Colecta del material biológico

La estación de otoño es una de las temporadas con presencia de frutos maduros en la zona (^{Rubalcava-Castillo et al., 2020}). El 6 de diciembre del 2019 se colectaron 100 frutos maduros por ejemplar (n = 15) en el bosque templado del Área Natural Protegida (ANP) Sierra Fría, Aguascalientes (22° 11' 56.07 "N, 102° 37' 54.88" W, 2 670 m) (Figura 1). El 21 de abril del 2020 se colectó material vegetal para realizar esquejes, después del crecimiento de las ramillas. La colecta se hizo con tijeras de poda en el predio “Rancho Piletas”, dentro del ANP Sierra Fría. El material vegetal se transportó en bolsas de plástico para conservar la humedad.

Figura 1 Detalles de Arctostaphylos pungens en campo y experimentos. A) Ejemplares en campo, B) fruto, C) propagación vegetativa natural, D) semillas libres, E) semillas fusionadas, F) formación de raíz en acodo, G) tamaño de esqueje utilizado en el experimento. 

Propagación sexual

Propagación asexual

Análisis estadístico

Se calcularon medias y desviaciones estándar de los valores obtenidos en la caracterización de frutos, peso de semillas, germinación y propagación vegetativa. El diseño experimental fue completamente al azar. El efecto de los tratamientos pregerminativos se comparó por medio de un análisis de varianza de una vía con comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05); los datos de porcentajes se transformaron previamente con la función Arc sen. El TMG se calculó y comparó (Tukey, P ≤ 0.05) entre T2, T3, T7 y T8 que fueron los tratamientos que presentaron germinación. T1 y T4 se excluyeron, ya que solo germinó una semilla en una réplica. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa InfoStat (^{Di-Rienzo et al., 2016}).

Propagación sexual

Los frutos colectados midieron menos de 1 cm, pesaron 0.19 ± 0.04 g y tuvieron tres semillas libres por fruto. Las semillas fueron de tamaño pequeño con peso de 1.22 ± 0.13 g por 100 semillas (Cuadro 2).

En el estado de Durango y en el Bajío y sus zonas adyacentes, los frutos de mayor tamaño miden de 5 a 11 mm de diámetro (^{González-Elizondo & González-Elizondo, 2014}; ^{Márquez-Linares et al., 2006}). En este estudio, el tamaño de la semilla fue mayor que la de Durango que midió 3.2 mm de largo y 2.6 mm de ancho. Los tamaños del fruto y semilla varían de acuerdo con las condiciones climáticas y edafológicas del sitio en que se desarrollan (^{Pozo-Gómez, Orantes-García, Rioja-Paradela, Moreno-Moreno, & Ferrera-Sarmiento, 2019}). Las zonas comparadas pueden tener climas similares por lo que los tamaños son parecidos. El número de semillas libres también coincide con la descripción realizada para dichas zonas. El peso es una variable que no se toma en cuenta en la descripción botánica, pero es importante para la producción en vivero, ya que permite determinar el número de semillas por kilogramo y la cantidad de semillas a utilizar (^{Apodaca-Martínez et al., 2019}).

Los resultados de germinación mostraron diferencias significativas (P < 0.0001); estos variaron de 0 a 73.3 % (Cuadro 3; Figura 2). Las semillas con mayor porcentaje de germinación (66 a 73 %) fueron las sometidas al T8, proceso de escarificación con H₂SO₄ por 5 h + 1 000 ppm de GA₃, siendo similares a los tratamientos T2 y T3 expuestos al ácido durante 5 y 6 h. El T7 (4 °C por 60 días + H₂SO₄ por 4 h) causó 27.5 % de germinación y en los tratamientos restantes fue nula o prácticamente nula (Cuadro 3).

Figura 2 Curva de germinación acumulada de los ocho tratamientos pregerminativos en Arctostaphylos pungens. La escarificación se hizo con H₂SO₄ a una concentración de 98 %, la estratificación se basó en el almacenamiento en frío (4 °C) y el choque térmico consistió en colocar las semillas en arena seca a 100 °C por 5 min. 

