text new page (beta)
Spanish (pdf)
Article in xml format
Article references
Automatic translation
Send this article by e-mail
Cited by SciELO 
Similars in
SciELO 
Permalink
Introducción
La mosca blanca Bemisia tabaci (Gennadius) es una de las especies más destructivas e invasivas en el mundo (GISD 2020). En los 90’s la plaga se popularizó cuando las infestaciones en Estados Unidos de América provocaron la destrucción de tierras de cultivo que resultaron en la pérdida millones de dólares, empleos y medios asociados a la agricultura (Gill 1992). Las diferencias en el comportamiento de dos poblaciones aisladas de B. tabaci llevó al inicio de su estudio molecular y a reconocer la presencia de los biotipos A (indígena) en el suroeste de los E.U.A y B (invasor) en el Estado de Florida (Costa et al. 1993, Li et al. 2021). Desde las primeras pruebas moleculares a la fecha se han identificado al menos 35 biotipos dentro de la especie B. tabaci (Zang et al. 2006, Liu et al. 2012, Firdaus et al. 2013) que se diferencian en base a polimorfismos bioquímicos y moleculares (Brown et al. 1995). Los biotipos B y Q son considerados los más dañinos e invasivos a nivel mundial (De Barro et al. 2011), ambos poseen características amenazan la producción de alimentos, por ejemplo, gran rango de hospederos, trasmisión de virus fitopatógenos, mayor potencial biótico, resistencia a insecticidas, entre otras (Fen-Luan et al. 2017, Carnero et al. 2021). En contraste, el biotipo indígena A es catalogado como inocuo para las especies cultivadas (Denholm et al. 1998).
A pesar de que B. tabaci es considerada un complejo de especies indistinguibles morfológicamente entre sí, su análisis morfológico ha demostrado ser un estudio eficaz para separar algunos biotipos, por lo que es importante su combinación con técnicas moleculares para resolver dudas y problemas en la diferenciación de las especies (Calvert et al. 2001, Gill y Brown 2010, Li et al. 2013). Por lo antes mencionado, el presente estudio tuvo el objetivo de identificar mediante análisis de caracteres morfológicos los biotipos A, B y Q de B. tabaci.
Materiales y métodos
Colecta de las muestras de mosquita blanca
Los especímenes de B. tabaci se colectaron de cultivos de tomate en los municipios de Culiacán (24° 34’ 44.0" LN 107° 25’ 20.4" LO), Elota (24° 01’ 21.6" LN 106° 52’ 40.7" LO) y Mocorito (25° 03’ 38.6" LN 107° 39’ 36.8" LO) del Estado de Sinaloa, México. Las poblaciones se liberaron por 24 h en plantas de tomate variedad Rio Grande para su oviposición y se mantuvieron a 30 ± 3 °C, humedad relativa del 70% y fotoperiodo de 14:10 (L:O).
Análisis molecular de los biotipos de Bemisia tabaci
El análisis molecular de las poblaciones se realizó con adultos preservados en alcohol etílico al 70% a 4 °C, este análisis se realizó en el Laboratorio de Toxicología del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Para la extracción del ADN total se utilizó la técnica de Doyle y Doyle (1999) extrayendo de manera individual el ADN de 30 moscas blancas. En tubos de 1.5 mL, se maceraron los individuos con 200 μL de buffer de lisis (100 mm Tris-HCl, 50 mm EDTA, 50 mm NaCl y 2% SDS) con ayuda de una punta de vidrio. Se agregaron 300 μL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) para después centrifugar a 1 2000 rpm por 15 minutos. La fase líquida superior se llevó de nuevo a un tubo y se añadió una cantidad proporcional al volumen recuperado de isopropanol frío y se incubó a 4 °C por 15 minutos y centrifugó a 1 2000 rpm por 10 minutos. El isopropanol se desechó para después lavar el ADN con 200 μL de alcohol al 70%. Una vez secado a temperatura ambiente se resuspendió el ADN en 20 μL de agua MiliQ. El ADN se observó en un gel de agarosa al 1%, usando 1 μL de buffer de carga Gel Red (Gen Script) en la cámara de electroforesis a 60 voltios por 50 minutos.
