Campylobacter fetus subspecie venerealis es el agente causal de la campilobacteriosis genital bovina¹. Los toros pueden ser portadores de la bacteria de manera asintomática en el prepucio durante un tiempo indefinido y transmitir el agente a las hembras durante el apareamiento. Las hembras infectadas pueden desarrollar infertilidad, muerte embrionaria o aborto. El aborto puede ocurrir a cualquier edad gestacional, pero es más común que se lo diagnostique entre el cuarto y el sexto mes de gestación². Entre las lesiones provocadas por C. fetus venerealis se incluyen endometritis, placentitis, serositis fetal, hepatitis y neumonía¹.

El protozoario Neospora caninum es una importante causa de aborto en el ganado de carne y lechero en América del Sur³. Los miembros de la familia Canidae son hospederos definitivos y excretan oocistos en las heces⁴. Los bovinos son hospederos intermedios y se infectan con N. caninum al ingerir oocistos o por transmisión transplacentaria. Los huéspedes definitivos adquieren la infección al ingerir bradizoites enquistados en los tejidos de los huéspedes intermedios. Dependiendo de la edad gestacional en el momento de la infección puede ocurrir la muerte fetal, ya sea por aborto o por momificación. Si se presenta una infección en los primeros 100 días de gestación, las posibilidades de que sobreviva el feto son bajas debido a que hay un desarrollo incompleto de su sistema inmune⁴. El aborto debido a N. caninum suele ocurrir durante el segundo trimestre o el tercero. Si el feto desarrolla una reacción inmune el N. caninum, nace como un ternero seropositivo.

No obstante, ocasionalmente pueden nacer terneros seronegativos de madres seropositivas⁴. Los hallazgos de necropsia en los fetos abortados son escasos; los fetos pueden estar severamente autolíticos o momificados. A nivel macroscópico, la placenta puede mostrar necrosis de los cotiledones sin cambios de la región intercotiledonaria. El corazón y los músculos esqueléticos pueden tener focos grises a blanquecinos, que a nivel microscópico se caracterizan por necrosis e inflamación. Las principales lesiones microscópicas en el feto son encefalitis necrotizante multifocal no supurativa con gliosis, miocarditis y miositis, que son altamente específicas de este protozoario⁴.

Este informe describe un brote de abortos en bovinos en una granja lechera comercial causado por la acción de dos patógenos diferentes. Se subraya la importancia de realizar pruebas diagnósticas múltiples en diversos fetos y estudios serológicos en las vacas.

El brote se presentó en un hato lechero libre de brucelosis con 650 vacas Holstein en un sistema semi-extensivo con periodos de confinamiento de duraciones variables dependiendo de la disponibilidad de la pastura. La granja se localizaba en el departamento de Florida, Uruguay. La producción promedio diaria de leche era de aproximadamente 20 L/vaca. Los partos estaban programados para el otoño y el invierno, y la inseminación artificial se llevó a cabo entre mayo y octubre, seguida de apareamiento natural con toros. La granja afectada era explotada junto con una segunda granja lechera en la que se recibieron para inseminación vacas que habían parido por lo menos dos meses antes. Después de ser inseminadas, estas vacas permanecieron en la granja durante la lactancia. Un total de 45 vacas abortaron durante un periodo de tres semanas en noviembre de 2015. Se realizó la necropsia de cinco fetos (casos 1-5); la edad gestacional se calculó con base en la longitud desde la corona hasta la rabadilla y en otras características macroscópicas de los fetos⁵. No se sometió ninguna placenta a examen en ninguno de los casos. Para el examen histológico, se fijaron tejidos fetales en formalina neutra tamponada al 10 %, incrustados en parafina, seccionados a entre 4 y 6 µm y teñidos con hematoxilina y eosina. Se llevó a cabo el análisis inmunohistoquímico (IHQ) en secciones de cerebro para detectar N. caninum; en secciones de los riñones y el hígado para detectar Leptospira spp., y en el hígado, el corazón y los pulmones para detectar el virus de la diarrea viral bovina (VDVB)^6-8.

Los títulos de los anticuerpos contra Leptospira spp. se determinaron mediante una prueba de microaglutinación (MAT) en muestras de líquido pericárdico/torácico de cinco fetos, con un punto de corte de >1/10. A las muestras de líquido abomasal y del hígado de los cinco fetos abortados se les sembró agar sangre en condiciones microaerofílicas.

La identificación molecular de N. caninum se llevó a cabo a partir de secciones de cerebro fijadas con formalina y embebidas en parafina de los fetos con lesiones cerebrales microscópicas típicas de la neosporosis. Se aisló el ADN utilizando un kit disponible en el mercado (DNeasy Tissue Kit, Grupo QIAGEN, Alemania) según las recomendaciones del fabricante, y la concentración de ADN se midió utilizando un espectrofotómetro de microplacas Epoch (Epoch, Bioteck® Instruments, Inc., Vermont, EEUUA). Se evaluó el ADN de Neospora caninum mediante una PCR anidada dirigido a la región del espaciador transcrito interno uno (ITS1) con cuatro oligonucleótidos, como se describió anteriormente⁹.