El H₂SO₄ es usado comúnmente como tratamiento pregerminativo en especies con cubiertas impermeables que dificultan la entrada de agua a la semilla; este método ha aumentado la germinación en especies de los géneros Medicago, Arctostaphylos y Juniperus (^{Martínez-Pérez et al., 2006}; ^{Peng, Xiao, Wang, & Yu, 2018}; ^{Tilki, 2007}). Arctostaphylos pungens forma bancos de semillas (^{Márquez-Linares et al., 2006}), indicando que son ortodoxas y su testa impide la entrada y salida de humedad, lo que hace necesaria una degradación de la testa. Los resultados de germinación en semillas tratadas con H₂SO₄ fueron mayores que los señalados por Martínez-Pérez et al. (2006), quienes mencionan 63 % de germinación con exposiciones al H₂SO₄ por 6 h y menores del 10 % con 5 h de inmersión. Asimismo, dichos autores mencionan que la germinación fue nula con inmersiones por menos de 5 h; en el presente estudio, la inmersión por 4 horas causó germinación de 27.50 ± 11.01 %.

Los porcentajes pueden diferir debido a la semilla usada en los experimentos, ya que suelen presentarse libres o fusionadas por dos o más semillas (^{Jurado et al., 2011}). En el presente estudio se utilizaron semillas libres únicamente; en el caso de ^{Martínez-Pérez et al. (2006}) no se menciona si se usaron semillas libres o fusionadas. En estudios con Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. se menciona la dificultad de una germinación homogénea, debido a la variedad de tamaño de las semillas y la complejidad de acertar el tiempo necesario para que el H₂SO₄ tenga los efectos deseados, además de que en semillas pequeñas se pueden provocar daños al embrión (^{García-Fayos et al., 2001}). En el caso de A. pungens esto puede ocurrir de manera similar, ya que las semillas fusionadas podrían presentar una testa de mayor grosor, lo cual incrementaría el tiempo de inmersión necesario para que el H₂SO₄ degrade suficientemente la barrera mecánica que representa la testa. Cabe destacar que las diferencias de germinación también podrían deberse a variaciones entre las poblaciones, procedencia y su producción de semillas (^{Pozo-Gómez et al., 2019}). De acuerdo con las observaciones, se recomienda escoger semillas libres de tamaño mayor para evitar posibles daños causados por el tratamiento pregerminativo con H₂SO₄.

A. pungens, además de presentar una testa muy dura, posee una posible latencia fisiológica (^{Jurado et al., 2011}; ^{Martínez-Pérez et al., 2006}). Los tratamientos que se enfocaron en romper la latencia fisiológica, basados en estratificación fría junto con choque térmico, no germinaron con excepción de una semilla del T4 (4 °C por 90 días + choque térmico de 100 °C por 5 min). Estos datos son menores que los encontrados por Jurado et al. (2011), quienes se dedicaron a romper la latencia desde un punto de vista de la ecología de la semilla de A. pungens y su relación con el fuego, incrementando la germinación hasta en 29.7 ± 8.4 % con una combinación de diversos factores (extracto de carbón vegetal, humo, frío y calor). Cabe destacar que, en dicho estudio, los porcentajes de germinación fueron relativamente bajos con tratamientos similares a los empleados en este trabajo, ya que con 40 días de almacenamiento en frío más choque térmico de 100 °C lograron 5.7 ± 4.3 % de germinación.

Se ha mencionado el efecto positivo de la estratificación en frío sobre la germinación en diversas especies (^{Baskin & Baskin, 2004}) y el de la combinación con GA₃ en especies de la misma familia que A. pungens (Ericaceae) como el género Arbutus (^{Bertsouklis & Papafotiou, 2013}; ^{Smiris et al., 2006}). El frío estimula la ruptura de la latencia fisiológica como llega a ocurrir en la naturaleza por efecto del invierno. Dicha latencia puede ser desde no profunda, intermedia y profunda; está ultima requiere de tres a cuatro meses de frío (Baskin & Baskin, 2004). Lo anterior podría indicar que A. pungens quizá tenga latencia fisiológica profunda y requiera más tiempo de almacenamiento en frío que el utilizado en el presente experimento (90 días).

