
| Parámetro | Grupos | p | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Simulado | Pancreatitis aguda | Tratamiento | AU | ||
| Niveles de amilasa sérica | 719.00 (573.00-784.00) | 1747.50 (1443.00-3010.00) | 989.50 (615.00-1336.00) | 645.50 (578.00-682.00) | 0.000126 |
| TNF-α | 46.97 (41.01-51.87) | 92.89 (43.93-148.99) | 44.23 (41.08-86.36) | 45.28 (42.39-47.88) | 0.006354 |
| IL-1β | 446.05 (369.09-493.88) | 549.05 (456.56-1252.54) | 404.36 (371.87-977.29) | 417.98 (392.40-470.97) | 0.002118 |
| IL-6 | 24.92 (21.45-30.64) | 40.554 (29.32-117.83) | 25.169 (22.17-46.646) | 26.623 (23.63-30.73) | 0.005459 |
| CAT | 0.85 (0.76-0.90) | 0.81 (0.67-1.46) | 0.61 (0.39-1.25) | 0.78 (0.69-0.88) | 0.010493 |
| AOT | 553.64 (304.55-940.91) | 1123.07 (547.05-3484.09) | 837.72 (106.59-3447.95) | 618.63 (421.36-1490.68) | 0.190816 |
AOT: actividad oxidante total; AU: ácido ursólico; CAT: capacidad antioxidante total.
Aunque los niveles de AOT en plasma fueron similares en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de PA, los niveles de la CAT en plasma fueron significativamente más bajos en el primero. Se detectaron valores más bajos de AOT y más altos de CAT en el tejido pulmonar del grupo de tratamiento. Aunque la AOT del tejido pancreático en los grupos de PA y tratamiento fueron similares, la CAT del tejido pancreático en el grupo de tratamiento fue significativamente mayor que en el grupo de PA (Tabla 2).
Tabla 2 Resultados bioquímicos tisulares
| Parámetro | Grupos | p | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Simulado | Pancreatitis aguda | Tratamiento | Ácido ursólico | ||
| CAT pulmonar | 0.394 (0.18-0.63) | 0.142 (0.053-0.263) | 0.231 (-0.1400-0.737) | 0.656 (0.2786-1.360) | < 0.005 |
| CAT del páncreas | 0.254 (0.124-0.345) | No disponible | 0.163 (0.023-0.55) | 0.418 (0.358-1.225) | > 0.005 |
| AOT pulmonar | 762.07 (319.31-1178.12) | 769.03 (297.67-2199.59) | 468.51 (254.27-1025.00) | 1435.63 (42.35-3176.98) | > 0.005 |
| AOT del páncreas | 654.511 (132.41-2259.71) | 1369.66 (182.24-2477.68) | 1468.14 (671.25-2691.76) | 1688.07 (294.60-22259.71) | > 0.005 |
AOT: actividad oxidante total; AU: ácido ursólico; CAT: capacidad antioxidante total.
Evaluación histopatológica
En el grupo de PA se observó evidente necrosis de células acinares e infiltración de células inflamatorias en el tejido pancreático y en el grupo de tratamiento, menos necrosis e inflamación de células acinares (Figuras 2A y 2B). En el tejido pulmonar se observó inflamación severa y fibrosis en el grupo de PA; la inflamación se redujo dependiendo del uso de AU en el grupo de tratamiento. Se observó daño hepático caracterizado por vacuolización citoplasmática significativa en el grupo de PA, si bien se observó curación del tejido hepático en el grupo de tratamiento (Figuras 2C y 2D). Las puntuaciones histopatológicas de los grupos se muestran en la Tabla 3.
Figura 2 Exámenes histopatológicos de tejidos. A: necrosis de células acinares en tejido pancreático (pancreatitis). B: necrosis de células acinares en un pequeño número de células en tejido pancreático, grupo de tratamiento. C: en el grupo de pancreatitis se observa daño hepático caracterizado por vacuolización citoplasmática prominente en el tejido hepático. D: se observa cicatrización en tejido hepático (hematoxilina-eosina, 100×).
Discusión
Los niveles de amilasa en suero y la evaluación histopatológica en nuestro modelo experimental, tanto en el grupo de PA como en el grupo de tratamiento, indicaron que la inducción de pancreatitis aguda se logró mediante la inyección de ceruleína.