La infección con Campylobacter se realizó mediante cultivo bacteriano en agar, inoculando muestras de líquido abomasal fetal, pulmones e hígado de los fetos. Las muestras se incubaron durante 48 h a 37 ºC en una jarra AnaeroJar^® (Oxoid) con un ambiente microaeróbico (de aproximadamente 5-10%O₂, 5-10% CO₂) generado con sobres de CampyGen^® (Oxoid)¹⁰. Se realizó una inmunofluorescencia en muestras de líquido abomasal fetal (20 µl) fijadas en acetona a 20 ^oC durante 30 min, utilizando un antisuero conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) disponible comercialmente contra el Campylobacter fetus (Biotandil, Argentina), con controles positivos y negativos adecuados proporcionados junto con el kit. La incubación se llevó a cabo dentro de una cámara húmeda a 37 ºC durante 3 min, después de lo cual se visualizaron portaobjetos bajo un microscopio AXI0 Lab A.1 con un filtro de FITC y 470 nm de luz UV.

Para la identificación molecular de las cepas aisladas, se extrajo ADN utilizando el kit de extracción de ADN (Gene elute bacterial genomic DNA extraction kit, Sigma Aldrich); posteriormente se realizaron dos protocolos de PCR Multiplex separados para amplificar regiones específicas del genoma de C. fetus que discriminan entre subespecies de C. fetus^11,12. Además, se amplificó y secuenció casi completamente el gen que codifica para el ARNr 16S utilizando los cebadores 27F y 1492R¹³.

Los productos de la PCR fueron purificados y secuenciados en la empresa Macrogen Inc, Seúl, Corea del Sur. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con secuencias de bases de datos públicas utilizando la herramienta “Ribosomal Database Project and BLASTn y el algoritmo BLASTn del National Center for Biotechnology Information^14,15.

Se realizó la prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes para detectar los anticuerpos contra el Neospora caninum en el suero de 27 vacas del hato afectado, en la División General de Laboratorios Veterinarios del Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca del Uruguay, según sus protocolos estándar.

La edad gestacional de los cinco fetos a los que se practicó la necropsia (casos 1-5) fue de aproximadamente 180 días. A nivel macroscópico, el caso 1 presentó epicarditis fibrinosa difusa (Figura 1) y peritonitis. Desde el punto de vista histológico, en este feto se encontró bronconeumonía neutrofílica y epicarditis. Se detectó Campylobacter fetus mediante inmunofluorescencia directa y se lo aisló del líquido abomasal y del pulmón. La identificación de la cepa aislada fue confirmada también mediante PCR, lo que dio lugar a productos de la amplificación de tamaños correspondientes a los descritos para C. fetus subesp. venerealis^11,12. Además, la secuencia genética 16S rRNA de las cepas aisladas era compatible con C. fetus. No se aislaron especies de Campylobacter de las muestras de los casos 2-5.

Figura 1 Caso 1, abortado por Campylobacter fetus subesp. venerealis. El epicardio está cubierto por material fibrinoso moderado a grande junto con líquido serosanguíneo 

No se observaron lesiones macroscópicas significativas en los casos 2 a 5, y no se observaron lesiones microscópicas en los casos 2 a 3. Sin embargo, en los casos 4 y 5 el examen histológico reveló encefalitis necrotizante multifocal no supurativa (Figura 2), miocarditis linfocítica e histiocítica y miositis, y nefritis linfocítica intersticial. Se detectó intralesionalmente la presencia de antígeno de Neospora caninum en el cerebro de estos dos fetos mediante IHQ (Figura 2, detalle). Los títulos de los anticuerpos a N. caninum oscilaron entre 1/200 y 1/3200 en 10 de las 27 vacas examinadas. Además, la PCR del ADN para detectar N. caninum fue positiva en ambos casos. El análisis IHQ para detectar VDVB fue negativo en el hígado, corazón y pulmón en los casos 2, 4 y 5. Por último el análisis IHQ para detectar Leptospira spp. fue negativo en los riñones y el hígado de todos los fetos. No se detectaron títulos de anticuerpos contra Leptospira spp. en ninguno de los cinco fetos. Otros patógenos abortígenos como las especies de Brucella fueron descartados. Su negatividad se basó en el aislamiento negativo del patógeno y la ausencia del patógeno en asociación con las lesiones compatibles.

El neuropilo está afectado por la encefalitis necrotizante multifocal no supurativa. Tinción hematoxilina-eosina.

Detalle. Hay una reacción inmune al antígeno de Neospora caninum en las secciones del cerebro afectadas.

Figura 2 Cerebro fetal del caso 4 abortado por Neospora caninum 

El diagnóstico etiológico del aborto bovino es complejo debido a que pueden intervenir múltiples causas, y la autólisis fetal puede impedir la identificación del agente etiológico. En este brote, la identificación de dos patógenos abortígenos en 3 de los 5 fetos sugiere que se recomienda examinar varios fetos. Si bien se ha reportado coinfección por múltiples abortifacientes^16,17, se ha escrito poco sobre la detección de diferentes patógenos concurrentes en distintos fetos abortados y en los brotes de aborto en las granjas lecheras. Los brotes de abortos pueden ser causados simultáneamente por distintos agentes infecciosos.