En este estudio, los tratamientos T7 (4 °C por 60 días + H₂SO₄ por 4 h) y T8 (H₂SO₄ por 5 h + 1 000 ppm GA₃ por 24 h) buscaron cubrir latencia fisiológica y física. Para el tratamiento T7 pudo haber sido necesario un periodo de almacenamiento en frío más largo, así como mayor tiempo de inmersión en H₂SO₄. El tratamiento T8, al cual se le adicionó GA₃ después de la inmersión de 5 h en ácido, aunque no fue estadísticamente diferente, tuvo mayor porcentaje de germinación y un menor TMG que el tratamiento que únicamente constó de inmersión por 5 h en H₂SO₄. En otros estudios se han mencionado los efectos positivos del GA₃ sobre la germinación y el rompimiento de latencia, reemplazando la necesidad de un estímulo ambiental específico como la temperatura o luz (^{Baskin & Baskin, 2004}).

El tiempo necesario para la germinación presentó diferencias (P = 0.0128). Los TMG variaron de 9 a 22 días después de la siembra; los tratamientos con H₂SO₄ presentaron los menores tiempos de germinación, la cual inició antes de los 10 días después de la siembra, mientras que los tratamientos restantes comenzaron en el día 18 y 54 (Cuadro 3; Figura 2).

El efecto del H₂SO₄ también se reflejó en el tiempo necesario para que la semilla germine, siendo menor en las semillas inmersas por más tiempo. El H₂SO₄, al reducir la barrera que representa la testa de A. pungens, facilita la entrada de agua al embrión para iniciar la imbibición y, consecuentemente, la germinación; asimismo, ayuda a que la radícula rompa la testa (^{Martínez-Calderón, Sosa-Ramírez, Torres-González, Mendieta-Vázquez, & Sandoval-Ortega, 2020}). En otros estudios se menciona un T50 (tiempo necesario para alcanzar 50 % de la germinación total) de 18 días (^{Martínez-Pérez et al., 2006}); en el presente estudio se observaron tiempos un poco menores de 16 días en la curva de germinación (Figura 2).

Propagación asexual

Los esquejes presentaron supervivencia de 35.78 % a las 12 semanas, pero no formaron callo y raíz. El inicio del desarrollo de yemas axilares se observó a las cuatro semanas, pero no finalizó. Esto contrasta con lo observado por ^{Hart (2005}) en otras especies del género Arctostaphylos con posibilidad de enraizamiento, difiriendo en el uso del sustrato (agrolita). Hart (2005) menciona que la buena aeración y drenaje pueden ser factores importantes en la propagación vegetativa y que, en especies arbustivas medianas o arbóreas como Arctostaphylos grandulosa Eastw., los esquejes pueden tardar de tres a cinco meses en formar raíces. Esto puede ocurrir con A. pungens, siendo una especie arbustiva grande de 3 a 4 m, la formación de raíces tardaría más tiempo.

En los acodos aéreos no se observó muerte de la rama utilizada para realizar el acodo y hubo formación de callo (97.5 %) y raíz (37.50 %). En general, a las 20 semanas, los acodos aéreos tuvieron dos a siete raíces (80 %) formadas recientemente; el resto presentó 10 a 18 raíces (20 %). El tamaño de estas fue en su mayoría menor de 10 mm (78.4 %) y el resto varió de 10 a 25 mm (21.6 %).

Los resultados muestran la posibilidad de inducir la formación de raíces para una propagación vegetativa de la especie como se ha observado en estado silvestre (^{Luna-Ruiz et al., 2016}) por medio de acodos aéreos tratados con AIB. Esta auxina ha sido utilizada de manera exitosa para promover la formación de raíces en especies leñosas de interés alimenticio, ornamental y, en menor medida, en especies forestales silvestres (^{Abdel-Rahman, Abdul-Hafeez, & Saleh, 2020}; ^{Ramos-Palacios et al., 2012}; ^{Sánchez-Urdaneta et al., 2009}).