El tratamiento actual de la PA implica atención de apoyo que incluye reposición de líquidos, control del dolor y prevención de infecciones. Por otro lado, actualmente no existe un tratamiento específico. En este contexto, se han utilizado experimentalmente algunos fármacos, entre ellos sustancias antiinflamatorias y antioxidantes para curar daños en el páncreas y órganos remotos. La gravedad de la PA está relacionada con el grado de respuesta inflamatoria sistémica, así como con las quimiocinas y las citocinas responsables de la progresión de la inflamación.21
La disfunción orgánica es una causa importante de morbilidad y mortalidad en los pacientes con PA. Se cree que la respuesta inflamatoria generalizada inapropiada y la tormenta de citocinas pueden provocar una disfunción multiorgánica. Inicialmente, los mediadores circulantes causan lesión del endotelio en los órganos y, posteriormente, la sobreexpresión de citoquinas en el espacio intersticial de varios órganos se considera el mecanismo principal de lesión del parénquima.22 Por lo anterior, se han estudiado diversas sustancias con el objetivo de mejorar la PA mediante la reducción de los mediadores inflamatorios. Se ha informado que la mayoría de estos fármacos actúa mediante la reducción de una o más citoquinas como IL-1β, IL-6 y TNF-α. Aunque se ha encontrado que algunos de estos medicamentos son efectivos, algunos no lo son.23-26
Por otro lado, se ha demostrado que el óxido nítrico y otros radicales libres participan en el agravamiento de la lesión oxidativa y pueden desempeñar un papel importante en la patogenia de la PA y el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, el cual cuando es persistente se asocia a daño orgánico y muerte en pacientes con PA.27
Se ha demostrado que el AU reduce los niveles de las citocinas, incluidas IL-1β, IL-6 y TNF-α. El AU también reduce el estrés oxidativo al mejorar la actividad de la superóxido dismutasa y aumentar la eliminación de radicales libres oxidativos.28,29 En nuestro estudio, el AU mostró efectos antiinflamatorios al reducir los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α; asimismo, mostró actividad antioxidante en sangre, páncreas y órganos remotos.
Los hallazgos histopatológicos mostraron acentuada necrosis de células acinares e infiltración de células inflamatorias en el tejido pancreático del grupo de PA. Por otro lado, encontramos que el tratamiento con AU redujo la necrosis de las células acinares y la inflamación en el tejido pancreático. De forma similar, se observaron diversos grados de curación en los tejidos del pulmón y el hígado según el uso de AU.
Durante mucho tiempo se ha discutido el papel de las antiproteasas en el tratamiento de la PA. En la patogenia de la PA se cree que el tripsinógeno se activa de manera inapropiada al convertirse en tripsina, la cual desempeña un papel importante en el inicio y progresión de la pancreatitis al activar los zimógenos pancreáticos debido a la falta de eliminación rápida de la tripsina activa en el páncreas.
La activación de las enzimas digestivas lleva a daño pancreático y da como resultado una respuesta inflamatoria. Por lo tanto, se ha planteado el uso de tratamiento antiproteasa, cuyo uso rutinario si bien no se recomienda en la PA, en algunos estudios se ha informado que previene la elevación de las enzimas pancreáticas, el dolor abdominal y el desarrollo de pancreatitis en pacientes sometidos a colangiopancreatografía retrógrada endoscópica.
Por otra parte, se ha propuesto la infusión arterial intravenosa o regional de antiproteasas en la PA grave para prevenir la progresión de la enfermedad.30,31 Creemos que, además de otros efectos, el potente efecto antiproteasas de la AU también debería evaluarse en el tratamiento de la PA.
Aún no se ha realizado ningún estudio sobre los efectos del AU en la PA, sin embargo, su efecto sobre la lipasa pancreática humana in vivo fue investigado por Hyspler et al.,32 quienes identificaron efectos inhibidores del AU sobre la lipasa pancreática y sugirieron que la cáscara de manzana micronizada podría ser un suplemento adecuado para pacientes con obesidad o diabetes que requieren un inhibidor de la absorción de lípidos. En nuestro estudio analizamos los niveles de amilasa, no de la lipasa pancreática.
La principal limitación de nuestro análisis es que no se compararon diferentes dosis de AU; sería apropiado diseñar una investigación diferente al respecto. Además, pensamos que el efecto del AU sobre la pancreatitis necrosante o grave debería investigarse específicamente. Otra limitación se refiere a los efectos del DMSO sobre los niveles de amilasa, IL-1β, IL-6, CAT, AOT y TNF-α. El DMSO se ha utilizado como disolvente en numerosos estudios. Dado que sus efectos sobre los parámetros estudiados fueron mínimos, se ignoraron. En nuestro análisis no se midieron los efectos de DMSO en estos parámetros; sin embargo, se ha demostrado que el DMSO no altera los niveles de TNF, IL-6 CAT, AOT o amilasa, pero puede elevar los niveles de IL-1β.33,34
Como resultado, en nuestro modelo de pancreatitis experimental observamos que el AU redujo el daño en el páncreas y órganos remotos en la pancreatitis aguda. Además, bioquímicamente observamos que el estrés oxidativo disminuyó por efecto del AU.