Las principales causas identificadas del aborto bovino en el ganado de carne y lechero en Sudamérica son infecciosas^18-22. En un estudio realizado en el Uruguay, la causa más frecuente de aborto bovino identificada en los envíos al laboratorio fue la leptospirosis (41 % de los 241 casos diagnosticados), seguida de la neosporosis (36 %) y la infección con Campylobacter (12 %)²⁰. En Argentina, la leptospirosis fue la tercera causa en frecuencia de detección (7.3 %)²¹, mientras que en el Brasil se la diagnosticó en el 0.6 % de los abortos²². Estas diferencias pueden obedecer a la diversidad en la frecuencia de la leptospirosis en estos países, pero también a las distintas técnicas de laboratorio utilizadas para el diagnóstico y para la interpretación de los resultados. El diagnóstico en el estudio uruguayo se basó en la presencia de títulos altos de anticuerpos en las vacas abortadas (>1/800) y/o en los fetos (>1/10), mientras que en Argentina y en el Brasil, los diagnósticos etiológicos se basaron en la detección de especies de Leptospira mediante PCR, inmunofluorescencia, análisis inmunohistoquímico y/o tinción de Warthin-Starry en muestras fetales^{(19, 22)}. Las pruebas que apuntan a detectar el agente en los fetos abortados son más adecuadas para el diagnóstico confirmatorio de aborto por especies de Leptospira que las pruebas serológicas realizadas en el suero materno de los líquidos fetales.

La evaluación microbiológica y patológica de la placenta en los casos de aborto es clave para incrementar las posibilidades de llegar a un diagnóstico. Para algunas enfermedades, tales como la coxielosis o la clamidiosis, es difícil llegar a un diagnóstico etiológico si no se evalúa la placenta de las vacas abortadas. En este brote no se examinaron las placentas, lo cual puede haber sido una limitación para determinar el diagnóstico en dos de los cinco fetos. Reportes anteriores en EE.UU. demuestran que la placentitis puede ser causa de aborto en ausencia de lesiones fetales²³.

En este informe, el diagnóstico de C. fetus subesp. venerealis se confirmó en uno de estos fetos. En el hato afectado se practicó la inseminación artificial seguida de apareamiento natural. Una encuesta nacional realizada a 340 ganaderos indicó que sólo en un 21 % de las granjas lecheras se utilizó inseminación artificial, y en 29 % se utilizó apareamiento natural después de la inseminación artificial²⁴. La mitad de las granjas utilizó exclusivamente el apareamiento natural²². Estos datos sugieren que la campylobacteriosis bovina diagnosticada por primera vez en vacas lecheras en Uruguay en 1970²⁵ sigue siendo un problema de salud en las granjas lecheras del país. No obstante, el apareamiento natural mantiene el riesgo de campylobacteriosis genital bovina y debe evitarse siempre que sea posible. Se diagnosticó neosporosis en dos fetos y alrededor del 37 % de las vacas examinadas tenían títulos contra N. caninum. Una encuesta serológica realizada en ganado de carne en Uruguay demostró que en 2006 la neosporosis estuvo presente en el 69.2 % de 229 granjas, y que el 14.3 % de las vacas y el 12.9 % de las novillas eran seropositivas²⁶, lo que prueba que N. caninum es endémica en la población bovina uruguaya, incluyendo los bovinos lecheros²⁷.

En este brote se detectaron títulos de anticuerpos contra diferentes serovares de L. interrogans en el suero de 15 de 18 vacas examinadas mediante MAT (no se muestran los datos). Desafortunadamente, se desconoce el estado de vacunación del hato, y no se registró si estas madres habían abortado o no. Los anticuerpos detectados eran contra los serovares Pomona (13 vacas), Hardjo-prajitno (9 vacas), Wolfii (9 vacas) y Hadjo-bovis (siete vacas), con títulos que iban de 1/200 a 1/3200. En ausencia de lesiones fetales compatibles con la leptospirosis en combinación con resultados negativos del análisis IHQ de los líquidos de la cavidad torácica de los fetos, concluimos que ninguno de los cinco fetos examinados estaba infectado con especies de Leptospira.

Los brotes de aborto pueden ser causados por distintos agentes infecciosos en el mismo hato. En esos casos, es necesario realizar necropsias en múltiples fetos utilizando las técnicas específicas para cada agente y, si es posible, evaluar la placenta, además del suero sanguíneo de las madres.

Se agradece a Cecilia Monesiglio, Anderson Saravia, Yisell Perdomo y todos los estudiantes de posgrado de la Plataforma de Salud Animal de INIA. El trabajo fue financiado mediante de la “Agencia Nacional de Investigación e Innovación” (ANII) de Uruguay.