Lo observado en el presente estudio es similar a lo ocurrido en una especie de mangle (Conocarpus erectus L.) que formó retoños en esquejes pero no desarrolló raíz, mientras que en acodos aéreos si se logró la formación radicular (^{Benítez-Pardo, Flores-Verdugo, & Flores-Verdugo, 2002}). Esto se puede deber a que la especie requiere más de una estación para lograr la formación de un buen sistema radicular, que por medio de estacas o esquejes no se lograría. Otro factor que influye en el éxito es la estación en la que se realice la práctica de propagación vegetativa (Benítez-Pardo et al., 2002). En el presente trabajo, los acodos se realizaron en primavera llegando al final de su primera etapa de crecimiento y se retiraron en verano cuando estaban en su segunda temporada de crecimiento.

Como se mencionó anteriormente, la formación de callo se observó en 97.50 ± 5 % de los acodos aéreos. En diversas especies, dicho fenómeno puede representar el inicio de la formación radicular como consecuencia de la diferenciación celular (^{Ikeuchi, Sugimoto, & Iwasec, 2013}). La formación de callo es estimulada por la acción de hormonas (auxinas y citoquininas), heridas y genes implicados en el crecimiento, desarrollando una masa de células indiferenciadas y subsecuente formación de regeneración de órganos de la planta, ya sea formación de brotes o raíz (Ikeuchi et al., 2013; ^{Lozzi, Abdelwahd, Alami-Halimi, Mentag, & Abousalim, 2019}; ^{Lu, Liu, Lyu, Yuan, & Wu, 2019}). Ikeuchi et al. (2013) mencionan que una proporción intermedia de auxinas y citoquininas estimula la formación de callo, mientras que una proporción mayor de auxinas que citoquininas estimularía la formación de raíces. Esto indicaría que A. pungens presenta naturalmente citoquininas que junto con las auxinas utilizadas (AIB) formaron callo en la mayoría de los acodos, contando además el efecto de la herida realizada en el proceso de elaboración del acodo. La formación de callo en acodos aéreos, en otros casos, puede llegar a cubrir el corte y formar una reconexión con la rama donante retrasando la formación de raíces (^{Sánchez-Urdaneta et al., 2009}). Esto pudo ocurrir también en el presente estudio con A. pungens.

De acuerdo con los resultados, tanto en esquejes y acodos aéreos, A. pungens es una especie que requiere más de una estación para la formación de raíces. Lo anterior hace necesario dejar los acodos aéreos por más de 20 semanas para conseguir formación de raíz que permita la sobrevivencia de la rama después de la separación del arbusto madre, ya que los acodos comenzaron a secarse al mes del corte por no tener raíces suficientemente grandes para mantener a la rama. Cabe resaltar que no se cuenta con estudios sobre la propagación vegetativa de A. pungens, algo común en las especies forestales silvestres, a pesar de que tal forma de reproducción puede ser una alternativa para especies con problemas de propagación por semilla (^{Benítez-Pardo et al., 2002}; ^{Ramos-Palacios et al., 2012}).

Los resultados permiten el entendimiento de A. pungens y el conocimiento para la mejora de la propagación en programas de reforestación y restauración. Aun así, hacen falta más estudios para tener los resultados deseados, sobre todo contemplando la variedad de tamaños en las semillas y su comportamiento en cada región, dada su amplia distribución en el país. La propagación vegetativa de A. pungens debe ser más explorada, siendo este estudio un primer paso y sabiendo que, en algunas zonas, es el principal medio de reproducción. Sería recomendable continuar las investigaciones sobre el cultivo de A. pungens en vivero contemplando emergencia, supervivencia, uso de sustratos y fertilización para completar un esquema de propagación ideal.