Recolecta de material vegetal

El material vegetal fue proporcionado por la Cooperativa Oro Verde del Semidesierto, ubicada en Cuencamé, Durango. Esta cooperativa acopia orégano de la especie L. graveolens proveniente de ocho localidades del municipio. El muestreo se realizó en agosto del 2018. Se recolectaron 2 kg de hojas (material remanente de las hojas sin el aceite) con un tamaño de partícula de malla 60 y contenido de humedad de 8.0 %, así como 5 kg de tallo con un tamaño de partícula de malla 30 y 8.5 % de humedad. El material se almacenó en bolsas plásticas cerradas y se mantuvo en refrigeración a 4 °C hasta su utilización.

Preparación de extractos

La extracción se realizó por el método de maceración y se utilizó etanol acuoso como solvente a concentraciones de 30, 50 y 80 % (ET30, ET50, ET80, respectivamente). Las relaciones masa:solvente evaluadas fueron 1:10, 1:20 y 1:30, para un total de nueve extractos por cada materia prima. Para realizar la extracción, cada tratamiento se maceró a temperatura ambiente (25 °C) con agitación durante 24 h. Transcurrido este tiempo, el extracto se separó por filtración con papel Whatman núm. 4. El material remanente se sometió a una segunda extracción con solvente fresco, bajo las mismas condiciones de la primera etapa. Los extractos de la primera y segunda maceración se combinaron y concentraron en un rotaevaporador a 45 °C aplicando vacío, del cual se obtuvo un extracto acuoso concentrado que se secó por liofilización.

Determinación de los compuestos fenólicos y capacidad antioxidante

El rendimiento en sólidos se evaluó por el método de sólidos totales y se expresó en porcentaje. El cálculo corresponde al cociente entre la masa del extracto crudo (g) y la masa de material utilizado (g), ambos en base seca.

El contenido de fenoles totales se cuantificó por el método de Folin-Ciocalteu, de acuerdo con la metodología reportada por ^{Rosales-Castro, González-Laredo, Rivas-Arreola, y Karchesy (2017}). La curva estándar (y = 0.0012x + 0.0076; R² = 0.9990) se preparó con ácido gálico. Los resultados se expresaron en mg equivalentes de ácido gálico por g de extracto seco (mg EAG∙g^-1). Los flavonoides totales se evaluaron de acuerdo con la metodología descrita por Rosales-Castro et al. (2017). La curva estándar (y = 0.0034x - 0.03; R² = 0.9981) se preparó con catequina (Sigma-Aldrich). Los resultados se expresaron en mg equivalentes de catequina por g de extracto seco (mg EC∙g^-1).

La capacidad antioxidante de los extractos se evaluó a través de la inhibición de radicales libres por tres métodos in vitro: DPPH, ABTS y FRAP. Esta evaluación se realizó en ET30, ET50 y ET80 en un espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV-VIS Hach, DR 5000, Alemania), aunque solo para la relación 1:30 m/v, ya que fue la que presentó mayor concentración de fenoles totales y flavonoides.

El análisis DPPH se realizó con el método reportado por ^{Rosales-Castro, Honorato-Salazar, Reyes-Navarrete, y González-Laredo (2015}) que se basa en la transformación del DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) como radical estable a DPPH reducido. Dicha transformación se mide por el cambio gradual de color (púrpura a amarillo) a una longitud de onda de 515 nm durante 30 min. El cambio de color aumenta gradualmente de acuerdo con el número de electrones aceptados. El radical se utilizó a una concentración de 2.4 mg∙100 mL^-1 disuelto en metanol. Los extractos se analizaron en un rango de 300 a 1 800 mg∙L^-1 para obtener la CE₅₀ que corresponde a la concentración efectiva de extracto para inhibir 50 % del radical.

El radical ABTS (ácido 2,2′-azinobis [3-etilbenzotiazolin]-6-sulfónico) se midió a una longitud de onda de 754 nm, disuelto en etanol a un valor de absorbancia de 0.70 ± 0.1. Los extractos se analizaron a una concentración de 200 mg∙L^-1 y los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición. Se utilizó la metodología reportada por ^{Rosales-Castro et al. (2015}).