La identificación de los biotipos se realizó siguiendo la metodología e iniciadores propuestos por Shatters et al. (2009), una primera reacción de PCR con los iniciadores Btab-Uni L Btab-UniL (5’- GAG GCT GRA AAA TTA RAA GTA TTTGG-3’) y Btab-Uni R (5’-CTA ATR TGG CAG A-AA GTG CAG TAA ATT TAAG-3’) se realizó para amplificar un fragmento de alrededor de 700 pB del gen mtCO1 en la familia Aleyrodidae (Shatters et al. 2009); usando 7 μL de Taq&GoT Mastermix (Gen Script), 0.5 μL de cada iniciador a 10 mm y 1 μL de ADN, a un volumen final de 20 μL por reacción en un termociclador Axygene’s MaxyGene; las condiciones de amplificación fueron de 94 °C por 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94 °C por 30 segundos; 46 °C por 1 minuto (alineamiento de los iniciadores) y 72 °C por 1 minuto y extensión final a 72 °C por 5 minutos. Los productos obtenidos se visualizaron en un gel de agarosa al 1% en buffer de carga Gel Red (Gen Script) y un marcador molecular de 100 pb (Bio Basic Canada INC.). Los productos se observaron con un transiluminador MultiDoc-It mediante el programa UVP Digital Imaging System.
Los productos de PCR obtenidos con los iniciadores universales Btab-Uni L y Btab-Uni R se tomaron como ADN molde para la identificación de los biotipos A, B y Q. Se utilizaron los iniciadores NewWorld-Primer L (5’-TAC TGT TGR AAT AGA TGT TGA CAC TCGGG-3’), NewWorld-Primer R (5’-AAT ATT TGW GGG AGT AAA YCT GAC ATT TTT TCC- 3’), BioB-Primer L (5’-CTA GGG TTT ATT GTT TGA GGT CAT CAT ATA TTC-3’), BioB-Primer R (5’-AGG GGG AAT GCC TCG TCG ATATT-3’), BioQ-Primer L (5’-CTT GGT AAC TCT TCT GTA GAT GTG TGTT-3’) y BioQ-Primer R (5’-GAA CAA AAT TTC TTC TGC GGG AAGG-3’) los cuales amplifican un fragmento del gen mtCO1 de 405 pb, 478 pb, y 303 pb para los biotipos A, B y Q, respectivamente. Se utilizaron 7 μL de 2xTaq Mastermix (Gen Script); 0.5 μL de cada iniciador a 10 mM y 1 μL de ADN, a un volumen final de 20 μL por reacción. Las condiciones de amplificación de la PCR fueron 94 °C por 2 minutos seguido de 35 ciclos de 94 °C por 30 segundos; 64 °C por 1 minuto (alineamiento de los iniciadores) y 72 °C por 1 minuto y extensión final de 72 °C por 10 minutos. Los productos obtenidos se visualizaron en un gel de agarosa al 3.5% usando buffer de carga Gel Red (Gen Script) y un marcador molecular de 100 pb (Invitrogen) y se observaron con un transiluminador MultiDoc-It mediante el programa UVP Digital Imaging System.
Morfometría
Una vez revelada la presencia de los biotipos A, B y Q con la caracterización genética de las muestras de B. tabaci recolectadas se seleccionaron 30 individuos de cada uno de los grupos genéticos. Los estadios de desarrollo se identificaron con el método descrito por Malumphy et al. (2009). Con un microscopio compuesto Olimpus 4x-100x conectado a un lente digital y al software de medición DinoCapture 2.0 versión 1.4.3, previamente calibrado con una reglilla métrica. El análisis morfométrico inició con la observación y medición de la variación morfológica en caracteres taxonómicos como la longitud de huevo (LH), ancho de huevo (AH), longitud de cuerpo ninfal (LC), ancho de cuerpo ninfal (AC), ancho de cuerpo de la pupa (ACP) y largo de cuerpo de la pupa (LCP), las mediciones fueron realizadas en cada uno de los instares ninfales y pseudopupa (N1, N2, N3, N4, y pseudopupa). Con los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza unidireccional considerando un diseño completamente al azar y se aplicó la prueba de Tukey para comparar medias (p < 0.05) con el programa estadístico R versión 3.3.1.
Resultados y discusión
En la identificación de los biotipos A, B y Q de B. tabaci; las pruebas de PCR revelaron la presencia de los biotipos A (Mocorito), B (Elota) y Q (Culiacán) en las tres poblaciones provenientes de cultivares de tomate del Estado de Sinaloa al obtener los fragmentos de 405 pb, 478 pb, y 303 pb, respectivamente (Figura 1). El uso de claves morfológicas es de las principales técnicas utilizadas para la separación de las especies de mosca blanca a pesar de que B. tabaci ha sido reconocida como un complejo de especies que ha evolucionado sin necesidad de desarrollar grandes cambios en su morfología (Gill y Brown 2010). Las variaciones morfológicas pueden utilizarse para identificar taxonómicamente de B. tabaci, pero presenta variaciones en su morfometría (forma del cuerpo, número de cerdas y tamaño del orificio vasiforme, entre otras) lo cual depende del hospedero e incluso si su línea parental proviene de una sola planta hospedera (Bethke et al. 1991, Thompson et al. 2000, Jayasekera et al. 2010, Thomas et al. 2011, Thomas et al. 2014, Thomas y Gaur 2014, Chaubey et al. 2015) interacciones con otros microorganismos (Shibuya et al. 2009, Chu et al. 2011, Mouton et al. 2012) y por sus polimorfismos genéticos. Las diferencias morfométricas entre los biotipos A, B y Q de B. tabaci provenientes del Estado de Sinaloa tuvieron evidentes variaciones en la amplitud y longitud de las ninfas en los tres grupos genéticos, observándose que en la etapa de huevo de B. tabaci el biotipo A tiene una media de 0.30 μm en el ancho (AH) y 0.01 μm en el largo del huevo (LH); mientras que las medias en el biotipo Q fueron de 0.37 μm de AH y 0.01 μm de LH; las cuales fueron significativamente diferente a los biotipos A y Q, mientras que el biotipo B mostró una media de 0.49 μm de AH y 0.22 μm de LH (Tabla 1). Las ninfas de primer instar del biotipo A mostraron una media de AC de 0.32 μm, la cual difirió significativamente de las medias del biotipo B con 0.29 μm y el biotipo Q con 0.28 μm, en cuanto a LC el biotipo A presentó la media más elevada con 0.52 μm, seguido del B y Q con medias de 0.52 μm. En el segundo instar, los biotipos A y B presentaron mayor AC con medias de 0.57 μm mientras que el biotipo Q mostró el menor valor con 0.64 jum, para las medias de LC no se observaron diferencias estadísticas, ya que los biotipos A y B obtuvieron medias de 0.90 μm y Q de 0.93 μm. En las ninfas del tercer instar el AC del biotipo A fue de 0.93 μm, el cual es estadísticamente diferente de los valores de los biotipos B y Q al presentar valores de 0.84 y 0.64 μm, respectivamente. En las ninfas del cuarto instar no se observó diferencia significativa en AC, el valor de la media más alto fue para el biotipo B con 0.9 μm, seguido del A con 0.88 μm y el Q con 0.87 μm, en LC no se observaron diferencias estadísticas entre los biotipos A, B y Q con medias de 1.3, 1.30 y 1.27 μm, respectivamente. Por último, el estado pupal con mayor ACP fue el del biotipo B con 1.03 μm seguido del A con 0.99 μm y el Q con 0.97 μm, la media más alta de LCP se registró en el biotipo B con 1.44 μm y el A con 1.38 μm mientras que en el biotipo Q se observó la media más baja con 1.31 μm. En vista de los resultados el biotipo A fue el segundo grupo genético con mayores dimensiones en 2do, 3er instar y en pseudopupa mientras que el biotipo Q presentó las menores dimensiones en todos los instares y en pseudopupa. El biotipo B presentó mayores dimensiones en 1er, 2do y 3er instar y pseudopupa. Estos resultados coinciden con Li et al. (2013) quienes en un estudio morfométrico de seis biotipos (B, Q, Cv, ZHJ-1, ZHJ-2 y ZHJ-3) de B. tabaci, concluyeron que el biotipo invasor B era especialmente más grande