El método FRAP o poder antioxidante reductor del hierro se evaluó de acuerdo con la metodología de ^{Rosales-Castro et al. (2015}). Los extractos se disolvieron en etanol a concentración de 200 mg∙L^-1. Se realizó una curva de calibración con trolox y los resultados se expresaron como milimoles equivalentes de trolox (mmol ET).

Comparación cualitativa de los compuestos fenólicos por HPLC-DAD

Esta evaluación consistió en un análisis cromatográfico de los extractos (ET30, ET50, ET80) de hojas y tallos, relación m/v 1:30, con la finalidad de determinar el efecto del solvente sobre la extracción de los compuestos con las tres concentraciones de etanol y compararlos cualitativamente.

El análisis se hizo en un equipo de cromatografía líquida de alta resolución acoplado a un detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD Infinity 1260 Series, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA), de acuerdo con la metodología descrita por ^{Gutiérrez-Macías, Peralta-Cruz, Borja-De la Rosa, y Barragán-Huerta (2016}). Los extractos se utilizaron a concentración de 1 000 mg∙L^-1, volumen de inyección 20 μL, columna C₁₈ (Agilent Technologies) 4.6 x 150 mm, 5 µm, fase móvil de ácido acético al 2.5 % (fase A) y acetonitrilo (fase B) con flujo de 1 mL∙min^-1. Los compuestos fenólicos se monitorearon a 280 nm. Solo se consideraron los compuestos que mostraron mayor absorbancia.

Después de obtener los cromatogramas se efectuó un análisis de presencia (1) y ausencia (0) a los diferentes tiempos de retención (entre 0 y 35 min) en los que los compuestos eluyeron en las seis muestras analizadas. Con la información de presencia/ausencia se elaboró un dendrograma, para analizar el agrupamiento de los compuestos solubilizados al utilizar las tres concentraciones de etanol.

Identificación de los compuestos fenólicos por UPLC-MS

Las muestras ET80 1:30, tanto de hojas como de tallos, se analizaron con la metodología propuesta por ^{Villegas-Novoa et al. (2019}). Los extractos se disolvieron a 1 000 mg∙L^-1 en etanol al 80 %. Se utilizó un sistema UPLC-MS Acquit (espectrometría de masas acoplado a cromatografía líquida de alta resolución) que consta de un inyector automático, bombas y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Xevo TQ-S tándem (Waters Corp., Milford, MA, EUA). Los compuestos fenólicos se separaron en una columna C₁₈ 100 × 2.1 mm, 1.7 µm, empleando fase móvil de ácido fórmico 7.5 mM (fase A) y acetonitrilo (fase B) con flujo de 210 µL∙min^-1. Los compuestos se identificaron mediante la interpretación de sus espectros de masas, a través del arreglo MS/MS y utilizando estándares (Sigma-Aldrich) de varios compuestos fenólicos (ácidos fenólicos y flavonoides) mediante el modo de ionización negativa. La cuantificación se hizo a partir de la curva estándar de cada uno de los compuestos (estándares) y los resultados se reportaron como porcentaje relativo de la respuesta de cada compuesto con respecto a la respuesta total en un cromatograma de UPLC.

Análisis estadístico

El experimento para la evaluación de rendimiento, fenoles totales y flavonoides se condujo en un diseño factorial 3²: dos factores (concentración de etanol y relación masa/volumen) y tres niveles (ET30, ET50, ET80; 1:10, 1:20, 1:30), tanto en hojas como en tallos. Se aplicó un análisis de varianza y una prueba de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05) con el paquete estadístico STATISTICA v.7 (^{StatSoft Inc., 2007}). La comparación cromatográfica se hizo con el programa PAST versión 3.21 (^{Hammer, Harper, & Ryan, 2018}).

Capacidad antioxidante

Con respecto a la capacidad antioxidante en la evaluación con el radical DPPH, los extractos de hojas tuvieron mayor inhibición que los extractos de tallos. La Figura 2a muestra los resultados CE₅₀, que corresponde a la concentración efectiva de extracto para inhibir 50 % del radical; la concentración menor del extracto (mg∙L^-1) indica que la actividad es mayor. La mayor capacidad se obtuvo en las muestras de hojas con ET80 (447 mg∙L^-1 de extracto) y en tallos con ET50 (748 mg∙L^-1 de extracto), aunque sin diferencia estadística (P > 0.05) para tallos con ET80 (750 mg∙L^-1).

Para los ensayos con ABTS (Figura 2b) y FRAP (Figura 2c), los extractos mostraron tendencia similar de capacidad antioxidante en ambas técnicas. En el ensayo ABTS, los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición, por lo que a mayor porcentaje la capacidad inhibitoria es mejor. La mayor inhibición se obtuvo en tallos ET50 con 46 %, seguido por hojas ET80 con 44 %. Para FRAP, los resultados indican que el extracto con la mayor capacidad fue el de hoja ET80 con 346 mmol ET, seguido por el de tallos ET50 con 320 mmol ET. En un estudio sobre la extracción de compuestos fenólicos en residuos de mango, ^{Lim et al. (2019}) reportan que los mejores resultados en los análisis de DPPH y FRAP se obtuvieron con la extracción etanol/agua en proporción 50/50 (v/v).

Figura 2 Capacidad antioxidante de extractos de hoja residual (sin aceite) y tallos de orégano (Lippia graveolens) por las técnicas a) DPPH, expresado como concentración efectiva para inhibir 50 % del radical (CE₅₀), b) ABTS expresada como porcentaje de inhibición y c) FRAP en milimoles equivalentes de trolox (mmol ET) a partir de un extracto etanol acuoso como solvente a concentraciones de 30, 50 y 80 % (ET30, ET50, ET80, respectivamente) con relación masa:solvente de 1/30. 

La correlación entre la concentración de fenoles totales y flavonoides se analizó con respecto a la capacidad antioxidante; la mayor correlación se obtuvo entre fenoles totales y FRAP (R² = 0.87). Los valores obtenidos para las correlaciones con flavonoides fueron bajos: flavonoides y DPPH (R² = 0.62), flavonoides y ABTS (R² = 0.50), flavonoides y FRAP (R² = 0.66). Lo anterior indica que, aunque la concentración de flavonoides tanto en hojas como en tallos sea alta, la estructura química de algunos de estos compuestos no permite que tengan buena capacidad de atrapamiento de radicales libres.

Comparación cualitativa de los compuestos fenólicos por HPLC-DAD

La semejanza de los compuestos extraídos con las concentraciones de etanol ET30, ET50 y ET80, tanto en hojas como en tallos, se muestra en el análisis de conglomerados de la Figura 3. Los resultados mostraron que, en las hojas, los compuestos solubilizados con ET50 son los mismos que se disolvieron en ET80 de forma cualitativa y, en el caso de los tallos, la semejanza entre los solubles en ET50 y ET80 es de 95 %. Para los extractos de tallos ET30, la semejanza con el resto es del 70 %, mientras que en las hojas ET30, la semejanza es menor de 30 %. De esta información se deduce que las concentraciones del solvente ET50 y ET80 no afectaron la solubilidad de los compuestos de forma cualitativa, aunque sí de manera cuantitativa. Los compuestos que se solubilizan con ET30 son diferentes del resto.

Figura 3 Análisis de conglomerados a partir de la presencia (1) y ausencia (0) de compuestos (picos cromatográficos) extraídos con etanol acuoso en concentraciones de 30, 50 y 80 % a diferentes tiempos de retención (entre 0 y 35 min) en hojas sin aceite y tallos de orégano (Lippia graveolens). 

Identificación de los compuestos fenólicos por UPLC-MS

El Cuadro 1 presenta los compuestos identificados en los extractos ET80-1:30 y sus concentraciones en hoja residual y tallos. El extracto de hojas tuvo 14.67 % de ácido cafeico, mientras que en el extracto de tallos este compuesto representó 7.34 %. Para el compuesto ácido 2-hidroxibenzoico, los contenidos fueron 2.01 % en hojas y 2.86 % en tallos. Los flavonoides del extracto de hojas fueron naringenina (25.95 %), taxifolina (17.61 %), eriodictiol (15.13 %), acacetina (10.44 %), luteolina (4.43 %), quercetina 3-O-glicósido (3.59 %), apigenina (1.53 %), floridzina (1.0 %) y quercetina (0.80 %). En el extracto de tallos, los flavonoides identificados fueron naringenina (30.11 %), taxifolina (21.31 %), eriodictiol (20.59 %), luteolina (6.12 %), quercetina 3-O-glicósido (2.82 %), apigenina (2.18 %), quercetina (0.96 %), acacetina (0.94 %) y floridzina (0.9 %).