que los indígenas. La variación de los caracteres morfológicos se ha correlacionado con la variación genética de los biotipos de Bemisia tabaci (Calvert et al. 2001; Li et al., 2013; Chaubey y Andrew, 2015; Harish et al., 2017). De los 35 biotipos identificados a nivel mundial los biotipos B y Q son considerados los más importantes debido a su amplia distribución, resistencia a insecticidas y capacidad de trasmisión de virus (Dinsdale et al. 2010). El biotipo Q es el más estudiado debido a su alta capacidad de invasión y su resistencia a insecticidas (Fen-Luan et al. 2017), los valores obtenidos en las dimensiones del biotipo Q en el presente estudio pueden asociarse a mutaciones genéticas que les confieren resistencia a insecticidas, pero a su vez se comprometen aptitudes biológicas que ocasionan desventajas sobre las contrapartes susceptibles (Ako et al. 2004). La resistencia a insecticidas es un factor que influye en el desarrollo, ya que existe pérdida de recursos en el mantenimiento de los mecanismos de resistencia. Asimismo, los individuos resistentes de diversas especies suelen ser de tamaños más reducidos que los susceptibles, arriesgando su éxito reproductivo de modo que disminuye su probabilidad de encontrar pareja (Couvillon et al. 2010, Konopka et al. 2012). El ancho de cuerpo del 1er, 2do, 3er estadio y el largo de cuerpo de la pseudopupa de B. tabaci son parámetros adecuados para identificar y separar los biotipos A, B y Q. Para evitar el fracaso en el manejo de las poblaciones de mosca blanca se requiere tomar en cuenta el biotipo presente en el cultivo. Por lo general no se toman en cuenta sus diferencias genéticas que les confieren adaptaciones de tipo biológico o de tolerancia a insecticidas; beneficios que comprometen aptitudes biológicas, que les ocasionan desventajas que pueden ser utilizadas para diseñar un manejo que disminuya las densidades por medio de una correcta selección de insecticidas, dosis e intervalos de aplicación.
Figura 1 Detección de biotipos de Bemisia tabaci. Análisis electroforético de los fragmentos amplificados de 478 pb, 405 pb y 303 pb con los iniciadores BioB-Primer L, BioB-Primer R, NewWorld-Primer L, NewWorld-Primer R, BioQ-Primer L, BioQ-Primer R (Shatters et al. 2009) mediante PCR. Carril 1: marcador de tamaño molecular de 100pb (Invitrogen); carriles 2, 3, 4 y 5: Biotipo B, carriles 6, 7, 8 y 9: Biotipo A; carriles10, 11, 12 y 13: Biotipo Q.
Tabla 1 Comparación de medias de los valores morfométricos de huevos de los biotipos A, B y Q de B. tabaci.
| Huevo | 1er Instar | 2do Instar | 3er Instar | 4to Instar | Pseudopupa | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Biotipo | AH (μm) | LH (μm) | AC (μm) | LC (μm) | AC (μm) | LC (μm) | AC (μm) | LC (μm) | AC (μm) | LC (μm) | ACP (μm) | LCP (μm) |
| Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | Media ± SD1 | |
| A | 0.38 ± 0.02a | 0.18 ± 0.01a | 0.32 ± 0.01b | 0.52 ± 0.01a | 0.57 ± 0.01a | 0.9 ± 0.02a | 0.93 ± 0.03a | 1.3 ± 0.20a | 0.88 ± 0.02a | 1.31 ± 0.02a | 0.99 ± 0.03a | 1.38 ± 0.02a |
| B | 0.49 ± 0.02b | 0.22 ± 0.01b | 0.29 ± 0.01a | 0.5 ± 0.01a | 0.57 ± 0.01a | 0.9 ± 0.02a | 0.84 ± 0.03b | 1.54 ± 0.20a | 0.9 ± 0.02a | 1.3 ± 0.02a | 1.03 ± 0.03a | 1.44 ± 0.02ab |
| Q | 0.37 ± 0.02a | 0.17 ± 0.01a | 0.28 ± 0.01a | 0.5 ± 0.01a | 0.64 ± 0.01b | 0.93 ± 0.02a | 0.64 ± 0.03b | 0.97 ± 0.20a | 0.87 ± 0.02a | 1.27 ± 0.02a | 0.97 ± 0.03a | 1.31 ± 0.02b |
LH = Longitud de Huevo, AH = Ancho de Huevo, AC = Ancho de Cuerpo de la ninfa, LC = Largo del cuerpo de la ninfa, ACP = Ancho de Cuerpo de la Pupa, LCP = Largo de Cuerpo de la Pupa, 1 Desviación estándar. Medias con diferente letra entre columnas presentan diferencia significativa (P > 0.05).