Los compuestos coinciden con los identificados en hojas sin aceite esencial (^{Arias et al., 2020}), en extractos metanólicos de hojas (^{Gutiérrez-Grijalva et al., 2018}; ^{Pérez-Gutiérrez, 2014}) y en extractos de tallos obtenidos con mezcla de hexano/acetato de etilo/metanol (^{González et al., 2007}). Algunos otros compuestos reportados para L. graveolens no se identificaron en este trabajo, debido a que no se tuvieron los estándares de referencia para su identificación y cuantificación.

El ET80 favoreció la extracción de compuestos fenólicos no flavonoides en hojas y concuerda con los resultados obtenidos en la sección de identificación, ya que la concentración del ácido cafeico es mayor en hojas que en tallos. De la misma forma, el análisis mostró que el ET80 favoreció la extracción de flavonoides en los tallos, ya que la concentración fue mayor que en el extracto de hojas.

Existen varios mecanismos para determinar la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos (^{Apak, Özyürek, Gü clu̧, & Çapanoglŭ, 2016}). Uno de ellos es a través de la eliminación de radicales libres que depende del número de grupos hidroxilo y su posición en la molécula, así como de los grupos sustituyentes, ya sea hidroxilos, metoxilos, glucósidos, entre otros (^{Yi-Zhong, Sun, Xing, Luo, & Cork, 2006}). En los flavonoides, la capacidad de atrapamiento de radicales libres aumenta con el grado creciente de hidroxilación; los flavonoides sin grupos hidroxilo no tienen capacidad de eliminación de radicales (^{Chen et al., 2018}). Los patrones de sustitución en los anillos A y B, así como el doble enlace entre C2-C3 y el grupo 4-oxo en el anillo C están relacionadas con la baja o alta actividad antioxidante de los flavonoides. De forma general, se reporta que la capacidad de atrapamiento de radicales DPPH y ABTS de los grupos de compuestos fenólicos es en la secuencia Flavan-3-ol ˃ flavonoles ˃ chalconas ˃ estilbenos ˃ ácidos fenólicos ˃ flavonas ˃ flavanonas ˃ isoflavonas, con algunas excepciones dentro de cada grupo (Yi-Zhong et al., 2006).

En los extractos de hojas residuales y tallos de orégano, el compuesto mayoritario es la flavanona naringenina, el cual, debido a su estructura química, tiene capacidad baja de atrapamiento de radicales libres, por lo que se sugiere que los flavonoides taxifolina, eriodictiol, quercetina, quercetina-3-O-glucósido, luteolina, apigenina, así como el ácido cafeico sean los que les otorguen la capacidad antioxidante a los extractos ET80 y ET50. Aunque la naringenina no tiene capacidad de atrapamiento de radicales libres, se reporta que, en ensayos biológicos, este flavonoide tiene propiedades antidiabéticas, regula la glucosa y el metabolismo de lípidos (^{Den & Tsiani, 2019}; ^{Ren et al., 2016}), por lo que su actividad biológica es importante. Se ha reportado la actividad antioxidante y propiedades terapéuticas de los flavonoides que el orégano mexicano contiene, los cuales corresponden a los identificados en el presente estudio, así como las propiedades farmacológicas y biológicas de la taxifolina (^{Sunil & Xu, 2019}), eriodictiol (^{Islam, Islam, Rahman, Uddin, & Akanda, 2020}), apigenina y luteolina (^{Liu, Shi, Fu, & Zhao, 2019}). Por lo anterior, la extracción de dichos compuestos, a partir de subproductos como los residuos de orégano puede tener potencial en aplicaciones farmacológicas y como ingredientes nutracéuticos.